一、缺血再灌注后对小鼠海马神经细胞凋亡的影响（论文文献综述）
李志雄[1]（2021）在《舒血宁注射液在缺血性脑卒中预后的药效评价及作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:缺血性脑卒中是脑卒中的主要类型,可分为急性期、亚急性期和恢复期等阶段,严重危害人类生命健康。目前临床上主要通过重组组织型纤溶酶原激活物（rt PA）静脉溶栓或者血管内血栓切除术治疗缺血性卒中,但二者具有诸如出血性转化、治疗时间窗口狭窄、再灌注损伤、致残率高等缺点。亟需开发出一种更有效的广泛适用于脑卒中不同分期的防治方法。银杏叶是一种历史悠久的中草药,广泛应用于心脑血管疾病防治。所以,本研究在我们实验室前期卒中急性期研究基础上,构建了卒中预后模型,并探讨银杏叶提取物制剂——舒血宁注射液（SXNI）在该动物模型上的药效作用及其关键药理学机制。最后在体外实验上使用海马神经元细胞株HT-22进行氧糖剥夺/复氧（OGD/R）以模拟体内的疾病发生发展过程,让实验结果更可靠。本研究有望为SXNI的临床应用和处方优化提供理论依据。方法:1.利用大脑中动脉闭塞（MCAO）方法构建脑卒中预后模型,即缺血30分钟后实现血流再灌注,造成缺血/再灌注损伤（CIRI）。CIRI鼠被随机分为模型组（Model）、阳性药米诺环素组（Minocycline）和SXNI治疗组,同时设置假手术组（Sham）。再灌注即时起,每天腹腔注射一次药物或生理盐水,持续到第28天。通过脑水肿情况、血脑屏障渗漏、脑梗死体积、水迷宫、避暗实验、神经功能缺损评分、自动步态分析来评价SXNI的药效作用。2.选取SXNI组和Model组小鼠的脑组织进行转录组测序（RNA-seq）,以获取差异表达基因（DEGs）,将log2Fold Change≥1和P≤0.05的DEGs进行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）核心分析,以得到SXNI对卒中预后作用的关键机制和关键靶标。通过实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、苏木精伊红（H&E）与尼氏（NISSL）染色、免疫印迹法（WB）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光（IF）对IPA的结果进行实验验证。3.在体外,先鉴定购买的HT-22细胞,然后通过CCK8测定该细胞的半数抑制浓度(IC50)。对HT-22细胞进行氧糖剥夺4小时,复氧不同时间（12、24、36和48小时）,以选定合适的可用于模拟体内CIRI后脑卒中预后的时间点。对选中的OGD/R时间点,在复氧时加入SXNI,用免疫细胞化学方法（ICC）检测关键靶蛋白的表达。同时,对细胞的凋亡情况及其相关因子的m RNA和蛋白表达水平进行了探究。结果:1.在卒中后第7天的检测发现Model组小鼠具有显着的脑梗死、脑水肿和血脑屏障渗漏,第28天患侧发生明显的脑萎缩,而Minocycline和SXNI给药能显着改善这些组织损伤。随即连续4周的记录发现,Minocycline和SXNI能在不同时间点不同程度地改善CIRI小鼠的被迫游泳和躲避暗室的潜伏期或犯错次数,而且能够减轻神经功能缺损严重程度和支撑距离、平均压力、爪印面积、步幅长度等步态损伤程度。2.在对Model和SXNI组小鼠脑组织的转录组测序中,得到了565个变化倍数对数≥1,P值≤0.05的DEGs,包含221个上调和344个下调的基因。对这565个DEGs进行IPA核心分析,得到排名前20的信号通路,其中与脑部疾病最相关的是第3条神经营养蛋白-肌球蛋白受体激酶（Neurotrophin/Trk Signaling）通路。同理在排名前20的生物学功能中,排名第5的是神经系统疾病（Neurological Disease）。对与Neurotrophin/Trk Signaling和Neurological Disease密切相关的DEGs进行IPA的蛋白-蛋白互作（PPI）分析交叠得到15个关键基因。它们分别是Bdnf、Mapk1（Erk）、Map2k3（Mek3）、C-fos、Creb1、Map2k7、Map3k5、Mapk8（Jnk1）、Ngfr p75、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2（Trk B）、Pik3r1、Spry2、Akt1。RT-PCR结果证实了3 m L/kg的SXNI可以显着提高脑组织中Bdnf、Mapk1、Mek3、Creb1、Ntrk1、Trk B、Shh和Vegfa的m RNA表达水平,而降低C-fos、Map2k7、Jnk1、Pik3r1、Csf3和Gfap的m RNA表达水平。H&E和NISSL染色发现SXNI可以改善海马CA3区损伤和神经元细胞凋亡。WB结果表明SXNI可以显着提高卒中后BDNF、Trk B和Mek3的蛋白表达,而降低Jnk1蛋白表达。ELISA结果表明SXNI可以显着提高卒中后Creb和p-Erk蛋白水平的表达。IF结果表明SXNI可以显着提高BDNF和Trk B蛋白在海马CA3区的表达水平。3.使用神经元细胞的标记蛋白Tuj1和NeuN对HT-22进行的免疫荧光染色发现该细胞株100%表达这两个标记蛋白,表明该株神经元细胞较纯。CCK8实验发现SXNI对HT-22的IC50=496.3μg/m L,50μg/m L和200μg/m L被选为HT-22细胞的给药浓度。通过核计数方式发现氧糖剥夺4小时,复氧24小时和36小时对细胞的损伤程度适中,为了更好地与体内的卒中长期的预后对应,最终选择OGD/R 4h/36h进行后续研究。在对Neurotrophin/Trk Signaling通路中最关键的一对配体蛋白BDNF和Trk B的免疫荧光共染中发现,OGD/R组HT-22细胞的BDNF和Trk B蛋白表达显着降低,虽然50μg/m L的SXNI不能显着提高BDNF的表达,但200μg/m L的SXNI却能起到显着上调该蛋白的作用。在Trk B上,与OGD/R组相比,50μg/m L和200μg/m L的SXNI都能显着提高Trk B蛋白的表达。200μg/m L的SXNI可以调节OGD/R后的凋亡分子Bax/Bcl-2和Caspase-3的表达。结论:1.在卒中后第7天,舒血宁注射液可以有效改善脑梗死体积、脑水肿和血脑屏障渗漏。在卒中后第28天,舒血宁注射液可以减少脑萎缩体积、减轻认知功能障碍和运动缺陷。2.揭示并验证了BDNF介导的神经营养蛋白-肌球蛋白受体激酶通路是舒血宁注射液促进卒中后小鼠认知功能障碍和运动缺陷恢复的关键信号通路。
陈野[2]（2021）在《H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用》文中研究指明背景中风是目前最常见的死亡原因之一,也是在全世界范围内持续性和获得性残疾的主要原因,随着人口变化,发病率进一步增加,对人们生活的质量带来巨大负担。中风分为出血性中风和缺血性中风,后者更常见,当前治疗的重点是通过静脉溶栓和血管内血栓切除术进行快速再灌注,但再灌注的同时也会损害大脑组织,因此对中风可用的治疗方法极为有限,研究预防策略正朝着卒中管理的前沿发展,一些新的进展为神经保护带来了新的希望。Ras同源家族成员A（Rho A）,是一种分布广泛的胞质蛋白,属于小GTP酶家族,鸟苷三磷酸水解酶（Rho GTPases）构成了相当普遍表达的胞质分子开关,控制了一系列下游效应子的活性,Rho依赖性卷曲螺旋激酶（ROCK）是Rho A最直接、最主要的效应分子,有ROCK1和ROCK2两种亚型。缺血性脑损伤可诱导Rho A激活和ROCK2表达的显着上调,越来越多的证据表明,Rho A/ROCK通路参与了中枢神经系统一些疾病的病理过程。Rho A的磷酸化是导致其功能发生改变和调节其活性的主要方式之一,Rho A在Ser188位点磷酸化能够抑制Rho A激活。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是一种普遍存在的第二信使分子,起神经调节剂的作用,在许多哺乳动物器官和系统中均具有重要功能,参与大脑的生理和病理机制。内源性H2S合成的酶主要包含胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚-β-合酶（L-cystathionine-?-synthetase,CBS）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）。我们前期研究证明了H2S可促进大鼠脑血管平滑肌细胞中KCa通道的开放,CSE产生的H2S对小鼠脑缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤具有保护作用,但其作用的分子机制尚不明确。前期研究者报道脑内皮/神经血管单位（Neurovascular unit,NVU）存在重要作用,脑血管的自动调节对于保护神经细胞免受缺血性损伤非常重要,缺血性脑组织的重塑涉及神经元和微血管细胞之间的相互作用,对神经血管单位缺血性死亡过程涉及的机制有待深入的了解。基于以上的研究背景,我们做了以下几个方面研究:1.构建并表达Glutathione S-transferase（GST）标签的Rho A野生型(GST-Rho Awild)和Rho A Ser188位点突变型(GST-Rho AS188A)蛋白,观察外源性H2S（Sodium hydrosulfide,Na HS）对其体外磷酸化的影响。2.探讨H2S抑制Rho A/ROCK通路的靶点和机制,并研究H2S促进Rho A Ser188磷酸化对海马神经元缺氧复氧（Hypoxia-Reoxygenation,H/R）损伤和大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。目的1.观察H2S对Rho A的Ser188位点磷酸化的调节;2.探讨H2S对海马神经元Rho A Ser188位点的作用及其潜在的H/R损伤保护机制;3.探讨Rho A Ser188位点在H2S对大鼠缺血性脑损伤保护的影响。方法1.构建Rho Awild-p GEX-6p-1和Rho A S188A-p GEX-6p-1重组原核质粒,诱导表达并纯化GST-Rho Awild和GST-Rho AS188A蛋白,在进行体外磷酸化测定。2.构建Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1重组真核质粒,再进行大鼠原代海马神经细胞（Hippocampal nerve cells,HNCs）培养与鉴定,并将重组质粒通过电转染到HNCs中,给与不同浓度的外源性H2S（Na HS）后western blot测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,酶联免疫实验（ELISA）法测定Rho A和ROCK2活性。3.全细胞膜片钳记录Na HS对转染重组质粒后的神经细胞大电导钙激活钾通道（BKCa）电流的影响。4.建立H/R损伤模型,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）检测转染重组质粒后的神经细胞活力变化,乳酸脱氢酶（LDH）,神经特异性烯醇化酶（NSE）释放变化评估其损伤。5.原代大鼠脑血管内皮细胞（ECs）培养与鉴定,CSE-/-小鼠和3-MST-/-大鼠的原代内皮细胞与神经细胞共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达水平,测定Rho A和ROCK2活性,同时测定两种内皮细胞释放的H2S含量。6.分别将Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒转染到HNCs,与CSE-/-ECs进行共培养,加入乙酰胆碱（ACh）刺激内皮细胞释放H2S,并进行H/R损伤造模。测定Rho A Ser188磷酸化蛋白及其膜质蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及细胞活力、培养上清LDH和NSE的变化。7.Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察神经细胞核损伤情况,Annexin V/PI染色通过流式细胞仪检测凋亡细胞。8.Ca2+成像系统荧光显微镜（Olympus IX73）检测神经细胞内Ca2+含量并获得细胞内Ca2+信号的荧光图像。9.脑立体定位转染Rho Awild-p EGFP-N1和Rho AS188A-p EGFP-N1真核质粒到大鼠海马区域,通过western blot检测Rho Awild和Rho AS188A蛋白表达,冰冻切片在荧光显微镜下观察转染效果。10.双侧颈总动脉结扎2VO对转染成功的大鼠建立脑I/R模型,激光散斑成像技术（Laser speckle imaging,LSI）检测血流变化,观察造模成功与否。缺血2h再灌注24h后,采用苏木素-伊红（HE）染色观察海马区域损伤程度,TUNEL检测海马神经细胞凋亡情况,western blot检测海马组织Rho A Ser188磷酸化蛋白和ROCK2蛋白表达,测定Rho A和ROCK2活性,以及血清LDH,NSE的变化。结果1.放射自显影结果显示,在PKG1存在下,H2S供体Na HS（100μmol/L）显着促进了GST-Rho Awild蛋白的磷酸化,但是GST-Rho AS188A蛋白并没有发生磷酸化。