一、套式PCR检测细菌16SrRNA基因（论文文献综述）
崔艳芳[1]（2020）在《恒河猴肠道菌群与白介素-17基本特征的研究》文中研究表明研究背景肠道粘膜覆盖面积广,是包括人类免疫缺陷病毒在内的大多数病原体入侵人体的门户。HIV-1感染导致肠道粘膜CD4+T淋巴细胞大量消耗,肠道粘膜屏障损坏,肠道菌群异常及微生物移位和持续的免疫活化。已有研究表明微生物移位会刺激免疫系统引起系统免疫活化,进一步加剧HIV患者体内炎症反应和疾病进展。此外,由于粘膜CD4+T淋巴细胞显着减少,Th17细胞被选择性地清除,作为Th17细胞的特征性细胞因子IL-17A在HIV/SIV感染的肠粘膜中表达异常。肠道菌群与粘膜Th17细胞形成密切相关,但是关于AIDS患者体内肠道菌群的改变与肠粘膜IL-17的改变有无关系鲜有报道。此外,IL-17A和IL-17F在自身免疫病、感染与免疫中具有重要的作用,但是相关研究结果大都是在小鼠模型中得到的,恒河猴作为人类疾病特别是HIV研究中非常关键的实验动物模型,可以在艾滋病相关肠道菌群改变与IL-17改变之间的关系研究和其它IL-17相关疾病研究中发挥重要作用,但是关于恒河猴IL-17A和IL-17F的生物学特性及肠道菌群的基本特征目前仍然知之甚少。为此,本研究系统地分析了恒河猴直肠粪便菌群多样性、物种组成和相对丰度及功能基因;比较了恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴直肠粪便菌群在多样性、物种组成及相对丰度和预测功能基因等方面的差异;探讨了直肠免疫接种、口服万古霉素和SHIV/SIV感染等外界因素对肠道菌群的影响;鉴定了恒河猴IL-17A和IL-17F的分子特征及生物学特性,并对肠道菌群与IL-17A和IL-17F mRNA水平的相关性进行了初步分析。研究方法1.建立16S rRNA基因V4区深度测序方法,对20份恒河猴、21份食蟹猴和20份非洲绿猴的直肠粪便样本、197份免疫接种实验恒河猴直肠洗液样本、30份口服万古霉素实验恒河猴直肠粪便样本及10份SHIV/SIV感染恒河猴十二指肠粘膜组织样本中的16S rRNA基因V4区进行深度测序,利用QIIME2、PICRUSt和STAMP软件进行生物信息学分析。2.通过实时荧光定量RT-PCR方法检测正常恒河猴PBMC中、正常和口服万古霉素恒河猴直肠粘膜中及正常和SHIV/SIV感染恒河猴十二指肠粘膜中IL-1 7A和IL-1 7F的mRNA的水平,利用统计学方法分析肠道菌群与IL-17A和IL-1 7F mRNA水平之间的相关性。3.采用实时荧光定量PCR方法,检测恒河猴、食蟹猴和非洲绿猴直肠粪便中 SFB（segmented filamentous bacteria）和 BCCT（Butyryl-Co A:acetate Co A-transferase）基因的水平,利用统计学方法分析三种猴直肠粪便肠道菌群与SFB和BCCT基因水平之间的相关性。4.建立体外分离恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴粪便菌群的方法,利用实时荧光定量RT-PCR的方法检测体外分离的恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴的粪便菌群对紧密连接相关基因、炎症因子和促炎因子表达水平的影响。5.采用RACE方法,克隆恒河猴IL-17A和IL-17F的cDNA,测序获得恒河猴IL-17A和IL-17F的cDNA全长;运用实时荧光定量RT-PCR的方法分析了IL-17A和IL-17F mRNA分子在正常恒河猴组织中的表达分布;通过原核表达、纯化以及去除内毒素,获得了纯化的具有功能活性的重组恒河猴IL-17A和IL-17F蛋白并检测生物学活性。6.统计分析肠道菌群不同组之间多样性和物种组成相对丰度的定量比较分别采用Mann-Whitney test、ANOSIM分析和Welch’s t-test;荧光定量数据分析采用Mann-Whitney test 和 unpaired two-tailed t test;相关性分析采用非参数检验Spearman test,P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果1.恒河猴直肠粪便菌群的优势菌门为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）;优势菌科为普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、胃瘤菌科（Ruminococcaceae）、[Paraprevotellaceae]、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）;优势菌属为普雷沃氏菌属（Prevotella）、颤螺菌属（Oscillospira）、[Prevotella]、链球菌属(Streptococcus 和柔嫩梭菌属（Faecalibacterium）;优势菌种为 Prevotella copri、Streptococcus luteciae、Faecalibacterium prausnitzii 和 Prevotella stercorea。进一步分析发现,性别会影响恒河猴直肠粪便菌群的物种组成及相对丰度和功能基因,而分组大小会影响观察到的组间差异。此外,恒河猴粪便菌群的优势菌门与人类粪便菌群一致（均为拟杆菌门和厚壁菌门）,在优势菌科和优势菌属方面略有差异,拟杆菌科（Bacteroidaceae）和拟杆菌属（Bacteroides）分别为人类粪便菌群中的优势菌科和优势菌属。2.恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴直肠粪便菌群的优势菌门、菌科、菌属和菌种完全一致。此外,性别会影响食蟹猴和非洲绿猴直肠粪便菌群的物种组成及相对丰度和功能基因。3.恒河猴直肠粪便菌群α多样性最高。恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴的直肠粪便菌群虽然优势菌群一致,但是相对丰度差异显着。恒河猴组厚壁菌门相对丰度最高,而非洲绿猴组拟杆菌门相对丰度最高。在直肠粪便菌群预测的功能基因方面,恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴差异显着。恒河猴组在与转运蛋白（Transporters）和ABC转运蛋白（ABC transporters）有关的通路的功能基因表达水平最高,而非洲绿猴组在脂多糖的生物合成（Lipopolysaccharide biosynthesis）和脂多糖蛋白的生物合成（Lipopolysaccharide biosynthesis proteins）有关的通路的功能基因表达水平最高。4.恒河猴直肠粪便中SFB DNA水平显着低于食蟹猴组,略高于非洲绿猴组;恒河猴组BCCT DNA水平低于非洲绿猴组和食蟹猴组,但在统计学上差异不显着。体外分离的恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴直肠粪便菌群对紧密连接相关基因的表达水平影响不大;但是在诱导炎症因子表达方面,非洲绿猴直肠粪便菌群的诱导水平最低。5.直肠免疫接种疫苗可能会影响恒河猴肠道菌群多样性;增加Bacteroidetes的相对丰度,降低Firmicutes的相对丰度;与核苷酸代谢和蛋白合成有关的通路的功能基因显着增多。口服万古霉素可能会影响恒河猴直肠粪便菌群多样性;降低Bacteroidetes的相对丰度,增加Firmicutes的相对丰度;并且与ABC转运蛋白和转运蛋白有关的通路的功能基因显着增多。SHIV/SIV感染对恒河猴十二指肠粘膜肠道菌群多样性影响不大;但显着降低了Anaerovibrio、Parabacteroides、Gemmiger、Dialister、Methyloversatilis 和 Prevotella copri 的相对丰度;并且与金黄色葡萄球菌感染、脂质蛋白生物合成、氨基酸代谢和能量代谢有关的通路的功能基因显着增多。6.恒河猴IL-17A cDNA 全长 1283bp（43 bp-5’UTR,468 bp-ORF 和 772 bp-3’UTR）,恒河猴IL-1 7F cDNA 全长 820bp（72bp-5’UTR,492bp-ORF 和256bp-3’UTR）。通过匹配基因组发现,恒河猴LL-17A和IL-17F基因都含有三个外显子和两个内含子,位于第4号染色体上,并且二者处在相邻的位置。通过氨基酸序列比对,发现恒河猴IL-1 7A基因的cDNA核苷酸序列、氨基酸序列与人IL-1 7A的相似性分别为95.79%和96.8%;恒河猴IL-1 7F基因的cDNA核苷酸序列、氨基酸序列与人IL-1 7F的相似性分别为96.23%和93.9%。不仅如此,与恒河猴IL-17A和IL-1 7F的结构和功能密切相关的保守位点如半胱氨酸和氨基酸糖基化位点均与人IL-17A和IL-1 7F一致。7.恒河猴IL-17A mRNA和IL-17F mRNA在淋巴结、胸腺、脾脏、扁桃体及肠道组织中高水平表达;在心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胰腺等器官中IL-1 7F mRNA比IL-174 mRNA表达水平高;在支气管和阴道中也能检测到高水平的IL-1 7A mRNA 和IL-17F mRNA。8.通过体外刺激Caco-2细胞,发现体外表达的恒河猴IL-17A和IL-17F蛋白能通过招募Act1分子激活下游信号分子NF-κB-p65发生Ser529磷酸化;诱导抗菌肽（β-defensin 2、S8100A、S100A9、RegⅢα和Muc1）表达;诱导紧密连接蛋白相关基因（CLDN1、CLDNA OCLN和ZO-1）表达。通过体外刺激THP-1细胞,发现体外表达的恒河猴IL-17A和IL-17F蛋白能促进促炎细胞因子的释放（1L-6 和 TNF-α）。9.恒河猴PBMC中IL-17F mRNA水平与直肠粪便菌群中Fibrobacteres的相对丰度呈显着正相关;恒河猴十二指肠粘膜中IL-17F mRNA水平与Bacteroidetes的相对丰度呈显着负相关,与Cyanobacteria的相对丰度呈显着正相关;恒河猴直肠粘膜中IL-17A mRNA水平与Bacteroidetes的相对丰度呈正相关,与Firmicutes的相对丰度呈负相关,但统计学差异不显着。结论恒河猴粪便菌群优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门,与人类粪便菌群的优势菌门一致,在优势菌科和菌属方面存在略微差异;恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴直肠粪便菌群在多样性、物种组成及相对丰度、预测的功能基因和体外功能方面差异显着。此外,直肠免疫接种疫苗、口服万古霉素和SHIV/SIV感染都会对恒河猴肠道菌群造成一定影响。恒河猴IL-17A和IL-1 7F在序列特征、组织分布方面与人IL-17A和IL-17F高度相似,重组恒河猴IL-17A和IL-17F蛋白具有活化上皮细胞NF-κB-p65信号分子、上调抗菌肽表达、诱导紧密连接蛋白相关基因的表达并促进促炎细胞因子释放的功能。此外,PBMC及肠道粘膜组织中IL-17F mRNA和IL-17A mRNA水平与肠道菌群存在相关性。这些研究结果表明恒河猴具有与人相似的优势肠道菌群并且恒河猴IL-17A和IL-17F蛋白与人IL-17A和IL-17F蛋白生物学活性高度相似,为深入研究HIV/AIDS中肠道菌群与IL-17的作用机制,测试干预肠道菌群及靶向IL-17在HIV/AIDS治疗中的效果等奠定了必要的基础。