这表明Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.H2S（Na HS和内皮源性CSE产生）可促进空质粒或GFP-Rho Awild或GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中Rho A的磷酸化,以及GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中GFP-Rho Awild的磷酸化。与对照组相比,p-Rho A/Rho A比值或p-GFP-Rho Awild/GFP-Rho Awild比值明显增加。但对GFP-Rho AS188A的磷酸化没有影响,GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中的p-GFP-Rho AS188A/GFP-Rho AS188A比值与对照组相比没有明显变化。这些结果表明,H2S可以诱导大鼠海马神经元中的Rho A磷酸化,并且这种磷酸化由Rho A Ser188介导。3.H2S能够使Rho A和GFP-Rho Awild在细胞膜中的含量显着减少,在胞质中的表达增高,但对GFP-Rho AS188A在细胞膜和细胞质中的分布没有明显影响。这些结果表明,Ser188是H2S引起神经元中Rho A从细胞膜向细胞质内易位的必需条件,同时可以通过Ser188抑制Rho A活性。4.Na HS对转染GFP-Rho AS188A质粒的神经细胞BKCa通道电流的增加低于转染空质粒和GFP-Rho Awild质粒组且具有显着性差异（30 m V-70 m V）这些结果表明,Na HS对BKCa通道电流的增加受到Rho A Ser188的调控。5.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马神经元中,H2S可显着抑制ROCK2蛋白的表达及其活性,但在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,抑制作用减弱,表明Rho A Ser188与H2S抑制神经元中ROCK2蛋白表达及其活性有关。6.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的神经元中,H2S显着抑制细胞活力的降低以及LDH和NSE活性的增加。然而,在GFP-Rho AS188A质粒转染的神经元中,H2S的这些作用显着降低。这些结果表明,Rho A Ser188介导了H2S对神经细胞H/R损伤的保护作用。7.在空质粒或GFP-Rho Awild质粒或GFP-Rho AS188A质粒转染的CSE-/-EC共培养神经元中,H/R损伤诱导神经细胞凋亡和细胞内游离Ca2+荧光强度显着增加。在空质粒或GFP-Rho Awild质粒共培养的神经元中,CSE+/+EC可以明显降低H/R损伤诱导神经细胞凋亡的增加和细胞内游离Ca2+荧光强度,但对转染GFP-Rho AS188A质粒共培养的神经元没有影响。这些结果表明,内皮CSE产生的H2S可以通过抑制细胞内游离Ca2+的增加来保护神经元免受H/R损伤,并且该作用是由Rho A Ser188介导的。8.动物体内实验中,在空质粒或GFP-Rho Awild质粒转染的大鼠海马中,Na HS能够促进Rho A的磷酸化,抑制Rho A活性,同时降低ROCK2的表达和活性,减轻大鼠脑I/R损伤诱导的血清LDH和NSE的增高,以及海马组织中神经细胞损伤和凋亡。但对转染GFP-Rho AS188A质粒的海马组织中这些作用显着降低。这些结果表明,Na HS减轻大鼠脑I/R损伤且与Rho A Ser188有关。结论1.Na HS可以通过Ser188位点促进Rho A的磷酸化。2.Na HS可能通过Rho A Ser188增加大鼠海马神经细胞中BKCa通道电流。3.内外源性H2S通过促进大鼠海马神经细胞Rho A Ser188磷酸化来保护海马神经元免受H/R损伤。4.Rho A Ser188介导了H2S对大鼠脑I/R损伤的保护作用。
谢伟明[3]（2021）在《RhoA激酶2的硫巯基化修饰在外源性及内皮源性硫化氢抗大鼠神经细胞缺氧性损伤中的作用》文中研究说明背景:脑缺血再灌注损伤在临床上具有高致残率、高致死率的特点。硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）在机体内是一种重要的气体信号分子,参与多种生理及病理过程,具有抗神经细胞凋亡、抗炎症反应、抗氧化应激等效应。最新的研究表明,H2S可将靶向蛋白质的半胱氨酸残基进行硫巯基化修饰（S-sulfhydration）,使靶蛋白的空间构像发生改变,从而达到调控蛋白质活性和功能的目的。RhoA及其下游效应分子Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho associated coiledcoil protein kinase,ROCK）与细胞的增殖、运动、凋亡和基因表达等有关,在生命活动中具有重要意义。研究发现,Rho/ROCK2信号通路参与了脑缺血再灌注损伤,ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,有ROCK1和ROCK2两种亚型,ROCK2主要表达在大脑、心脏和肌肉中。有研究表明ROCK2激活促进缺血性神经元损伤,而抑制ROCK2活性或者降低ROCK2蛋白表达,可减轻缺血再灌注后的神经元损伤。鉴于ROCK2分子结构中的半胱氨酸富集的锌指样结构域（cysteine-rich zine finger-like motifdomain,CRD）中富含半胱氨酸残基,本研究拟探讨外源性及内皮源性H2S对大鼠神经细胞缺氧复氧损伤保护作用的ROCK2硫巯基化修饰机制,以期为脑缺血引起的相关疾病治疗提供新思路和方法。目的:1.研究H2S对神经细胞中ROCK2有无硫巯基化修饰作用。2.研究外源性及内皮源性H2S保护神经细胞H/R损伤与硫巯基化修饰的关系。方法:1.研究外源性H2S对大鼠海马神经细胞ROCK2硫巯基化及其活性的影响,使用Na HS作为外源性H2S供体。1.1原代培养大鼠海马神经细胞,鉴定后分为四组,（1）Control组;（2）Na HS(50μmol·L-1)组;（3）Na HS(100μmol·L-1)组;（4）Na HS(200μmol·L-1)组。1.2采用改良生物素转换法纯化共培养体系神经细胞中硫巯基化蛋白,Western blot法检测ROCK2蛋白表达和硫巯基化修饰的ROCK2（SSH-ROCK2）蛋白表达,试剂盒检测ROCK2和硫巯基化修饰的ROCK2活性。2.研究内皮源性H2S对大鼠海马神经细胞ROCK2硫巯基化及其活性的影响,原代培养CSE基因敲除及野生型小鼠脑血管内皮细胞（EC）、大鼠海马神经细胞（NC）,鉴定后采用Transwell共培养系统将两种细胞进行共培养。加入乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）、2-甲氧基-N-乙酰乙酰基苯胺（o-Acetoacetaniside,AOAA）和L-天冬氨酸（L-aspartic acid,L-Asp）。2.1两种细胞共培养后分为两组,（1）NC+ECCSE-WT组;（2）NC+ECCSE-KO组（各组均加入ACh、AOAA、L-Asp）。采用改良生物素转换法纯化共培养体系神经细胞中硫巯基化蛋白,Western blot法检测ROCK2蛋白表达和硫巯基化修饰的ROCK2蛋白表达,试剂盒检测ROCK2和硫巯基化修饰的ROCK2活性,亚甲基蓝法检测细胞H2S含量。3.硫巯基化修饰对Na HS保护大鼠海马神经细胞H/R损伤的影响3.1原代培养大鼠海马神经细胞,构建细胞缺氧复氧模型后分为七组,分别是:（1）Control组;（2）H/R组;（3）Na HS(50μmol·L-1)组;（4）Na HS(100μmol·L-1)组;（5）Na HS(200μmol·L-1)组;（6）抑制剂DTT(50μmol·L-1)组;（7）Na HS(200μmol·L-1)+DTT组。3.2.缺氧4 h/复氧12 h造模后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,试剂盒检测培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）活性和神经特异性烯醇化酶（NSE）活性,流式细胞术检测细胞凋亡。4.研究硫巯基化修饰对内皮源性H2S保护海马神经细胞H/R损伤的影响4.1构建细胞H/R模型后实验分为五组,分别是:（1）Control组;（2）H/R组;（3）NC+ECCSE-WT组;（4）NC+ECCSE-KO组;（5）抑制剂DTT(50μmol·L-1)组;（6）NC+ECCSE-WT+DTT组。（各组均加入ACh、AOAA、L-Asp）4.2缺氧4 h/复氧12 h造模后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,试剂盒检测培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）活性和神经特异性烯醇化酶（NSE）活性,流式细胞术检测细胞凋亡。结果:1.外源性H2S对大鼠海马神经细胞ROCK2硫巯基化及其活性的影响与NS对照组相比,Na HS(100、200μmol·L-1)可以显着降低大鼠海马神经细胞中ROCK2蛋白的表达（P<0.01）;Na HS(200μmol·L-1)可以显着降低海马神经细胞中ROCK2活性（与NS对照组相比,P<0.01）。经过生物素化处理得到各组硫巯基化修饰蛋白,以硫巯基化修饰ROCK2蛋白量和总ROCK2蛋白量二者比值来定量分析Na HS对硫巯基化修饰ROCK2蛋白的影响,与NS对照组相比,Na HS(100、200μmol·L-1)可显着提高海马神经元中SSH-ROCK2蛋白的含量（P<0.01）。测定对照组总ROCK2蛋白和Na HS处理组的硫巯基化ROCK2蛋白活性,为了便于比较,采用Western blot方法分别测定了对照组总蛋白中的总ROCK2蛋白含量和Na HS处理组中硫巯基化蛋白含量,调整对照组样品中总ROCK2蛋白含量与Na HS处理组的硫巯基化ROCK2蛋白含量一致后,进行ROCK2蛋白活性测定。结果表明Na HS(200 umol·L-1)处理组细胞中的SSH-ROCK2活性明显低于对照组细胞中的ROCK2活性,提示ROCK2硫巯基化修饰可明显降低其活性。2.内皮源性H2S对大鼠海马神经细胞ROCK2硫巯基化及其活性的影响与神经细胞与野生型小鼠内皮细胞共培养组(NC+ECCSE-WT)相比,神经细胞与CSE基因敲除小鼠内皮细胞共培养组(NC+ECCSE-KO)可以显着降低大鼠海马神经细胞中ROCK2蛋白的表达（P<0.01）;NC+ECCSE-KO共培养组可以显着增高海马神经细胞中ROCK2活性以及H2S含量(与NC+ECCSE-WT共培养组相比,P<0.01);经过生物素化处理得到各组硫巯基化修饰蛋白,与NC+ECCSE-WT相比,NC+ECCSE-KO可显着降低原代培养的大鼠海马神经元中SSH-ROCK2蛋白的含量（P<0.01）;测定对照组总ROCK2蛋白和NC+ECCSE-WT组的SSH-ROCK2蛋白活性,为了便于比较,采用Western blot方法分别测定了对照组总蛋白中的总ROCK2蛋白含量和NC+ECCSE-WT共培养组中硫巯基化蛋白含量后,调整对照组样品中总ROCK2蛋白含量与NC+ECCSE-WT共培养组的硫巯基化ROCK2蛋白含量一致后,进行ROCK2蛋白活性的测定。结果表明NC+ECCSE-WT组细胞中的SSH-ROCK2活性明显低于对照组细胞中的ROCK2活性,提示ROCK2硫巯基化修饰可明显降低其活性。3.硫巯基化修饰对Na HS保护大鼠海马神经细胞H/R损伤的影响与正常对照组相比,H/R模型组细胞活力显着降低,细胞上清中LDH和NSE活性有明显提高,并且细胞凋亡率增高（P<0.01）。而给予外源性H2S供体Na HS(100、200μmol·L-1)可显着提高H/R损伤导致的细胞活力降低以及可显着减少H/R导致的神经细胞LDH和NSE的漏出,并且显着降低H/R损伤导致的细胞凋亡率增高（P<0.01,与模型组相比）;Na HS(50μmol·L-1)也可明显降低神经细胞H/R后培养上清中NSE活性。硫巯基化修饰阻断药DTT单独应用对H/R损伤诱导的大鼠海马神经元细胞活力降低和细胞上清液中LDH和NSE活性增高以及细胞凋亡率无明显的影响,但是联合应用DTT显着阻断Na HS(200μmol·L-1)对H/R损伤诱导的细胞活力降低和上清液中LDH和NSE活性增高的抑制作用,以及显着降低Na HS(200μmol·L-1)对H/R损伤诱导的大鼠海马神经细胞凋亡率增高的抑制作用(与200μmol·L-1Na HS组相比,P<0.01)。4.研究硫巯基化修饰对内皮源性H2S保护海马神经细胞H/R损伤的影响与对照组相比,H/R模型组细胞活力显着降低,上清中LDH、NSE活性明显增强,并且细胞凋亡率增高（P<0.01）;而给予内皮源性H2S供体,即神经细胞和野生型小鼠内皮细胞共培养组(NC+ECCSE-WT)和神经细胞和CSE基因敲除小鼠内皮细胞共培养组(NC+ECCSE-KO)可显着提高H/R损伤导致的细胞活力降低,减少H/R损伤导致的细胞上清中LDH和NSE的漏出,并且显着降低H/R损伤导致的细胞凋亡率增高（P<0.01,与模型组相比）;硫巯基化修饰阻断药DTT单独应用对H/R损伤诱导的大鼠海马神经元细胞活力降低以及对LDH和NSE活性增加以及细胞凋亡率无明显的影响,但是联合应用时DTT显着阻断NC+ECCSE-WT组对H/R损伤诱导的细胞活力降低,LDH和NSE活性增加以及大鼠海马神经细胞凋亡率增高的抑制作用(与NC+ECCSE-WT组相比,P<0.01)。结论:1.外源性及内皮源性H2S可以硫巯基化修饰大鼠海马神经细胞中的ROCK2。2.外源性及内皮源性H2S对大鼠海马神经元H/R损伤有明显的保护作用,其机制与硫巯基化修饰致ROCK2活性降低及ROCK2蛋白表达减少有关。
张阳[4]（2021）在《CSE源性H2S调控RhoA/ROCK通路对小鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞功能和神经损伤的作用研究》文中研究表明背景脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤主要是由脑组织长时间缺血,缺血部位恢复血流灌注后,组织损伤迅速加剧造成的。脑缺血及I/R损伤的病理生理机制极其复杂,主要包括损伤后的氧化应激反应、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞凋亡、线粒体功能障碍、炎症反应等多个环节,其中炎症反应在脑I/R损伤进展机制中扮演着重要的角色。星形胶质细胞是脑内含量最丰富且分布广泛的一种细胞,在神经元的发育和正常功能,以及脑I/R损伤中发挥着重要作用。在脑缺血及再灌注发生后,炎症反应会促使星形胶质细胞反应性增生并形成胶质瘢痕。胶质瘢痕的形成阻碍了损伤区域新的神经环路的建立,影响脑缺血后期神经功能的恢复。调节星形胶质细胞功能是治疗缺血性脑损伤和促进神经修复的重要新方向。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）是体内气体信号分子,主要是由胱硫醚-γ-裂解酶（L-cystathionine-γ-lyase,CSE）,胱硫醚β合成酶（L-cystathionine-?-synthetase,C BS）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）催化生成。脑血管内皮细胞CSE源性H2S通过抑制RhoA/ROCK通路发挥抗脑缺血再灌注损伤的血管保护作用。但是内皮细胞CSE源性H2S对脑缺血再灌注后星形胶质细胞反应性增生和神经功能损伤的保护作用未见相关报道。因此,本课题通过建立CSE基因敲除小鼠脑缺血再灌注损伤模型和星形胶质细胞低氧培养模型,观察CSE源性H2S对星形胶质细胞反应性增生和神经功能损伤的作用,并探讨可能的作用机制。实验目的:1.探讨脑血管内皮CSE源性H2S对小鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞反应性增生和神经功能损伤的保护作用及其与RhoA/ROCK通路的关系2.研究ROCK抑制剂法舒地尔（Fasudil）对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用3.细胞水平探讨H2S对星形胶质细胞低氧损伤的保护作用及其RhoA/ROCK抑制机制实验方法:1.采用双侧颈总动脉（Common carotid artery,CCA）结扎法构建小鼠脑缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）模型,分别于缺血前,缺血20 min后,再灌注20 min后采用激光散斑成像技术（laser speckle imaging,LSI）监测脑血流量（Cerebral blood flow,CBF）变化。1.1实验分组:野生型C57BL/6（wild type,WT）和CSE基因敲除（knock out,KO）小鼠随机分成6组,每组8只,WT小鼠:假手术组、I/R组、I/R+Na HS（4.8mg/kg）组;CSE KO小鼠:假手术组、I/R组、I/R+Na HS（4.8 mg/kg）组。1.2实验分组:野生型C57BL/6小鼠随机分成4组:假手术组、I/R组、I/R+Fasudil（10 mg/kg）组、正常+Fasudil（10 mg/kg）组,每组8只。1.3通过双侧颈总动脉结扎法制造小鼠脑缺血/再灌注模型,结扎缺血1小时后恢复血液再灌注30天。1.4旷场实验检测小鼠运动和探究行为。1.5Morris水迷宫实验（MWM）测试小鼠空间学习和记忆能力。1.6采用HE染色法观察小鼠皮层和海马CA1和CA3区神经元病理形态学变化情况。1.7Western Blot检测ROCK2,RhoA,GFAP和MBP的表达。1.8免疫荧光双标法检测Brd U/GFAP共表达。2.构建星形胶质细胞（RA）低氧模型。2.1实验分组:将细胞分为正常组、Model组、Model+Na HS（50μmol/L）组、Model+Na HS（100μmol/L）组、Model+Na HS（200μmol/L）组、Model+Na HS（50μmol/L）+Fasudil（5μmol/L）组、Model+Fasudil（5μmol/L）组。2.2除正常组细胞外,其余细胞低氧培养（94%N2-5%CO2-1%Q2）48 h。2.3 cck-8试剂盒检测细胞活力。2.4使用试剂盒检测上清中乳酸脱氢酶（LDH）含量。2.5用钙离子荧光指示剂Fluo-8检测细胞内Ca2+浓度的变化。2.6 Annexin V-FITC/PI试剂盒检测星形胶质细胞凋亡情况。2.7 Western Blot检测细胞GFAP,RhoA,ROCK1和ROCK2蛋白的表达。结果:1.脑血流检测结果显示:与脑缺血造模前相比,双侧颈总动脉结扎后,小鼠脑部血流量显着下降,表明脑缺血造模成功,并且在松开结扎后,恢复脑部血流再灌注。2.在CSE基因敲除C57BL/6小鼠中,与KO小鼠假手术组相比,I/R可导致KO小鼠的运动探索和学习记忆能力显着下降,且下降水平较WT小鼠脑I/R后更明显;与CSE KO小鼠I/R组比较,给予Na HS治疗后CSE KO小鼠的运动探索和学习记忆能力明显改善。3.在CSE基因敲除C57BL/6小鼠中,与KO小鼠假手术组相比,I/R组KO小鼠的脑组织海马区有明显的病理性损伤,大量细胞出现了核仁不清晰、核固缩、核裂变等坏死现象,且细胞损伤程度较WT小鼠脑I/R组更明显;而与脑I/R组小鼠比较,4.8 mg/kg Na HS治疗CSE KO小鼠的脑组织病理损伤明显改善,差异有统计学意义。4.在CSE基因敲除C57BL/6小鼠中,与KO小鼠假手术组或WT小鼠脑I/R组相比,CSE KO小鼠脑I/R组RhoA,GFAP和ROCK2蛋白表达明显升高,MBP蛋白表达明显降低。而与缺血组KO小鼠比较,给予4.8 mg/kg Na HS治疗能明显抑制上述蛋白表达水平的变化,差异有统计学意义。5.在野生型C57BL/6小鼠中,与假手术组相比,脑I/R组小鼠的运动探索和学习记忆能力显着下降,脑组织海马区有明显的病理损伤,同时GFAP和ROCK2蛋白表达明显升高,MBP蛋白表达明显降低。与脑I/R组小鼠比较,给予10 mg/kg ROCK抑制剂Fasudil治疗后小鼠的运动能力、肢体协调能力以及脑组织海马区的病理损伤明显改善,同时GFAP和ROCK2蛋白表达明显降低,MBP蛋白表达明显升高,差异有统计学意义。6.荧光双标实验结果表明脑I/R组小鼠海马组织中Brd U与GFAP细胞共定位的细胞数量较假手术组显着增加,同时脑缺血后给予Na HS和Fasudil治疗后小鼠海马组织中Brd U和GFAP阳性细胞明显减少。7.在星形胶质细胞低氧培养实验中,和正常对照组相比,低氧模型组细胞活力显着下降,凋亡细胞增多,LDH释放增加,细胞内Ca2+荧光强度明显增高,RhoA,ROCK1,ROCK2和GFAP蛋白表达量明显增加。与低氧模型组相比,给予100μmol/L、200μmol/L Na HS和5μmol/L Fasudil均明显减轻细胞损伤,抑制细胞凋亡和LDH漏出,降低细胞内Ca2+荧光强度,以及下调RhoA和ROCK蛋白的表达。结论:1.CSE源性H2S能显着改善小鼠脑缺血60 min再灌注30天后的神经元损伤,抑制星形胶质细胞的反应性增殖,对小鼠脑I/R诱导的神经元迟发性功能障碍具有明显的保护作用,其机制与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。2.H2S通过抑制RhoA/ROCK通路抗星形胶质细胞的低氧损伤,并抑制其反应性增生。
陆件[5]（2021）在《右美托咪定对窒息大鼠心肺复苏后神经细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究》文中指出目的:观察右美托咪定（dexmedetomidine,Dex）对窒息心脏骤停（cardiac arrest,CA）大鼠自主循环恢复（return of spontaneous circulation,ROSC）后体温及其神经功能的影响,并在ROSC后12 h和24 h后观察脑皮质和海马神经细胞形态学和相关生物学分子的表达变化,探讨Dex对心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation,CPR）后大鼠神经细胞凋亡和自噬的影响及其作用机制。方法:健康雄性成年SD大鼠204只,随机分为四组,空白对照组（BC）、常规复苏组（N）、右美托咪定复苏组（D）、右美托咪定+拮抗剂复苏组（DT）,除BC组6只大鼠外,其余三组均66只。除BC组外,其余三组根据观察时间点的不同在ROSC后再随机分二亚组,即ROSC后12 h和24 h组,每个亚组的样本量以最终存活到观察时间点的大鼠数量决定。建立窒息大鼠心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation,CPR）模型,N组在CPR时使用常规给药方法（静脉注射肾上腺素和碳酸氢钠）复苏,D组于复苏前在使用常规复苏组药物的基础上腹腔注射Dex,DT组于复苏前在使用常规复苏组药物的基础上腹腔注射Dex和其拮抗剂育亨宾。在ROSC后,各复苏组均在恒温25℃条件下观察大鼠的体温变化。到达观察时间点（ROSC后12或24 h）时对大鼠进行神经功能缺损评分（neurological deficit score,NDS）。评分后迅速处死大鼠断头取脑获取脑海马和皮质组织,对海马和脑皮质组织进行病理和电镜观察。对脑皮质进行单细胞悬液制作,使用流式细胞（flow cytometer,FCM）技术检测神经细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。使用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）技术检测海马神经细胞caspase-3表达的变化。利用蛋白免疫印迹（Western-Blotting）技术检测海马神经细胞热休克蛋白70（HSP70）、Bcl-2、Bax以及自噬相关蛋白Beclin1表达的变化。结果:复苏后大鼠在25℃恒温环境下,Dex干预后的D组大鼠体温与N组比较有显着性降低（P<0.05）,使用了Dex拮抗剂育亨宾后DT组大鼠的体温与N组无显着性差异（P>0.05）;常规复苏后的N组大鼠NDS与BC组比较有显着性降低（P<0.05）,Dex干预后的D组大鼠NDS与N组比较有显着性升高（P<0.05）,而阻断了Dex作用后的DT组大鼠NDS与D组比较有显着性降低（P<0.05）;N组大鼠的海马神经细胞损伤在光镜和电镜的观察下较BC组明显加重,D组的海马神经细胞损伤较N组有所减轻,DT组的海马神经细胞损伤较D组明显。使用常规复苏方法的N组大鼠脑皮质神经细胞内的ROS水平较BC组明显升高（P<0.05）,Dex干预后的D组脑皮质神经细胞内的ROS水平较N组有所减少（P<0.05）,而阻断了Dex作用后的DT组脑皮质神经细胞内的ROS水平较D组有所增加（P<0.05）;N组caspase-3的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组caspase-3的表达与N组比较有显着性降低（P<0.05）,DT组caspase-3的表达与D组比较有显着性升高（P<0.05）;N组Bax的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组Bax的表达与N组比较有显着性降低（P<0.05）,DT组Bax的表达与D组比较有显着性升高（P<0.05）;N组Beclin1的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组Beclin1的表达与N组比较有显着性降低（P<0.05）,DT组Beclin1的表达与D组比较无显着性差异（P>0.05）;N组Bcl-2的表达与BC组比较有显着性降低（P<0.05）,D复苏组Bcl-2的表达与N组比较有显着性增加（P<0.05）,DT组Bcl-2的表达与D组比较无显着性差异（P>0.05）;N组HSP70的表达与BC组比较有显着性增加（P<0.05）,D组HSP70的表达与N组比较有显着性增加（P<0.05）,DT组HSP70的表达与D组比较有显着性降低（P<0.05）。结论:使用常规药物CPR时联合腹腔注射Dex对复苏后大鼠有明显的致低温作用,并能显着提高复苏大鼠的神经功能。其机制与Dex能减少复苏后大鼠脑皮质神经细胞内的ROS水平,减少脑海马caspase-3、Bax和增加HSP70等凋亡相关蛋白的表达,以及调控Bcl-2-Beclin1复合体的自噬作用有关。