陈夏[2]（2020）在《肠道菌群失调介导的细菌移位在子痫前期发生中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景与目的子痫前期（Preeclampsia,PE）是以妊娠20周后出现血压升高和蛋白尿,同时伴随心血管、肝、肾等多脏器功能受损为特征的一组妊娠期特异性症候群。目前,临床上针对PE的预防和筛查仍缺乏有效的措施,往往在孕妇妊娠中、晚期出现相应的临床症状后才采取对症治疗,引起孕产妇及新生儿预后不良。PE的发病机制尚不明确,当前研究多认为其发生与免疫功能、环境因素、遗传因素、营养状况、致病微生物及精神因素等多种因素有关。人体肠道菌群密切参与营养、代谢、免疫、应激等众多生理过程,易受宿主健康状态、环境和饮食结构等因素的调控,对维持机体健康发挥着重要作用。肠道菌群失调与代谢性疾病、免疫性疾病等多种疾病存在密切的关联,是疾病发生和发展的重要危险因素。妊娠期肠道菌群的变化,通过调节母体免疫、代谢功能,参与妊娠期糖尿病、PE、肥胖等妊娠并发症的发生,对母婴健康产生深远影响。研究发现PE患者与健康孕妇孕晚期的肠道微生物在组成结构上明显不同,布劳特氏菌属（Blautia）和具核梭杆菌属（Fusobacterium）的丰度增加,阿克曼氏菌属（Akkermansia）和柔嫩梭菌属（Faecalibacterium）的丰度下降,且这种改变与PE的发生及发展相关。但是,不同研究所呈现的PE特征菌谱不同,没有均一性,且病例数有限,缺乏不同亚型间肠道菌群的比较。本研究扩大样本量,通过开展PE患者和健康对照者（NP）的病例对照研究,利用16S rRNA测序的方法对两组人群的肠道菌群结构进行分析,以期获得PE患者的肠道菌群特征谱;同时利用多种方法鉴定胎盘中微生物的有无,并分析PE胎盘菌群的结构特征;最后通过粪菌移植实验（FMT）在体内验证肠道菌群紊乱对PE发病的影响,探明其与PE的因果关系。研究内容与方法1.肠道微生态群落结构特征与PE的相关性研究（1）随机选取67例PE和85例NP孕妇作为研究对象,收集其粪便样品和临床资料。（2）通过对细菌16S rRNA基因进行高通量测序,对比分析PE和NP孕妇肠道菌群结构的多样性。（3）利用生物信息学方法探索与PE发生发展相关的关键微生物,并将显着差异的细菌、代谢功能通路与临床指标进行相关性分析。2.PE胎盘微生态群落结构特征（1）随机选取24例PE患者和22例NP作为研究对象,在无菌条件下采集胎盘样品。（2）使用荧光定量PCR检测PE和NP孕妇胎盘组织中的相对微生物量及具核梭杆菌属（Fusobacterium）的存在与否。（3）利用荧光原位杂交（ISH）可视化鉴定胎盘中的细菌信号。（4）通过高通量测序进一步鉴别胎盘菌群的存在,并分析PE胎盘菌群的结构特点。3.FMT验证肠道菌群失调与PE发病的因果关系（1）随机选取3名PE和3名NP孕妇作为供体,利用FMT在受体小鼠肠道中建立PE患者的肠道菌群,并利用高通量测序评估重建效果,FMT共持续62天。（2）通过酶联免疫吸附法（Elisa）测定受体小鼠粪便白蛋白、尿液白蛋白和血浆内毒素的含量。（3）利用荧光定量PCR检测受体小鼠小肠组织中Il1β、Ccl3、Cxcl1和Vegf细胞因子mRNA的表达水平,并通过流式细胞术检测受体小鼠小肠组织和脾脏中Treg和Th17细胞的表达水平。（4）使用荧光定量PCR、蛋白质印迹法（western Blot）和免疫组化技术（IHC）测定受体小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2、Claudin-4和Occludin的表达水平。（5）利用荧光定量PCR、ISH以及高通量测序检测受体小鼠的胎盘菌群,同时测定胎盘局部炎症因子的表达情况,并对两者进行关联分析。（6）监测FMT过程中受体小鼠的血压变化,测量胎鼠、胎盘生长发育情况。（7）通过HE染色观察受体小鼠胎盘和肾脏组织切片的病理形态,采用糖原染色（PAS）和IHC（α-SMA）评估胎盘螺旋动脉的重塑情况。结果1.与NP组相比,PE患者肠道菌群的α多样性显着下降,β多样性明显不同;在属水平上,PE组具核梭杆菌属（Fusobacterium）、韦荣氏菌（Veillonella）、梭菌属（Clostridium）和小杆菌属（Dialister）的丰度显着增加,而毛螺旋菌属（Lachnospira）、柔嫩梭菌属（Faecalibacterium）和阿克曼氏菌属（Akkmansia）等细菌的丰度则明显降低。2.相关性分析显示,Veillonella、Fusobacterium和收缩压、舒张压、尿蛋白和肝肾功能等指标显着正相关;而Akkermansia、Faecalibacterium同收缩压、舒张压和尿蛋白等指标呈负相关。3.PE胎盘的微生物量高于健康孕妇的胎盘,并且PE胎盘中Fusobacterium的检出率更高;ISH提示细菌信号主要存在与胎盘绒毛组织中,并且PE胎盘中的信号更多;16SrRNA测序提示胎盘菌群与阴性对照明显不同,且PE胎盘菌群与NP组区分明显,假单胞菌属（Pseudomonas）和水杆菌属（Enhydrobacter）等细菌的丰度较高。4.