系梦琪[6]（2020）在《电针对脑缺血大鼠SVZ区Nestin和PCNA表达的影响》文中进行了进一步梳理目的:（1）观察电针对脑缺血大鼠行为学,脑组织形态以及缺血侧侧脑室室管膜下区（subventricular zone,SVZ）的巢蛋白（Nestin）和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表达的影响。（2）观察电针对高血脂合并脑缺血大鼠血脂,行为学,脑组织形态学的影响;探索电针对模型大鼠SVZ和缺血半暗带的Nestin、PCNA表达的影响。方法:实验一:24只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针1组、电针2组。电针1组电针双侧“丰隆”（2/100 Hz,1-3 mA）,每天1次,连续治疗7天;第8天,电针1、2组和模型组用50%FeCl3滤纸贴敷大脑中动脉（middle cerebral artery,MCA）20分钟造成脑血栓模型,术后电针1、2组电针“丰隆”、“百会”,每天1次,连续7天。术后24小时用神经功能缺损评分（neurological deficit score,NDS）进行行为学检测,苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）观察缺血半暗带组织形态,免疫组化法检测术后1、7天缺血侧SVZ区Nestin和PCNA的表达。实验二:41只SD大鼠随机分为正常组和高脂饲料喂养组（high fat diet,HFD）,HFD大鼠用高脂饲料喂养42天造成高脂血症模型后,随机分为假手术组、模型组、电针1组、电针2组。电针1组电针双侧“丰隆”（2/100 Hz,1-3 mA）,每天1次,连续7天。第50天,电针1、2组和模型组用50%FeCl3滤纸贴敷MCA 20分钟造成脑缺血,术后电针1、2组电针“丰隆”、“百会”,每天1次,连续14天。用NDS评定行为学变化,生物化学法检测血脂四项,HE染色观察缺血半暗带形态学改变,免疫组化检测缺血侧SVZ、缺血半暗带Nestin和PCNA的表达。结果:实验一:（1）行为学:术后24小时,模型组动物出现饮食减少,体重减轻,右侧前肢屈曲,原地转圈的症状。与模型组比较,电针1、2组NDS明显降低（P＜0.05）,神经缺损症状减轻。（2）脑组织形态:脑缺血后1天,模型组神经元排列散乱,细胞核固缩,细胞周围间隙扩大,部分血管红细胞渗出。电针治疗后,缺血半暗带空泡变性减少,组织形态趋于正常。（3）免疫组化结果:假手术组SVZ区Nestin阳性表达较少。与假手术比较,术后1、7天模型组SVZ区Nestin面密度增加（P<0.01）。与模型组比较,电针1、2组侧脑室背外侧角Nestin表达均增高,从术后1天（电针1组P<0.01,电针2组P<0.05）持续至术后7天（P<0.01）,两个电针组侧脑室外侧壁Nestin表达在术后1天升高（P<0.01）,术后7天升高差异没有统计学意义（P>0.05）。脑缺血术后1天,与模型组比较,电针1组侧脑室背外侧角PCNA面密度升高（P<0.01）。电针1、2组之间差异无统计学意义（P>0.05）,但趋势上电针1组高于电针2组。实验二:（1）行为学:脑缺血后24小时,模型组大鼠出现体重减轻,右侧前肢屈曲,向右侧转圈等症状,NDS评分较高。与模型组比较,电针1、2组NDS评分均有所降低（P<0.05）,电针1组比电针2组神经缺损症状减轻更为明显。（2）血脂:脑缺血后1、7、14天模型组TC、LDL升高（P<0.05）,HDL降低（P<0.05）。与模型组比较,术后14天电针1组TC、LDL降低（P<0.05）,HDL升高（P<0.01）;电针2 组 LDL 降低（P<0.01）,HDL 升高（P<0.05）。（3）脑组织形态:假手术组皮层和纹状体神经元均匀分布、结构完整,与正常组形态基本一致。模型组缺血半暗带神经元大量坏死,细胞核固缩,可见大量空泡样结构,血管中有红细胞渗出,组织形态整体上呈脑缺血改变。电针治疗后,正常神经元明显增多,细胞形态接近正常。（4）Nestin免疫组化结果:在侧脑室背外侧角,与假手术组相比,模型组Nestin面密度在术后1、7天升高（P<0.05）。与模型组比较,术后1、7、14天电针1组（P<0.01）和电针2组（P<0.05）Nestin面密度均增加。电针1组Nestin面密度高于电针2组,但差异无统计学意义（P>0.05）。在侧脑室外侧壁,模型组Nestin表达在术后1、7天（P<0.01）和14天（P<0.05）均增加。与模型组比较,电针1组Nestin面密度在术后1、7天增高（P<0.05）,电针2组仅在术后7天增高有统计学意义（P<0.05）。电针1组Nestin阳性表达较电针2组更为明显,但差异无统计学意义（P>0.05）。在缺血半暗带,模型组Nestin表达在术后1、7、14天均显着增加（P<0.01）。与模型组比较,电针1组Nestin面密度在术后1、7天增高（P<0.05）,电针2组在术后14天增高有统计学意义（P<0.05）。电针1组Nestin阳性表达较电针2组更为明显,但差异无统计学意义（P>0.05）。（5）PCNA免疫组化结果:在侧脑室背外侧角,与假手术组相比,模型组缺血侧侧脑室背外侧角PCNA面密度在术后1天（P<0.01）,7天（P<0.05）均升高。与模型组比较,电针1组PCNA面密度在术后1、7、14天均增高（P<0.01）,电针2组仅在术后7天增高有统计学意义（P<0.01）。在侧脑室外侧壁,模型组PCNA表达在术后1、7天增加（P<0.05）。与模型组比较,电针1组PCNA面密度在术后1天（P<0.05）,术后7、14天（P<0.01）均增高,电针2组仅在术后14天增高（P<0.01）。在缺血半暗带,模型组PCNA表达在术后1、7、14天均显着增加（P<0.01）。与模型组比较,术后1、7、14天,电针1组（P<0.01）和电针2组（P<0.05）PCNA面密度均增高。电针1组PCNA阳性表达比电针2组更为明显,但差异无统计学意义（P>0.05）。结论:（1）电针“丰隆”、“百会”可以改善脑缺血大鼠的神经功能,减轻缺血性脑损伤,促进SVZ区Nestin和PCNA的表达,达到脑损伤后神经修复的目的;在脑缺血前就进行电针干预效果更理想。（2）电针“丰隆”、“百会”可以调节血脂代谢,改善高血脂合并脑缺血大鼠缺血半暗带的组织形态,减轻神经功能缺损症状;在高血脂阶段电针“丰隆”,脑缺血后电针“丰隆”、“百会”效果更佳。（3）电针可能通过促进SVZ区神经干细胞在高脂血症-脑缺血损伤中的增殖来改善大脑的修复和再生。
万科幸[7]（2020）在《Neuritin基因在脑缺血再灌注损伤中的保护和修复作用的研究》文中指出目的:鉴定并筛选成功过表达Neuritin的转基因阳性鼠并从个体水平评价Neuritin蛋白在脑缺血再灌注损伤中对神经的保护和修复作用。方法:1.鉴定Neuritin转基因鼠（Nrn1-Tg）目的基因的整合及表达情况。（1）在基因组水平的鉴定:提取DNA通过PCR初步筛选成功整合插入序列的小鼠。用Southern blot对PCR阳性鼠进行再次鉴定,将上述两次检测为阳性的小鼠与野生型小鼠（WT）交配。（2）在转录水平的鉴定:用qRT-PCR检测Nrn1-Tg与WT鼠尾组织及海马组织的Neuritin mRNA的表达量。（3）蛋白水平的鉴定:用Western blot检测转基因鼠海马组织Neuritin蛋白的表达水平。2.用夹闭双侧颈总动脉的方法建立短暂性全脑缺血模型（Transient Global Ischemia,TGI）。36只C57BL6小鼠分为转基因模型组（Tg-TGI）,非转基因模型组（WT-TGI）,假手术组（sham）,n=12。各组又分为再灌注1,3,7,14天四个亚组（n=3）,分别在第1,3,7,14天处死小鼠对脑部组织取材。3.用qRT-PCR,Western blot及免疫组织化学检测海马组织中Neuritin在TGI模型后的时序表达谱。4.评估TGI后过表达的Neuritin对神经细胞损伤及凋亡的影响。（1）利用Nissl染色评价TGI模型后海马CA1区神经细胞的损伤程度。（2）免疫组织化学检测TGI模型后海马CA1区cleaved PARP1的表达量。（3）用Western blot检测TGI模型后海马组织中cleaved PARP1的表达量。5.检测过表达Neuritin对TGI后神经细胞再生修复能力的影响。（1）用免疫组织化学检测海马CA1区神经再生标志物:生长相关蛋白（GAP-43）,突触素（SYN-38）,神经丝蛋白（NF-200）的表达量。（2）用Western blot检测海马组织GAP-43,SYN-38,NF-200的表达量。6.评价过表达Neuritin对TGI后的空间学习和记忆能力的影响。用水迷宫实验检测TGI模型后Nrn1-Tg小鼠及WT小鼠的逃避潜伏期及穿越平台次数的差异。结果:1.成功鉴定过表达Neuritin的转基因阳性鼠。（1）基因组水平的鉴定:PCR筛选出的整合鼠与Southern blot鉴定结果一致,具有1-2个拷贝数。共繁殖小鼠145只,其中Nrn1-Tg鼠39只。（2）转录水平的鉴定:qRT-PCR结果显示,与WT小鼠相比,Nrn1-Tg小鼠尾组织及海马组织中Neuritin mRNA表达量显着升高（p<0.05）。（3）蛋白水平的鉴定:WB结果显示,与WT小鼠相比,Nrn1-Tg小鼠海马组织中Neuritin蛋白表达量明显升高（p<0.01）。2.在TGI模型后,Neuritin mRNA表达量在第1天逐渐上升,于第7天达到顶峰,在第14天回落。且在第1,3,7天,Tg-TGI组显着高于WT-TGI组（p<0.05）。WB及免疫组织化学结果显示,在TGI模型后,海马组织及CA1区的Neuritin蛋白表达量在第1天逐渐上升,在第3天达到顶峰后于第14天回落到第一天水平。与WT-TGI小鼠相比,在第3,7天,Tg-TGI组Neuritin蛋白表达量显着升高（p<0.05）。3.TGI后过表达的Neuritin可减轻神经细胞的损伤,挽救受损细胞免于凋亡。（1）Nissl染色结果显示,sham组海马CA1区神经细胞排列紧密,整齐。TGI模型组神经细胞数量减少,神经元显示出收缩的细胞体,紧缩的细胞核,提示造模成功。与WT-TGI相比,在第3天和第7天,Tg-TGI组的海马CA1区受损神经细胞数量显着减少（p<0.05）。在第14天,各组之间的神经细胞计数恢复至没有差异。（2）WB及免疫组织化学结果显示,在TGI模型后第一周,与WT-TGI组相比,Tg-TGI组海马组织及CA1区cleaved PARP1蛋白表达量显着降低（p<0.05）。在第14天时组间没有差异。4.过表达Neuritin可增强TGI后的神经细胞的再生修复能力。WB及免疫组织化学结果显示:（1）TGI模型后第1天GAP-43蛋白的表达量逐渐上升,至第3天达到顶峰后降低,且第3天和第7天Tg-TGI组的表达量显着高于WT-TGI组（p<0.05）。（2）SYN-38蛋白表达量在第1天逐渐上升,至第7天达到顶峰,随后于第14天出现回落,且第3天和第7天Tg-TGI组的峰值显着高于WT-TGI组（p<0.05）,但在第14天,WT-TGI组的表达量高于Tg-TGI组。（3）与WT-TGI相比,Tg-TGI组的NF-200蛋白表达量在第1-7天显着升高（p<0.05）,第14天组间没有差异。5.Neuritin可改善转基因小鼠TGI后的空间学习和记忆能力。（1）水迷宫实验结果显示三组小鼠随着训练次数增加,逃避潜伏期逐渐缩短。与WT-TGI组相比,第3,4,5天,Tg-TGI组的逃避潜伏期显着缩短（p<0.05）。（2）空间探索实验中,Tg-TGI组穿越平台次数及在目的象限探索时间相对于WT-TGI组显着增加（p<0.05）。（3）游泳探索路径也揭示Tg-TGI小鼠更有针对性的目的象限搜索策略,而WT-TGI小鼠倾向于随机游泳。结论:成功筛选并鉴定出过表达Neuritin的转基因阳性小鼠。过表达Neuritin可减轻神经细胞的损伤,并能通过抑制PARP1蛋白的降解,减少神经细胞的凋亡,加速了TGI后CA1区神经细胞的恢复。此外,在损伤后轴突再生的关键时期,上调的Neuritin还可显着上调损伤区神经细胞NF200、GAP-43及SYN-38蛋白的表达,为神经突起的再生和重塑提供了有利的微环境,有效提高TGI后的神经再生修复能力,加速TGI后小鼠的空间学习和记忆能力的改善。
程文杰[8]（2020）在《右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注导致的局部及脑损伤的影响》文中进行了进一步梳理临床多用到止血带以达到减少术中失血和保持手术野清晰,然而止血带所引起的缺血再灌注（I/R）损伤逐渐受到重视,该损伤不但使肢体原发缺血部位受损,还引起继发远隔器官的损伤。除了肢体缺血再灌注损伤外,止血带充气还可引起高血流动力状态。虽然止血带引起的I/R损伤和高动力反应已被认识多年且其复杂的病理生理机制和治疗措施尚未完全了解,但大量研究指出,骨骼肌损伤、氧自由基的脂质氧化作用和中性粒细胞介导的炎性反应,在肢体缺血再灌注诱发局部和远隔器官功能障碍中起重要作用。围手术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive dysorders,PNDs）指术前无精神障碍的患者在术后出现了注意力不集中、记忆能力下降等认知功能的改变,该病在老年患者中较为常见。PNDs不仅延长患者住院时间,增加住院费用,而且增加患者术后病死率,引发了一系列医学、社会及经济问题,虽然对PNDs进行了很多方面的研究,但究其病因及发病机制至今尚不明确,而越来越多的研究提示机体炎性反应可能在其中发挥了巨大的作用。右美托咪定（Dex）是一种新型a2肾上腺素受体激动剂,具有镇静、抗焦虑、催眠、镇痛以及交感神经抑制作用,作为辅助用药,已被广泛应用于手术麻醉。大量研究证明右美托咪定可以对器官的缺血再灌注损伤起保护作用,目前对于该药机体保护作用的研究主要集中于脑、心、肝等重要脏器,有关其对止血带所引发的I/R损伤的影响报道较少且存在争议。羟考酮（Oxy）是一种半合成阿片类药物,主要作用于中枢神经系统μ和k阿片受体产生镇痛作用。最近的研究表明,羟考酮不仅具有强镇痛作用,而且具有减轻炎症反应的作用。目前,该药对止血带所引发的I/R的影响无文献报道。围术期医学是麻醉学发展的方向,既往麻醉医生只关注术中病人的安全是不足的,不利于麻醉学科的发展和麻醉医生作用的发挥。麻醉医生应优化麻醉方案,设法防治围术期并发症,改善患者的转归。综上本研究旨在观察右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注导致的局部及脑损伤的影响并探讨其相关机制。目的:首先观察比较右美托咪定与羟考酮对肢体缺血再灌注患者的保护效应;其次通过建立下肢止血带缺血再灌注动物模型,观察两药预处理对下肢缺血再灌注后局部肢体及脑损伤的影响,并探讨其相关机制。方法:首先选取择期行单侧下肢手术的患者随机分为对照组缺血-再灌注组（I/R）、右美托咪定组（Dex）、羟考酮组（Oxy）。比较各组止血带引起的血流动力学参数的变化。检测各组围术期血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白介素-6（IL-6）、脂肪酸结合蛋白3（FABP3）、内皮素-1（ET-1）、脑源性神经营养因子（BDNF）变化。其次,利用C57BL6小鼠建立了止血带致急性后肢I/R损伤动物模型。实验将小鼠随机分为sham组、I/R组、Dex组、Oxy组,应用实时微循环成像系统评估各组小鼠肢体灌注情况,采用HE染色、Masson染色、电镜观察各组小鼠腓肠肌形态学变化。检测每组小鼠血清TNF-a水平、腓肠肌收缩力及ATP浓度,并采用western blot检测骨骼肌中TLR4、NF-k B、SIRT1和PGC-1a的表达。最后,应用Morris水迷宫（MWM）测试评估行为改变,免疫荧光法观察各组海马区NF-k B的表达情况,并采用western blot检测海马组织中TLR4、NF-k B、CD68、TNF-a、CD206、IL-10、NR2B。此外,用电生理海马脑片技术观察右美托咪定和羟考酮对幼鼠海马CA1区神经元s EPSC的影响。通过以上实验结果,我们观察了右美托咪定和羟考酮预处理是否能减轻止血带引起的局部骨骼肌损伤和远隔脑损伤,并探讨其相关机制。结果:1 右美托咪定与羟考酮对肢体缺血再灌注患者保护效应的对比研究止血带诱发收缩压（SAP）、平均动脉压（MAP）、舒张压（DAP）、心率-血压乘积（RPP）明显升高。与羟考酮相比,右美托咪定可明显降低心率（HR）。右美托咪定和羟考酮都可降低止血带引起的SAP升高,两者对DAP无明显影响。与术前基础值相比,术后患者血浆中TNF-a、MDA、IL-6、FABP3、ET-1的水平升高,而SOD、BDNF水平下降;右美托咪定和羟考酮可明显减小以上指标的手术前后的变化幅度,除BDNF指标外两者比较无明显差异。与右美托咪定相比,羟考酮可降低术后BDNF水平。2 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注后局部肢体的保护效应2.1 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注后肢体血流的影响止血带结扎后缺血侧肢体血流灌注显着减少,左右下肢平均血流的比值（L/R比值）明显下降。与对照组相比,缺血再灌注组小鼠止血带松开后结扎侧下肢血流稍增多,差异无统计学意义。与缺血再灌注组比较,右美托咪定和羟考酮预处理小鼠结扎侧肢体血流表现出增多的趋势,差异亦无统计学意义。2.2 右美托咪定和羟考酮减轻下肢缺血再灌注后炎症反应的机制与正常形态的腓肠肌组织相比,肢体缺血再灌注后腓肠肌表现出明显损伤;右美托咪定和羟考酮预处理可明显减轻腓肠肌缺血再灌注损伤的程度。此外,右美托咪定、羟考酮预处理可明显减少肢体缺血再灌注后小鼠腓肠肌中TLR4和NF-k B的蛋白表达,而两者间比较无明显差异。2.3 右美托咪定和羟考酮改善下肢缺血再灌注后骨骼肌线粒体功能与正常腓肠肌组织相比,肢体缺血再灌注后,小鼠腓肠肌单收缩、强直收缩力及ATP含量明显下降,右美托咪定、羟考酮预处理可提高缺血再灌注后小鼠腓肠肌单收缩、强直收缩力及ATP含量,差异有统计学意义;而两者间比较无明显差异。此外,右美托咪定、羟考酮预处理可明显增加肢体缺血再灌注后小鼠腓肠肌中SIRT1和PGC-1a的蛋白表达,而两者间比较无明显差异。3 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注导致脑损伤的影响3.1 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注小鼠学习记忆功能的影响与正常小鼠相比,肢体缺血再灌注后,小鼠学习记忆功能明显受损,右美托咪定预处理可减轻小鼠学习记忆受损情况,而羟考酮预处理对此则无影响。与正常小鼠相比,肢体缺血再灌注后,小鼠血清TNF-a含量明显升高,海马NF-k B阳性细胞表达明显增多,右美托咪定、羟考酮预处理可减少缺血再灌注后小鼠血清TNF-a含量及海马NF-k B阳性细胞表达,而两者间比较无明显差异。此外,右美托咪定、羟考酮预处理可明显减少肢体缺血再灌注后小鼠海马中TLR4、NF-k B、CD68和TNF-a的蛋白表达,而两者间比较无明显差异。各因素对小鼠海马CD206和IL-10含量无明显变化。3.2 右美托咪定和羟考酮对海马神经元s EPSC及下肢I/R后海马NR2B表达的影响与给药前基础值相比,予右美托咪定后海马CAl区神经元s EPSC发放频率和振幅均明显降低,以人工脑脊液冲洗后,其神经元s EPSC发放频率和振幅回复;而羟考酮对海马CAl区神经元s EPSC发放频率和振幅无明显影响。与正常小鼠相比,肢体缺血再灌注后,小鼠海马NR2B的表达明显增多;右美托咪定预处理可明显减少肢体缺血再灌注后小鼠海马NR2B的表达,而羟考酮对肢体缺血再灌注导致的小鼠海马NR2B表达增多无影响。结论:1本研究表明应用止血带行下肢手术的患者,术中伴有高血流动力反应和促炎细胞因子升高,甚至出现远隔多器官损伤。右美托咪定和羟考酮都可减轻止血带所致的高血流动力学状态,降低机体炎症反应从而对患者起保护效应。2止血带所致缺血再灌注可致小鼠骨骼肌损伤;右美托咪定或羟考酮预处理可抑制TLR4/NF-k B通路降低炎症反应,维持SIRT1/PGC-1a平衡改善线粒体功能进而减轻缺血再灌注致骨骼肌损伤;而两者对缺血再灌注肢体血流灌注无有效改善。3肢体缺血再灌注可导致全身炎症,海马谷氨酸受体（NR2B）表达增多产生兴奋性毒性,进而损伤小鼠学习记忆能力;右美托咪定组预处理可抑制小胶质细胞转化为促炎型小胶质细胞（M1）,通过TLR4/NF-k B通路减轻炎症反应,进而改善认知功能损伤,此外右美托咪定可能通过减少海马突触前膜兴奋性递质谷氨酸释放及抑制谷氨酸受体（NR2B）表达,从而对认知损害产生保护效应。羟考酮预处理亦可抑制小胶质细胞转化为促炎型小胶质细胞（M1）,通过TLR4/NF-k B通路减轻炎症反应,但对学习记忆改善不明显,究其原因可能与其对海马谷氨酸受体（NR2B）表达增多无影响有关。
龙婷婷[9]（2020）在《Noggin蛋白对小鼠脑缺血再灌注损伤后行为能力、齿状回与海马修复及其作用机制的探讨》文中研究表明目的:探讨侧脑室注射Noggin蛋白对小鼠脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）后不同时期行为能力、齿状回（Dentate gyrus,DG）结构与海马骨形态发生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4,BMP4）、骨形态发生蛋白6（Bone morphogenetic protein 6,BMP6）,以及CIRI后炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等发病机制的影响,以期为临床缺血性脑血管疾病的预防与治疗提供新的策略。方法:（1）324只昆明雄性小鼠按数字表法随机分为:假手术组（sham,n=108）、缺血再灌注损伤组（Ischemia/Reperfusion,I/R,n=108）、缺血再灌注损伤+Noggin治疗组（Noggin,n=108）,每组再分为1d、3d、7d、14d共4个亚组。Noggin组和I/R组采用改良线栓塞法制备右侧CIRI模型,建模成功后30min,侧脑室分别给予2μl的Noggin蛋白液及等体积的0.9%氯化钠注射液1次;而Sham组按模型构建法分离血管,不栓塞大脑中动脉（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）,经侧脑室注射2μl的0.9%氯化钠注射液。（2）各组小鼠取材前1d分别采用Y型电迷宫刺激器和平衡木实验检测小鼠学习记忆能力和平衡能力;然后取材进行缺血侧脑组织超氧化物歧化酶（Superoxide desmu-tase,SOD）和丙二醛（Maleic dialdehyde,MDA）含量的检测;ELISA法检测肿瘤坏死因子（Tumornecrosis factor-α,TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6,IL-6）的含量;Western blot对Noggin相关拮抗蛋白BMP4、BMP6的表达变化进行检测并定量分析;最后采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色法检测脑梗死面积;尼氏染色（Nissl staining）与免疫荧光法对DG神经元与GFAP阳性细胞变化进行观察并计数分析;TUNEL染色法对DG神经元凋亡情况进行观察并计数分析;透射电子显微镜观察DG神经元微细结构变化。结果:（1）成功构建小鼠脑缺血再灌注损伤动物模型;（2）神经功能评分、平衡木测试和Y型迷宫检测结果:与Sham组相对比,I/R组和Noggin组小鼠神经功能评分、平衡能力和学习记忆能力均下降（P<0.05）;与I/R组相对比,Noggin组小鼠神经功能评分、平衡能力和学习记忆能力均提高（P<0.01）。（3）SOD、MDA检测结果:与Sham组相对比,I/R组和Noggin组小鼠SOD活性均下降、MDA含量增加（P<0.001）;而Noggin组与I/R组相对比,SOD含量增加、MDA含量减少（P<0.001）。（4）IL-6、TNF-α检测结果:与Sham组相对比,I/R组与Noggin组IL-6、TNF-α含量均增加（P<0.001）;而Noggin组各时间点较I/R组IL-6、TNF-α含量均下降（P<0.001）。（5）Western blot检测结果:与Sham组相对比,I/R组和Noggin组中BMP4蛋白表达增加,而BMP6蛋白表达减少（P<0.001）;Noggin各时间点较I/R组BMP4蛋白表达下降,BMP6蛋白表达增加（P<0.001）。（6）TTC染色结果:与Sham组相对比,I/R组和Noggin组小鼠脑梗死面积比值增加（P<0.001）;与I/R组相对比,Noggin组小鼠脑梗死面积比值减少（P<0.001）。（7）Nissl染色结果:光镜下,Sham组小鼠DG神经元结构未见异常;I/R组DG神经元损伤明显,细胞明显水肿,排列较疏松,尼氏体染色深;其中,以7d亚组DG神经元损伤最严重,细胞出现间隙增宽,核固缩明显;Noggin组DG神经元损伤得到明显改善,尼氏体着色变浅,细胞数量增加（P<0.01）。（8）透射电镜观察结果:Sham组电镜下观察到DG神经元的超微结构无明显异常,有丰富的细胞器;而I/R各亚组的神经元均有不同程度损伤,核膜不完整,染色质边集,部分细胞器溶解消失,其中7d亚组损伤最严重;Noggin治疗后,神经元损伤较I/R组减轻。（9）GFAP免疫荧光检测结果:与Sham组相比,I/R组与Noggin组GFAP阳性细胞数目明显增多（P<0.001）;I/R四个亚组中,GFAP阳性细胞数从1d到7d逐渐升高达峰值,呈星形,突起增多变粗,14d有所下降;而Noggin各时间点较I/R组GFAP阳性细胞数均减少（P<0.01）,胞体变小,突起变细。（10）TUNEL法检测结果:Sham组未观察到明显的凋亡细胞;I/R组和Noggin组中凋亡细胞数量明显增多,且7d亚组时达高峰,与Sham组相对比（P<0.01）,而Noggin各亚组DG凋亡细胞数较I/R组显着减少（P<0.001）。结论:Noggin蛋白提高了脑缺血再灌注损伤后小鼠的平衡与学习记忆能力;增强了抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡能力;下调BMP4及上调BMP6蛋白的表达,以上结果表明,其有可能成为防治CIRI的一种重要药物。