与接受NP孕妇粪菌（NP-FMT）的小鼠相比,接受PE孕妇粪菌（PE-FMT）的小鼠回肠末端组织中的Il1β、Ccl3、Cxcl1和Vegf细胞因子mRNA的表达水平明显升高,但肠组织的形态学结构无明显变化。5.与NP-FMT组相比,PE-FMT组小肠固有层组织中的Treg细胞（CD4+CD25+FoxP3+）数量明显降低,Thl7细胞（CD4+IL-17A+）数量明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。6.PE-FMT组与NP-FMT组相比,粪便白蛋白和血浆内毒素的含量具有统计学意义的上调（P<0.05）;同时结肠组织中的紧密连接蛋白ZO-I、ZO-2、Claudin-4和Occludin的表达水平显着下降,具有统计学差异（P<0.05）。7.与NP-FMT组相比,PE-FMT组胎盘组织中Il1β、IL6、Ccl3和Ccl4细胞因子mRNA的表达水平明显升高;同时PE-FMT组胎盘样品中的微生物量增多;并且胎盘中细菌的总量同Il1β、Il6、Ccl3和Ccl4呈明显正相关。8.与NP-FMT组相比,PE-FMT组小鼠收缩压在粪菌移植6周时即出现明显升高,妊娠期血压较妊娠前时进一步升高,妊娠第17天尿蛋白显着升高;PE-FMT组胎鼠重量、胎盘重量和胎鼠数明显降低,而胚胎吸收率显着升高;PE-FMT组胎盘迷路区结构紊乱,出现细胞坏死及胶原沉积,散在滋养细胞结节,影响血管分布及血运;PAS染色显示PE-FMT组胎盘系膜区螺旋动脉管壁的滋养细胞的数量减少,而IHC显示α-SMA+的血管平滑肌细胞显着增多。结论1.PE患者肠道菌群的微生物丰富度和多样性显着降低,其中Faecalibacterium和Akkermansia等益生菌的丰度明显较少,而Clostridium、Veillonella和Fusobacterium等机会致病菌的丰度明显升高。2.胎盘中存在着低微生物量的菌落,而PE胎盘中的微生物量高于NP胎盘,且含有独特的微生物群落。3.肠道菌群失调通过诱发免疫失衡和破坏肠道屏障功能,引起细菌移位至胎盘,进而激活胎盘局部异常的炎症反应,导致小鼠出现PE样症状。
韩杨[3]（2020）在《牛鼻腔微生物多样性分析及牛支原体RPA检测方法的建立》文中指出牛支原体（Mycoplasma bovis,M bovis）是牛肺炎的主要致病菌之一,此外,该菌还可引发乳腺炎、关节炎以及脑膜炎等多种疾病,严重威胁畜牧业生产。在如何控制上述疾病的传播和降低其造成经济损失的过程中,M bovis的快速、准确检测至关重要。本研究运用16S rRNA扩增子测序及宏基因组测序明确患呼吸道疾病牛的鼻腔微生物的组成和丰度,确定M.bovis的感染情况,并利用重组酶聚合酶扩增技术（recombinasepolymerase amplification,RPA）建立M.bovis的检测方法,对患病牛早检测、早发现、早隔离、早治疗及牛呼吸道等疾病的防控具有积极意义,可为畜牧业健康发展提供技术支持。本研究通过对宁夏地区临床样本进行16S rRNA扩增子测序及宏基因组测序分析,明确了 M.bovis是牛呼吸道疾病中的关键致病菌;建立了 M.bovis的Basic RPA、nfo RPA、exo RPA三种检测方法,并对临床样本进行了初步检测,获得了如下实验结果:（1）盲采宁夏地区5个规模化养殖场患有呼吸道疾病的牛鼻拭子（18个）,并以健康牛鼻拭子（1 1个）为对照组,通过16S rRNA多样性分析发现,患病组与健康组在牛鼻腔微生物的组成方面具有显着性差异,患病组区别于健康组的主要病原微生物为支原体属。（2）将上述样本进行宏基因组测序,通过KRONA分析,明确了造成患病组与健康组主要差异的病原微生物为M bovis。（3）生物信息学分析结合PCR技术,初步筛选了 LppA等8个用于检测M.bovis的特异性标识基因。（4）建立了基于LppA基因的M bovis Basic RPA检测方法,在39℃条件下,反应20 min,即可利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。该方法具有良好的特异性,与引起牛肺炎的其他相关致病菌无交叉反应,敏感性试验最低检测限度为6×101copies/μL,且具有良好的批内、批间重复性。（5）建立了基于LppA基因的M bovis nfo RPA检测方法,在39℃条件下,反应10 min,即可通过侧流层析试纸条进行检测,具有良好的特异性,敏感性试验最低检测限度为3×101 copies/μL,批内、批间重复性良好。（6）建立了基于LppA基因的M.bovis exo RPA检测方法,在39℃条件下,反应15 min,即可通过T16-ISO恒温荧光扩增仪检测,特异性良好,敏感性试验最低检测限度为6×102 copies/μL,具有良好的批内、批间重复性。（7）采集宁夏地区牛鼻拭子临床样本118份,使用本研究建立的三种M bovis检测方法对临床样本进行检测,并将检测结果与PCR检测结果相比较。分析发现,PCR检测的阳性率为 28%;M bovis Basic RPA、M bovis nfo RPA、M bovis exo RPA 检测的阳性率分别为29%、35%、33%,灵敏度均高于PCR。综上所述,本研究明确了患有呼吸道疾病的牛鼻腔微生物与健康牛鼻腔微生物的物种组成具有显着性差异,且M.bovis是造成患病组与健康组差异的主要微生物;建立了 Basic RPA、nfo RPA、exo RPA三种M.bovis检测方法,特异性强、敏感性高、重复性好,快速、简便、无需大型仪器设备,可为M.bovis的检测以及牛支原体病的防控提供技术支持。