牛莉[10]（2020）在《胆碱能抗炎通路介导右美托咪定对脑缺血再灌注损伤的保护作用》文中认为随着人口老龄化的增加,脑血管疾病在我国发病率越来越高。脑组织对缺血敏感性较高,一旦发生缺血,会迅速出现病理改变,很快进入不可逆损伤状态,而血流恢复后又容易引发一系列复杂级联反应,出现神经细胞凋亡、坏死以及延迟性的神经功能障碍,即为缺血再灌注损伤（I/RI）。氧自由基大量释放、钙超载、NO过度释放、兴奋性氨基酸、炎症因子释放均可参与脑缺血再灌注的损伤。缺血再灌注损伤后容易引起远期神经系统功能障碍,学习、记忆和认知都会受到影响。临床上短暂性脑缺血再灌注损伤,一般发生在急救措施之后,如心肺复苏术,心脏骤停和休克患者的抢救后,神经外科手术围术期以及体外循环后也易出现。胆碱能抗炎通路（Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP）是一条神经免疫调节通路,它的激活可有效减少促炎因子的释放,具有明显的炎症抑制作用。它是一种内源性神经反馈调节机制:当中枢神经系统受到免疫刺激后,投射到迷走神经核团,激活中枢迷走神经,使外周神经末梢释放乙酰胆碱,与网状内皮细胞上的α7亚单位的N型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptorsα7,α7nAChR）特异性结合,通过细胞内的信号传导通路,参与众多生物学过程,如增殖、分化、黏附、迁移和凋亡等。细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡,主要包括信号转导、基因调控和凋亡效应的执行三个阶段,而信号转导过程的激活则是细胞凋亡的启动者。p38MAPK/NF-κB是细胞内重要的信号转导通路,在细胞的增殖及凋亡过程中发挥着重要作用。丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinases,MAPKs）为丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种生理过程。p38MAPK主要介导炎症反应、创伤以及应激等信号传递,在调节炎症反应、神经退行性改变和神经细胞凋亡过程中发挥作用,p38通路过度激活能够抑制细胞生长甚至凋亡。右美托咪定（Dex）是临床常用的一种镇静药物,同时也有镇痛和抗焦虑的作用,主要作用于α2受体。近年来研究证实:右美托咪定可激活丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）来防御大鼠蛛网膜下腔出血诱导的脑损伤,抑制促炎因子的释放以及减少钙超载;预防缺血再灌注损伤引起的心肌、肝、肠,肺、肾脏以及脑损伤。同时还可抑制线粒体凋亡,氧糖剥夺,钙超载,来保持线粒体的功能稳定。以上研究显示右美托咪定具有抗凋亡、抗炎、脑保护作用,但是右美托咪定使用剂量差别很大且既往没有进行比较。据此,我们提出假设,右美托咪定对于脑缺血再灌注损伤具有保护作用,且保护作用呈剂量相关性。右美托咪定能够抑制交感神经,间接兴奋副交感神经,减慢心率,和迷走神经作用类似,本文拟从胆碱能抗炎通路方面探讨右美托咪定的脑保护作用。本研究包括以下两个方面:1、右美托咪定对减轻脑缺血再灌注损伤,抑制海马神经元细胞的凋亡是否有剂量相关性。2、探讨胆碱能抗炎通路是否参与右美托咪定的脑保护作用。第一部分:不同剂量右美托咪定对缺血再灌注损伤大鼠海马神经元细胞的作用目的:本研究通过建立大鼠大脑中动脉闭塞模型（MCAO）,采用不同剂量右美托咪定进行干预,观察不同剂量右美托咪定对缺血再灌注大鼠海马神经元细胞的影响。方法:40只大鼠随机分为5组,每组8只,分别为假手术组（S）、缺血再灌注组（I/R）、Dex高剂量组（DH）、Dex中剂量组（DM）、Dex低剂量组（DL）。S组只对大鼠进行血管分离,不进行插线栓;I/R组和Dex组采用右侧大脑中动脉闭塞2h后再灌注24h建立脑缺血再灌注动物模型,I/R组不进行药物干预,Dex高剂量组（DH,60μg/kg）、Dex中剂量组（DM,6μg/kg）、Dex低剂量组（DL,0.6μg/kg）在缺血前给予不同剂量的Dex进行干预。用2,5,3,5-三苯基四氯化钴（TTC）染色检测神经损伤,采用湿-干加权法和HPLC-质谱仪分别检测脑组织中水和γ-氨基丁酸的含量,TUNEL染色和流式细胞术检测海马神经元凋亡。此外,通过实时定量PCR和Western blot检测酶切caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达。结果:1.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠神经功能评分的影响与假手术组相比,I/R组大鼠神经功能评分明显降低;与I/R组相比,DM、DH组大鼠神经功能评分明显升高;与DM组相比,DL组大鼠神经功能评分明显降低,DH组大鼠神经功能评分明显升高;差异具有统计学意义（P<0.05）。2.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠脑梗死面积和含水量的影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑梗死面积及含水量明显增加;与I/R组相比,DM、DH组大鼠脑梗死面积和含水量明显减少;与DM组相比,DL组大鼠脑梗死面积及含水量明显增加,DH组大鼠脑梗死面积及含水量明显减少;差异具有统计学意义（P<0.05）。3.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠脑组织γ-氨基丁酸含量的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织Y-氨基丁酸含量明显降低;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马组织γ-氨基丁酸含量明显升高;与DM组相比,DL组大鼠海马组织γ-氨基丁酸含量明显降低,DH组大鼠海马组织γ-氨基丁酸含量明显升高;差异具有统计学意义（P<0.05）。4.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠海马神经细胞凋亡的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马神经细胞凋亡明显增多;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马神经细胞凋亡明显减少;与DM组相比,DL组大鼠海马神经细胞凋亡明显增多,DH组大鼠海马神经凋亡明显减少;差异具有统计学意义（P<0.05）。5.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠海马组织Caspase-3蛋白的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显着升高;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显着降低;与DM组相比,DL组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显着升高,DH组大鼠海马组织caspase-3蛋白水平显着降低;差异具有统计学意义（P<0.05）。6.不同剂量右美托咪定对I/R大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白水平显着降低;与I/R组相比,DM、DH组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白水平显着升高;与DM组相比,DL组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量和蛋白水平显着降低,DH组大鼠海马组织Bcl-2/Bax mRNA含量蛋白水平显着升高;差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.右美托咪定能够减轻I/R大鼠神经功能损伤,减少脑梗死面积。2.右美托咪定可以上调Bcl-2/Bax蛋白表达,对I/R大鼠海马神经元细胞具有明显保护作用;3.右美托咪定的脑保护作用具有剂量依赖性,随剂量增加,保护作用增强。第二部分:胆碱能抗炎通路介导右美托咪定对缺血再灌注大鼠海马神经细胞的保护机制目的:1.探讨右美托咪定对I/R大鼠海马神经细胞的保护作用是否与迷走神经有关。2.阐明胆碱能抗炎通路是否介导右美托咪定对I/R大鼠海马神经元细胞的保护作用。实验一:方法:40只大鼠随机分为5组,每组8只,分别为假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）、右美托咪定组（Dex组）、Dex+迷走神经切断组（D+V组）和迷走神经切断组（V组）。所有大鼠均进行模型建立干预,S组大鼠不插入线栓,正常缝合;I/R组大鼠缺血2小时后去除线栓;Dex组在制备MCAO前静脉输注剂量为Dex（6ug/kg）,D+V组给与Dex（6ug/kg）前切断迷走神经,迷走神经切断组在制备模型前切断迷走神经。所有大鼠均在灌注24h后处死,测定各组大鼠神经功能评分、脑组织含水量及梗死面积,检测炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,测定海马神经细胞凋亡率和NF-κBp65、Bcl-2、Bax、Caspase-3、CytC及p-p38的蛋白表达。结果:1.迷走神经切断对I/R大鼠含水量、脑梗死面积及神经功能评分影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显着增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显着降低;与右美托咪定组相比,D+V组脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显着提高,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.迷走神经切断对I/R大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显着增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显着减少;与右美托咪定组相比,D+V组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显着提高,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.迷走神经切断对I/R大鼠海马神经元细胞凋亡率的影响与假手术组相比,I/R组海马细胞凋亡率明显升高;与I/R组相比,右美托咪定组凋亡率明显降低;与右美托咪定组相比,D+V组凋亡率明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.迷走神经切断对I/R大鼠海马细胞凋亡蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显着升高,Bcl-2蛋白表达显着降低;与I/R组相比,右美托咪定组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显着降低,Bcl-2蛋白表达显着升高;与右美托咪定组相比,D+V组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显着升高,Bcl-2蛋白表达显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.迷走神经切断对I/R大鼠p-p38、CytC和p65蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组p-p38、CytC和p65蛋白表达明显升高;与I/R组相比,右美托咪定组p-p38、CytC和p65蛋白表达明显降低;与右美托咪定组相比,D+V组p-p38、CytC和p65蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。实验二:方法:40只大鼠随机分为5组,每组8只,分别为假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）、右美托咪定组（Dex组）、Dex+α-银环蛇毒素组（D+G组）和α-银环蛇毒素组（G组）。所有大鼠均进行模型建立干预,S组大鼠不插入线栓,正常缝合;I/R组大鼠缺血2小时后去除线栓;Dex组在制备MCAO前静脉输注剂量为 Dex（6ug/kg）,D+G 组给与 Dex（6ug/kg）前给 α-GBT（1ug/kg）,G 组在制备模型前给与α-GBT（1ug/kg）。所有大鼠均在灌注24h之后处死,测定各组大鼠的神经功能评分、脑组织含水量以及脑梗死面积,检测炎性因子TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平,测定脑细胞凋亡率和 NF-κBp65、Bcl-2、Bax、Caspase-3、p-p38及CytC的蛋白表达。结果:1.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠含水量、脑梗死面积及神经功能评分影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显着增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显着降低;与右美托咪定组相比,D+G组大鼠脑组织含水量、脑梗死面积及神经功能评分均显着提高;差异具有统计学意义（P<0.05）。2.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显着增加;与I/R组相比,右美托咪定组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显着减少;与右美托咪定组相比,D+G组大鼠脑组织匀浆中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显着提高;差异具有统计学意义（P<0.05）。3.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠海马神经元细胞凋亡率的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马神经元细胞凋亡率明显升高;与I/R组相比,右美托咪定组凋亡率明显降低;与右美托咪定组相比,D+G组凋亡率明显升高;差异具有统计学意义（P<0.05）。4.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠海马细胞凋亡蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组大鼠海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显着升高,Bcl-2蛋白表达显着降低;与I/R组相比,右美托咪定组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显着降低,Bcl-2蛋白表达显着升高;与右美托咪定组相比,D+G组海马组织中Bax、Caspase-3的蛋白表达显着升高,Bcl-2蛋白表达显着降低;差异具有统计学意义（P<0.05）。5.α7nAChR抑制剂对I/R大鼠p-p38、CytC和p65蛋白表达水平的影响与假手术组相比,I/R组p-p38、CytC和p65蛋白表达显着升高;与I/R组相比,右美托咪定组p-p38、CytC和p65蛋白表达显着降低;与右美托咪定组相比,D+G组p-p38、CytC和p65蛋白表达显着升高;差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.右美托咪定发挥脑保护作用依赖迷走神经的完整性。2.胆碱能抗炎通路介导了右美托咪定对脑缺血再灌注损伤的保护作用。3.右美托咪定脑保护作用的实现可能与p38MAPK受体介导的凋亡有关。
二、缺血再灌注后对小鼠海马神经细胞凋亡的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、缺血再灌注后对小鼠海马神经细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
（1）舒血宁注射液在缺血性脑卒中预后的药效评价及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究内容一 舒血宁注射液对脑卒中后小鼠脑损伤及行为学的药效评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 小结一 |
| 研究内容二 舒血宁注射液提高脑卒中后小鼠认知功能障碍的体内机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 小结二 |
| 研究内容三 舒血宁注射液提高脑卒中后小鼠认知功能障碍的体外机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 小结三 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 多组分天然药物能否作为缺血性脑卒中分期分型治疗策略? |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照(Abbreviations) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和来源 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 外源性H_2S体外磷酸化实验(~(32)P) |
| 2.1.1 重组质粒的转化 |
| 2.1.2 重组质粒的诱导表达 |
| 2.1.3 重组蛋白Rho A的分离与纯化 |
| 2.1.4 体外磷酸化 |
| 2.2 外源性H_2S实验 |
| 2.2.1 大鼠原代海马神经细胞培养与鉴定 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.2.4 缺氧性损伤模型(Hypoxia-Reoxygenation Protocol) |
| 2.2.5 细胞活力的测量 |
| 2.2.6 神经特异性烯醇化酶(NSE)活性测定 |
| 2.2.7 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 |
| 2.2.8 细胞膜蛋白和胞质蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.2.10 全细胞膜片钳技术 |
| 2.3 内皮源性H_2S实验 |
| 2.3.1 原代脑血管内皮细胞培养 |
| 2.3.2 细胞共培养系统 |
| 2.3.3 流式细胞仪细胞凋亡测定 |
| 2.3.4 神经细胞内钙含量测定 |
| 2.3.5 H_2S浓度的测量 |
| 2.3.6 神经细胞活力和LDH及 NSE的测定 |
| 2.3.7 神经细胞RhoA及ROCK_2活性测定 |
| 2.3.8 Western blotting |
| 2.4 动物实验 |
| 2.4.1 质粒转染大鼠(脑立体定位注射) |
| 2.4.2 大鼠脑缺血模型(双侧颈总动脉结扎2VO) |
| 2.4.3 脑组织(海马)HE染色 |
| 2.4.4 脑组织(海马)TUNEL染色 |
| 2.4.5 血清LDH和 NSE测定 |
| 2.4.6 海马组织RhoA和ROCK_2活性测定 |
| 2.4.7 Western blotting |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 硫化氢(H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.1.1 目的蛋白在大肠杆菌(BL-21)中的表达 |
| 3.1.2 目的蛋白(RhoA~(wild),RhoA~(S188A))的纯化 |
| 3.1.3 NaHS(外源性H_2S)对RhoA Ser188体外磷酸化的影响 |
| 3.2 Ser188 介导NaHS对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.2.1 大鼠原代海马神经细胞的培养与鉴定 |
| 3.2.2 真核质粒(RhoA~(wild)-pEGFP-N1;RhoA~(S188A)-pEGFP-N1)转染原代大鼠神经细胞 |
| 3.2.3 Ser188 介导Na HS诱导大鼠海马神经元Rho A的磷酸化 |
| 3.2.4 Ser188在Na HS诱导神经元中Rho A易位和失活的作用 |
| 3.2.5 RhoA Ser188在NaHS诱导的ROCK_2蛋白表达及其活性抑制的作用 |
| 3.2.6 Rho ASer188 介导Na HS对大鼠海马神经元H/R损伤的保护作用 |
| 3.2.7 Rho A Ser188 介导Na HS对 BKCa通道电流的影响 |
| 3.3 Ser188介导内皮源性H_2S对大鼠海马神经元的保护作用 |
| 3.3.1 大鼠原代脑血管内皮细胞(ECs)的培养与鉴定 |
| 3.3.2 内皮源性H_2S对神经元RhoA磷酸化,活性和易位的影响 |
| 3.3.3 内皮源性H_2S对神经元ROCK_2蛋白表达和活性的影响 |
| 3.3.4 内皮细胞中CSE产生内皮源性H_2S |
| 3.3.5 Ser188在CSE产生的H_2S诱导大鼠神经元RhoA磷酸化,转运和ROCK_2蛋白表达中的影响 |
| 3.3.6 Ser188在CSE产生的H_2S减轻神经元H/R损伤的作用 |
| 3.3.7 Ser188在CSE产生的H_2S对神经元(H/R损伤)RhoA和ROCK_2活性抑制的作用 |
| 3.3.8 Ser188在CSE产生的H_2S保护神经元H/R损伤的作用 |
| 3.4 Ser188 介导NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用 |
| 3.4.1 大鼠脑定位转染质粒的表达与检测 |
| 3.4.2 大鼠双侧颈总动脉结扎(2VO)模型验证 |
| 3.4.3 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织Rho A磷酸化及其活性的影响 |
| 3.4.4 Ser188在NaHS对大鼠缺血再灌注脑损伤中海马组织ROCK_2蛋白表达及其活性的影响 |
| 3.4.5 Ser188在NaHS降低大鼠缺血再灌注损伤中LDH、NSE的影响 |
| 3.4.6 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马组织病理学的影响 |
| 3.4.7 Ser188在NaHS减轻大鼠缺血再灌注损伤中海马神经细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 神经血管单位与缺血性脑中风关系 |
| 参考文献 |
（3）RhoA激酶2的硫巯基化修饰在外源性及内皮源性硫化氢抗大鼠神经细胞缺氧性损伤中的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1. 实验动物 |
| 2.2. 主要试剂和来源 |
| 2.3. 实验仪器 |
| 2.4. 实验方法和研究内容 |
| 2.4.1. 大鼠海马神经细胞原代培养及鉴定 |
| 2.4.2. 小鼠脑血管内皮细胞原代培养与鉴定 |
| 2.4.3. 硫巯基化蛋白的分离纯化 |
| 2.4.4. ROCK_2活性检测 |
| 2.4.5. 蛋白免疫印迹(Western blotting) |
| 2.4.6. H/R模型的建立和实验分组 |
| 2.4.7. 细胞活力检测 |
| 2.4.8. LDH和NSE活性检测 |
| 2.4.9. 细胞凋亡检测 |
| 2.4.10. 细胞H_2S含量检测 |
| 2.5. 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1. 外源性H_2S对大鼠海马神经细胞ROCK_2硫巯基化及其活性的影响 |
| 3.1.1. 原代海马神经细胞的培养与鉴定 |
| 3.1.2. 外源性H_2S对大鼠海马神经元ROCK_2蛋白表达和活性的影响 |
| 3.1.3. 外源性H_2S对大鼠海马神经细胞ROCK_2硫巯基化的影响 |
| 3.1.4. 外源性H_2S介导的硫巯基化对ROCK_2蛋白活性的影响 |
| 3.2. 内皮源性H_2S对大鼠海马神经细胞ROCK_2硫巯基化修饰及其活性的影响 |
| 3.2.1. 小鼠脑血管内皮细胞原代培养与鉴定 |
| 3.2.2. 内皮源性H_2S对大鼠海马神经细胞ROCK_2蛋白表达和活性的影响 |
| 3.2.3. 内皮源性H_2S对大鼠海马神经细胞ROCK_2硫巯基化的影响 |
| 3.2.4. 内皮源性H_2S介导的硫巯基化对ROCK_2蛋白活性的影响 |
| 3.3. 硫巯基化修饰对Na HS保护大鼠海马神经细胞H/R损伤的影响 |
| 3.3.1. 硫巯基化修饰对外源性H_2S提高大鼠海马神经细胞H/R损伤后细胞活力的影响 |
| 3.3.2. 硫巯基化修饰对外源性H_2S抑制大鼠海马神经细胞H/R损伤后LDH外漏的影响 |
| 3.3.3. 硫巯基化修饰对外源性H_2S抑制大鼠海马神经细胞H/R损伤后NSE活性的影响 |
| 3.3.4. 硫巯基化修饰对外源性H_2S抑制大鼠海马神经元H/R损伤后细胞凋亡 |
| 3.4. 硫巯基化修饰对内皮源性H_2S保护海马神经细胞H/R损伤的影响 |
| 3.4.1. 硫巯基化修饰对内皮源性H_2S提高大鼠海马神经细胞H/R损伤后细胞活力的影响 |
| 3.4.2. 硫巯基化修饰对内皮源性H_2S抑制大鼠海马神经细胞H/R损伤后LDH外漏的影响 |
| 3.4.3. 硫巯基化修饰对内皮源性H_2S抑制大鼠海马神经元H/R损伤后NSE活性的影响 |
| 3.4.4. 硫巯基化修饰对内皮源性H_2S抑制大鼠海马神经细胞H/R损伤后细胞凋亡的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 硫化氢介导的硫巯基化修饰研究进展 |
| 参考文献 |
（4）CSE源性H2S调控RhoA/ROCK通路对小鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞功能和神经损伤的作用研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分:CSE源性H_2S调控RhoA/ROCK信号通路对小鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和来源 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法与研究内容 |