王峰[4]（2019）在《云南省嗜吞噬细胞无形体分布情况调查及无形体表面蛋白MSP2原核表达》文中研究说明嗜吞噬细胞无形体（Anaplasmaphagocytophilum,AP）是一种新发的人畜共患病病原体,主要经蜱传播,其宿主谱十分广泛,包括人、家畜、野生动物。该病原感染人体引起的人粒细胞无形体病（Human granulocytic anaplasmosis,HGA）,可出现从发热到死亡不同程度的临床表现。AP目前已成为全球范围内一种危害公共健康的重要虫媒传染病原。云南省位于中国的西南边陲,地理气候条件复杂,独特的自然条件造就省内有害微生物和有害昆虫媒介种类多且密度大,加上各类宿主动物广泛分布,使云南省成为各类虫媒传染病的高发地区。蜱在云南省分布广泛且种类繁多,目前发现并确定的蜱类约有7属47种。因此蜱传播疾病在云南大部分地区普遍存在,严重影响人民群众健康。然而在云南对AP的研究起步较晚,在人群、动物宿主和蜱媒中AP的分布和流行情况还不甚明了。本课题拟在云南省开展系统的AP感染情况调查,并将其结果与全球类似研究进行综合比较,以期深入研究AP在云南的发生和流行情况,进而有效防控HGA暴发流行和保护家畜健康,为制定公共卫生安全政策提供信息。同时,为了从不同角度认识这一新现热带传染病,以AP主要表面膜蛋白MSP2作为微观研究的切入点。因为MSP2作为AP主要膜优势抗原蛋白不仅含量丰富,而且在AP逃避宿主免疫中扮演重要角色,也一直是各种宿主中检测诊断AP感染的主要抗原,多项研究提示MSP2可能与AP致病有关。利用基因工程技术获取重组MSP2蛋白,可为深入研究AP的致病、诊断、疫苗奠定基础。[目 的]在云南省系统地了解探查AP在人群、宿主动物和传播媒介蜱虫中感染和携带情况,掌握该病原体的流行特征和相关流行因素。同时,重组AP膜表面蛋白MSP2,为探索开发适宜于云南实际情况的AP诊断检测手段,深入研究AP致病机制和制备相关疫苗奠定基础。[方 法]于2017-2018年期间在云南省各地选点,采集不同人群血液样本、不同动物血清样本和传播媒介蜱虫样本,利用ELISA和/或IFA对人和动物血清样本进行AP抗体检测,并对结果进行统计学计算,分析得到云南人群AP血清阳性率和动物血清阳性率;针对不明原因发热病人中检测到的AP IgM阳性的病例,将其全血标本提取DNA后利用巢式PCR对AP的16SrRNA、msp2、groEL等基因进行扩增,扩增成功条带测序后制作系统发育树;蜱虫标本提取DNA后利用AP特异性引物进行qPCR来寻找蜱感染AP的分子学证据;利用R软件对全球各地区人群AP血清阳性率进行meta分析,并与本文得到云南人群AP血清阳性率相比较;利用基因工程技术,构建msp2-PET-30a质粒,诱导表达rMSP2蛋白,并对表达蛋白进行纯化和鉴定。[结果]1.在云南省人群血清学调查研究中,共收集云南省4个地区1430份血液样本,其中健康人群1185份,发热病人245份。健康人群检测出AP IgG阳性共90例,阳性率为7.59%,发热病人检测出AP IgM 阳性共11份,阳性率4.49%。且发现男性和女性AP血清阳性率分别为9.29%,5.96%,两者有统计学差异。51-60岁年龄段AP血清阳性率最高,达18.64%。来自云南南部的调查人群AP血清阳性率高于云南中北部和西部人群。从11份AP IgM 阳性的病人全血中提取DNA,所有DNA样本经巢式PCR成功扩增16SrRNA、msp2基因,其中以16SrRNA基因属特异引物Eh-gs扩增测序后构建的系统发育进化树,显示来源于云南河口和云南砚山的AP分离株序列差异性较小,而且与分离自朝鲜的人源分离株（MH482862.1）及分离自捷克传播媒介嗜群血蜱分离株（KY462782.1）的序列相似性极高。2.在云南省动物及蜱媒AP感染的分布调查中,从云南多地共采集到山羊、牛、猪和鸭子等动物血清样品364份,蜱虫样本273份。经ELISA检测牛、羊、猪,的AP血清阳性率分别为8.42%、10.34%和5.56%。各地区间的感染率无统计学差异。蜱虫样本经种类鉴定,共有微小扇头蜱273只,混池法提取DNA 108份,qPCR检测没有阳性扩增样本。3.在全球人群AP血清阳性率meta分析中有71篇文献符合标准,36809人纳入研究,目标人群包括健康人群,不明原因发热患者人群,高危人群,被蜱叮咬人群和蜱传疾病患者人群。纳入研究的文献来自全球29个国家,主要集中于三个大洲即亚洲、欧洲和美洲,各项研究中AP血清阳性率从0到66.3%不等。Meta分析的结果显示全球人群中AP的合并感染率为10.2%（95%CI8.3%-12.4%）,按照地区进行亚组分析的结果显示,亚洲地区人群的AP合并感染率最高为14.6%,95%CI（10.6%,19.2%）,按照研究人群进行亚组分析的结果显示,高危职业人群的AP合并感染率最高为14.1%。敏感性分析显示本研究的合并结果稳健。Begger检验和egger检验提示研究存在一定的发表偏倚。4.合成msp2基因序列成功构建于PET-30a质粒上,诱导表达出重组rMSP2蛋白,并确定最佳诱导表达条件为以IPTG浓度为1.0mmol/L在37℃C温度条件下诱导4h。通过SDS-PAGE和Western-Blot鉴定无误后,对蛋白进一步纯化,最后对重组纯化的蛋白进行质谱检测鉴定,确定为APMSP2蛋白。[结 论]1.在云南省人群中发现AP感染的血清学和分子学证据。2.云南存在HGA急性期病例,传播风险较高。3.云南省人群感染的AP菌株序列相似,有人兽共患风险。4.有必要在云南省开展更系统更广泛的动物及蜱虫感染AP情况调查。5.全球人群中AP合并血清阳性率为10.2%,meta研究显示异质性可能来源于高危人群、发热人群和欧洲地区的研究。云南省健康人群AP血清阳性率与全球健康人群相似。6.本实验获得的重组rMSP2蛋白可作为下一步对AP进行基础研究的物质基础。