| 2.1 实验试剂的配制 |
| 2.2 动物分组 |
| 2.3 脑缺血/再灌注模型的制备 |
| 2.4 激光散斑血流仪 |
| 2.5 Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验 |
| 2.6 旷场实验 |
| 2.7 动物组织的处理 |
| 2.8 HE染色 |
| 2.9 免疫蛋白印迹(Western Blot) |
| 2.9.1 脑组织蛋白的提取 |
| 2.9.2 蛋白定量及变性 |
| 2.9.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.10 免疫荧光双标 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 脑缺血再灌注小鼠的脑血流量的变化 |
| 4.2 CSE源性H_2S对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 4.2.1 CSE源性H_2S对小鼠脑缺血再灌注损伤后自发活动和探索行为的影响 |
| 4.2.2 CSE源性H_2S对小鼠脑缺血再灌注损伤后学习和记忆的影响 |
| 4.2.3 CSE源性H_2S对小鼠脑缺血再灌注后海马神经元损伤的影响 |
| 4.2.4 CSE源性H_2S对脑缺血再灌注后海马区脑组织中髓磷脂碱性蛋白(myelinbasic protein,MBP)、GFAP、RhoA和 ROCK_2蛋白表达的影响 |
| 4.3 ROCK抑制剂Fasudil对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 4.3.1 Fasudil对小鼠脑缺血再灌注损伤后自发活动和探索行为的影响 |
| 4.3.2 Fasudil对小鼠脑缺血再灌注损伤后学习和记忆的影响 |
| 4.3.3 Fasudil对小鼠脑缺血再灌注损伤后海马神经元损伤的影响 |
| 4.3.4 Fasudil对脑缺血再灌注后海马区脑组织中MBP、GFAP和ROCK_2蛋白表达的影响 |
| 4.3.5 NaHS和 Fasudil对脑缺血再灌注30d后星形胶质细胞反应性增殖的影响 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分:基于RhoA/ROCK通路研究H_2S对星形胶质细胞低氧损伤的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 药品和试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验试剂的配制 |
| 2.2 细胞培养及低氧模型的建立 |
| 2.3 实验分组 |
| 2.4 CCK-8法检测细胞活力 |
| 2.5 LDH试剂盒检测低氧培养细胞上清中LDH水平 |
| 2.6 荧光法检测细胞内钙离子水平变化 |
| 2.7 流式细胞术检测星形胶质细胞凋亡 |
| 2.8 免疫蛋白印迹(Western Blot)检测相关蛋白的表达 |
| 2.8.1 细胞总蛋白的提取 |
| 2.8.2 其余步骤 |
| 3 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 H_2S和Fasudil对于低氧培养后星形胶质细胞活力的影响 |
| 4.2 H_2S和Fasudil对于低氧培养后星形胶质乳酸脱氢酶的影响 |
| 4.3 H_2S和Fasudil对于低氧培养后星形胶质细胞内游离Ca~(2+)改变的影响 |
| 4.4 H_2S和Fasudil对低氧培养后星形胶质细胞凋亡的影响 |
| 4.5 H_2S和Fasudil对低氧培养星形胶质细胞中RhoA、ROCK_1和ROCK_2蛋白表达的影响 |
| 4.6 H_2S和Fasudil对低氧培养星形胶质细胞中GFAP蛋白表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 星形胶质细胞与脑缺血再灌注损伤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）右美托咪定对窒息大鼠心肺复苏后神经细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 右美托咪定对缺血缺氧后脑神经细胞凋亡和自噬影响的作用机制 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表论文 |
| 致谢 |
（6）电针对脑缺血大鼠SVZ区Nestin和PCNA表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一 内源性神经干细胞与脑缺血的研究进展 |
| 1 正常脑组织NSCs的表达 |
| 2 脑缺血后NSCs的表达 |
| 3 针灸对脑缺血后NSCs的影响 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 针灸治疗脑缺血的研究进展 |
| 1 中医对脑缺血的认识 |
| 2 针灸治疗脑缺血的临床疗效研究 |
| 3 针灸治疗脑缺血的机制研究 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验一 电针对脑缺血大鼠Nestin和PCNA表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 穴位选择 |
| 2.4 电针操作方法 |
| 2.5 取材 |
| 2.6 指标检测及方法 |
| 2.7 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 行为学结果 |
| 3.2 HE染色结果 |
| 3.3 Nestin免疫组化染色结果 |
| 3.4 PCNA免疫组化染色结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 脑缺血模型 |
| 4.2 选穴依据 |
| 4.3 观察部位选择 |
| 4.4 指标选择的意义 |
| 4.5 实验结果分析 |
| 实验二 电针对高血脂合并脑缺血大鼠Nestin和PCNA表达影响的探索 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物和分组 |
| 2.2 模型制备 |
| 2.3 穴位选择 |
| 2.4 电针操作方法 |
| 2.5 取材 |
| 2.6 指标检测及方法 |
| 2.7 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 行为学结果 |
| 3.2 血脂结果 |
| 3.3 HE结果 |
| 3.4 Nestin免疫组化结果 |
| 3.5 PCNA免疫组化结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 高血脂合并脑缺血模型 |
| 4.2 穴位选择依据 |
| 4.3 结果分析 |
| 综合讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）Neuritin基因在脑缺血再灌注损伤中的保护和修复作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要试剂 |
| 3.主要试剂配制 |
| 4.主要仪器设备 |
| 方法 |
| 1.Neuritin转基因阳性鼠的繁殖 |
| 2.Neuritin转基因阳性鼠的鉴定 |
| 3.Neuritin在 TGI后的时序表达检测 |
| 4.评估TGI后过表达的Neuritin对神经细胞的保护作用 |
| 5.检测过表达Neuritin对 TGI后神经细胞的再生修复能力的影响 |
| 6.行为学检测—水迷宫 |
| 7.统计学方法 |
| 结果 |
| 1.Neuritin转基因阳性鼠的繁殖 |
| 2.Neuritin转基因阳性鼠的鉴定 |
| 3.Neuritin在 TGI后的时序表达情况 |
| 4.TGI后过表达的Neuritin发挥对神经细胞的保护作用 |
| 5.过表达Neuritin增强TGI后的神经再生修复能力 |
| 6.Neuritin转基因小鼠改善TGI后的空间学习和记忆能力 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（8）右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注导致的局部及脑损伤的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 右美托咪定与羟考酮对肢体缺血再灌注患者保护效应的对比研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注局部肢体的保护效应 |
| 第一章 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注后肢体血流的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 探讨右美托咪定和羟考酮减轻下肢缺血再灌注损伤的机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 右美托咪定和羟考酮改善下肢缺血再灌注后骨骼肌线粒体功能 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注导致脑损伤的影响 |
| 第一章 右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注导致学习记忆功能受损的对比研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 右美托咪定和羟考酮对海马神经元s EPSC及下肢I/R后海马NR2B表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 炎症反应与认知功能障碍的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）Noggin蛋白对小鼠脑缺血再灌注损伤后行为能力、齿状回与海马修复及其作用机制的探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 略缩词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Noggin蛋白对脑缺血再灌注损伤的影响 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（10）胆碱能抗炎通路介导右美托咪定对脑缺血再灌注损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 不同剂量右美托咪定对缺血再灌注损伤大鼠海马神经元细胞的作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 胆碱能抗炎通路介导右美托咪定对脑缺血再灌注损伤的作用机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
四、缺血再灌注后对小鼠海马神经细胞凋亡的影响（论文参考文献）
- [1]舒血宁注射液在缺血性脑卒中预后的药效评价及作用机制研究[D]. 李志雄. 天津中医药大学, 2021(01)
- [2]H2S对RhoA的Ser188位点磷酸化的调节及其介导的大鼠脑缺氧/缺血性损伤的保护作用[D]. 陈野. 安徽医科大学, 2021(01)
- [3]RhoA激酶2的硫巯基化修饰在外源性及内皮源性硫化氢抗大鼠神经细胞缺氧性损伤中的作用[D]. 谢伟明. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]CSE源性H2S调控RhoA/ROCK通路对小鼠脑缺血再灌注后星形胶质细胞功能和神经损伤的作用研究[D]. 张阳. 安徽医科大学, 2021(01)
- [5]右美托咪定对窒息大鼠心肺复苏后神经细胞凋亡和自噬的影响及其机制研究[D]. 陆件. 苏州大学, 2021(06)
- [6]电针对脑缺血大鼠SVZ区Nestin和PCNA表达的影响[D]. 系梦琪. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]Neuritin基因在脑缺血再灌注损伤中的保护和修复作用的研究[D]. 万科幸. 石河子大学, 2020(08)
- [8]右美托咪定和羟考酮对下肢缺血再灌注导致的局部及脑损伤的影响[D]. 程文杰. 河北医科大学, 2020(01)
- [9]Noggin蛋白对小鼠脑缺血再灌注损伤后行为能力、齿状回与海马修复及其作用机制的探讨[D]. 龙婷婷. 贵州医科大学, 2020(04)
- [10]胆碱能抗炎通路介导右美托咪定对脑缺血再灌注损伤的保护作用[D]. 牛莉. 山东大学, 2020(12)