王金花[5]（2019）在《犬、猫心丝虫病诊断和治疗及流行病学研究》文中研究指明犬、猫心丝虫病是由犬心丝虫感染引起的严重的致命的寄生虫病,主要由蚊子传播。在中国的海南省和一些滨海城市如深圳、杭州、上海,关于犬、猫心丝虫病的流行和分布很少有报道。本研究应用了抗原检测方法和两种PCR法检测了位于华南的海南省、深圳市和华东的上海市,杭州市的心丝虫感染情况和流行率。从2014年10月到2017年5月,共采集了未采取心丝虫防治措施的狗的1038份血样和猫的51份血样。其中869份狗血样和所有猫血样均采自海南岛,55份狗血样来自深圳,69份狗血样来自上海,45份狗血样来自杭州。所有狗血样采用商品化的诊断试纸条（Canine SNAP 4Dx Plus test kit,IDEXX,USA）进行抗原检测,心丝虫抗原检测的感染率海南为0.5%（4/869）,深圳为 0%（0/55）,上海为 1.5%（1/69）,杭州的感染率则为 0%（0/45）。所有的狗血样使用PCR方法检测心丝虫的16S rRNA基因和心丝虫专性共生体-沃尔巴克氏菌的表面蛋白（WSP）基因。通过扩增心丝虫虫体16S rRNA基因检测心丝虫的感染率其中海南为7.4%（64/869）,深圳为0%（0/55）,上海为1.5%（1/69）,杭州为0%（0/45）。通过扩增犬心丝虫沃尔巴克氏菌的WSP基因检测心丝虫的感染率海南犬感染率为5.3%（46/869）,深圳犬心丝虫感染率为0%（0/55）,上海的犬心丝虫感染率为1.5%（1/69）,杭州的心丝虫感染率为0%（0/45）。通过扩增心丝虫16S rRNA基因检测海南的猫心丝虫的感染率为9.8%（5/51）,而通过扩增心丝虫沃尔巴克氏菌的WSP基因检测海南猫心丝虫的感染率为5.9%（3/51）。当前研究表明,海南岛的犬猫存在心丝虫感染的现象,用PCR方法检测的流行率高于用抗原方法检测流行率,通过扩增心丝虫16S rRNA基因检测海南的心丝虫的感染率高于扩增沃尔巴克氏菌的状SP基因的结果。上海、杭州和深圳三个滨海城市犬心丝虫感染率较低。再通过扩增心丝虫16S rRNA基因调查海南省各市县的犬心丝虫的感染率和分布,心丝虫感染率从0%—25%不等。其中琼海市心丝虫感染率最高为25.00%,三亚次之,感染率为17.57%,再次是屯昌县,犬心丝感染率为12.5%,儋州感染率最低为3.5%,海口和文昌也都有不同程度的心丝虫感染,分别是6.9%和3.9%。在澄迈、临高、昌江、乐东和陵水也做了相应的调查,检测到阳性率均为0%。为了筛选更好的疫苗和诊断的候选基因,提供犬恶丝虫免疫相关蛋白,对犬心丝虫沃尔巴克氏菌WSP基因进行克隆、原核表达。以含有沃尔巴克WSP基因片段的犬全血总DNA为模板进行PCR扩增。目的基因连接至pMD18t载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。再将目的基因克隆至原核表达质粒PTYB12中,构建重组表达载体PTYB12-WSP,双酶切鉴定。将其转入大肠埃希菌（E.coli）BL21感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-R4GE）分析表达的重组蛋白,再进行透析纯化,获得重组蛋白。结果表明WSP基因片段PCR扩增产物约为750 bp,测序结果与cDNA文库中筛选得到的序列一致。重组表达载体PTYB12-WSP双酶切鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导后重组蛋白PTYB12-WSP表达,相对分子质量（Mr）约为750,与预期大小一致。本实验成功克隆并表达了犬恶丝虫WSP重组蛋白。阿福拉纳米尔贝肟咀嚼片（赛可信）咀嚼片是一种犬用口服抗体内外寄生虫药,临床用于预防和治疗犬跳蚤、蜱虫及胃肠道线虫和预防犬心丝虫感染。为探究赛可信咀嚼片对犬心丝虫的预防效果,并评估该产品的临床使用安全性。将135只犬设置为两种试验模型。一种是在控制环境条件下开展试验,其中受试药物组（赛可信）30只,对照药物组（大宠爱）30只,阴性不给药犬10只,阳性不给药犬6只。另一种在田间自然环境下开展试验,其中受试药物组（赛可信）30只,对照药物组30只（大宠爱）。在180天的实验周期内,分别在-6天、120天、150天、180天对实验犬只的心丝虫抗原检查、微丝蚴镜检以及实验室PCR检测,观察心丝虫病原体对实验犬的感染情况变化,以验证该药物对犬只心丝虫病的临床预防疗效。每个月进行安全评价,分别在第0天、120天和150天给药时,观察犬给药后的临床表现,并从赛可信和大宠爱组各随机挑选10只犬分别在试验前-6天、试验120天和150天采血,进行血常规和血液生化指标检测。结果表明试验进行到150天时,在环境控制实验组中,阴性不给药的犬只出现一只PCR检测犬心丝虫阳性犬,并在180天时,PCR结果再次确证。而其它实验组均未出现心丝虫阳性犬。在整个实验过程中所有犬只未出现临床异常状况,体温、呼吸和心率均在正常生理范围内波动,血常规和生化指标均在正常范围波动,与给药前无统计学差异。说明阿福拉纳米尔贝肟咀嚼片是一种安全有效的预防犬心丝虫感染的口服产品。
张莉,魏润生,康新华,王佳,王子坚,周峰,豆思远[6]（2017）在《家畜常见支原体检测方法的研究进展》文中认为支原体病给畜禽业造成严重的经济损失,是一直困扰畜禽业发展的重要疾病之一,对该病进行快速、准确检测,会为该病的综合防控提供参考。本文对畜禽常见支原体病检测方法的研究进展进行了综述。
赵杰,徐建义,隋兆峰,迟灵芝,杨明彩,沈美艳,韩春杨[7]（2015）在《鸡毒支原体套式PCR检测方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理为了建立鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）套式PCR检测方法并初步将其应用于临床检测,对目前常用的5对引物（gapA-F/gapA-R、16SrRNA-F/16SrRNA-R、mgc2-F1/mgc2-R1、mgc2-F2/mgc2-R2、LP-F/LP-R）检测MG的灵敏度进行了比较,从中选出灵敏度较强的引物建立套式PCR检测方法,同时进行了特异性、敏感性及临床检测试验。结果表明,以mgc2基因设计的引物灵敏度最高,能检测出的MG的最低质量浓度为57.6pg/μL,用此引物建立的套式PCR能够扩增的基因片段的大小为300bp,与GenBank中收录的相关序列的同源性为98%,而与大肠杆菌、沙门菌、鸡滑液囊支原体均无交叉反应,能够检测出DNA的最小质量浓度为0.18fg/μL。通过对山东地区疑似MG的50只病死鸡进行检测,阳性检出率为80%。本研究建立的鸡毒支原体套式PCR具有敏感性高、特异性强等优点,可用于MG的临床诊断和分子流行病学调查。
刘梦莹,许士奇[8]（2015）在《蜱传疾病实验检测方法研究进展》文中提出蜱是多种人畜共患传染病的重要传播媒介。由于近些年蜱传疾病有增加的趋势,一系列新的蜱媒传染病相继出现,蜱及蜱传疾病再次成为关注的焦点。本文综述了莱姆病（Lyme disease,LD）、森林脑炎（Tick-borne encephalitis,TBE）、人类粒细胞无形体病（Human Granulocytic Anaplasmosis,HGA）、Q热（Q fever）和斑点热（spotted fever）的检测方法,包括聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）,巢式PCR（nested PCR）和荧光定量PCR（RT-PCR）。
孟庆玲,乔军,盛金良,王俊伟,王为升,姚娜,陈创夫,张丽娟[9]（2012）在《古尔班通古特沙漠南缘蜱携带无形体的调查》文中研究表明为了解古尔班通古特沙漠南缘蜱携带无形体的状况,在该地域3个不同生境区域11个地点采集家畜寄生蜱标本,进行分类鉴定;运用套式PCR筛选无形体阳性蜱样本,并用半套式PCR扩增无形体科16SrRNA基因5′端高变区,进行克隆测序;将所获得的DNA序列与GenBank收录的序列作比对,并用Mega 5.0软件构建系统发育树,鉴定蜱携带无形体的种类。结果共采集708只蜱,鉴定为4个属8个种。在分类后的236份蜱样本中,检测出无形体阳性25份,阳性率为10.59%。序列比较发现,在亚洲璃眼蜱、血红扇头蜱、残缘璃眼蜱、长角血蜱中分别存在查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）、犬埃立克体（Ehrlichia canis）、边缘无形体（Anaplasma marginale）和绵羊无形体（Anaplasma ovis）的16SrRNA基因片段。研究结果证实在古尔班通古特沙漠南缘家畜寄生蜱中携带无形体,提示该地域可能是无形体病的自然疫源地。
高剑云,陈建忠,周坚红[10]（2010）在《采用套式PCR检测细菌性阴道病病原体加德纳菌及细菌耐药性测定》文中提出目的:了解阴道加德纳菌与细菌性阴道病之间的关系以及阴道加德纳菌对抗生素的耐药性。方法:建立套式PCR检测细菌性阴道病和非细菌性阴道病标本中阴道加德纳菌16S rDNA～23S rDNA基因片段,确定阴道加德纳菌感染与细菌性阴道病发病的相关性。采用K-B纸片法测定阴道加德纳菌临床菌株对15种临床常用抗生素的敏感性。结果:所建立的套式PCR检测阴道加德纳菌灵敏度高达1 ng DNA模板,对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌DNA扩增结果均为阴性。265例细菌性阴道病和107例非细菌性阴道病患者阴道分泌物标本中,套式PCR检测阴道加德纳菌的阳性率分别为55.5%和8.4%（P<0.05）。108株阴道加德纳菌均对亚胺培南和万古霉素敏感,85%以上菌株对头孢曲松、头孢唑啉、头孢噻肟、氨苄青霉素、羧苄青霉素和四环素敏感,但40%以上菌株对复方新诺明、甲硝唑、环丙沙星、链霉素和庆大霉素耐药。结论:本研究中建立的套式PCR可敏感和特异地检测阴道加德纳菌。阴道加德纳菌感染与细菌性阴道病密切相关。阴道加德纳菌对不同的临床常用抗生素耐药性有很大差异。
二、套式PCR检测细菌16SrRNA基因（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、套式PCR检测细菌16SrRNA基因（论文提纲范文）
（1）恒河猴肠道菌群与白介素-17基本特征的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 恒河猴肠道菌群的基本特征 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第二部分 恒河猴与食蟹猴和非洲绿猴肠道菌群的比较 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第三部分 直肠免疫接种疫苗、口服抗生素和免疫缺陷病毒感染对恒河猴肠道菌群的影响 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第四部分 恒河猴白介素17基本特征及与肠道菌群的相关性 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HIV-1感染之后肠道菌群的变化 |
| 参考文献 |
| 个人基本情况 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（2）肠道菌群失调介导的细菌移位在子痫前期发生中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 肠道微生态群落结构特征与子痫前期的相关性研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 子痫前期胎盘微生态群落结构特征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 肠道菌群失调在子痫前期发病中的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表论文情况 |
| 主要中英文缩略词表 |
| 致谢 |
（3）牛鼻腔微生物多样性分析及牛支原体RPA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛支原体概述 |
| 1.1.1 牛支原体的发现 |
| 1.1.2 牛支原体的特征 |
| 1.1.3 牛支原体的流行情况 |
| 1.1.4 牛支原体与无乳支原体的相似性 |
| 1.2 牛支原体检测方法的研究进展 |
| 1.2.1 分离培养法 |
| 1.2.2 血清学检测 |
| 1.2.3 分子生物学检测 |
| 1.3 微生物多样性的研究进展 |
| 1.3.1 16S rRNA扩增子测序及应用 |
| 1.3.2 宏基因组测序及应用 |
| 1.3.3 多样性分析在牛呼吸道菌群中的应用 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 牛鼻腔微生物多样性分析 |
| 2.1 实验样本 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样本采集 |
| 2.2.2 检测流程 |
| 2.2.3 数据处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同组别牛鼻腔微生物的丰富度与多样性 |
| 2.3.2 不同组别牛鼻腔微生物组成分布 |
| 2.3.3 不同组别牛鼻腔微生物组间差异分析 |
| 2.3.4 宏基因组测序分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛支原体RPA检测方法的建立 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 牛肺炎相关致病菌基因组DNA提取及PCR鉴定 |
| 3.2.2 牛支原体特异性标识基因的筛选及PCR鉴定 |
| 3.2.3 牛支原体Basic RPA检测方法的建立 |
| 3.2.4 牛支原体nfo RPA检测方法的建立 |
| 3.2.5 牛支原体exo RPA检测方法的建立 |
| 3.2.6 牛支原体三种RPA检测方法的临床应用 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 牛肺炎相关致病菌菌种PCR扩增结果 |
| 3.3.2 牛支原体特异性标识基因PCR扩增结果 |
| 3.3.3 牛支原体Basic RPA检测方法的建立 |
| 3.3.4 牛支原体nfo RPA检测方法的建立 |
| 3.3.5 牛支原体exo RPA检测方法的建立 |
| 3.3.6 牛临床样本的检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）云南省嗜吞噬细胞无形体分布情况调查及无形体表面蛋白MSP2原核表达（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一. 立克次体目病原体 |
| 二. 嗜吞噬细胞无形体 |
| 1. 嗜吞噬细胞无形体的发现与分类 |
| 2. 嗜吞噬细胞无形体病原学 |
| 2.1 形态 |
| 2.2 基因组特征 |
| 2.3 代谢特征 |
| 2.4 生活史 |
| 2.5 培养 |
| 3. 嗜吞噬细胞无形体的流行 |
| 3.1 传播媒介 |
| 3.2 宿主动物 |
| 三. 嗜吞噬细胞无形体的致病性 |
| 1. 所致疾病 |
| 2. 致病机制 |
| 四. 本课题研究思路及创新点 |
| 第一部分 云南省人群嗜吞噬细胞无形体感染情况调查 |
| 引言 |
| 一. 云南省人群嗜吞噬细胞无形体血清流行病学调查 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 二. 云南省人群嗜吞噬细胞无形体分子流行病学调查 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 云南省动物及蜱媒感染嗜吞噬细胞无形体情况初探 |
| 一. 云南省动物感染嗜吞噬细胞无形体血清流行病学调查 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 二. 云南省蜱媒感染嗜吞噬细胞无形体情况调查 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 全球人群嗜吞噬细胞无形体血清阳性率meta分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 嗜吞噬细胞无形体表面蛋白MSP2原核表达 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 目标人群采集血样信息登记表 |
| 附录2 Eh-gs扩增片段测序结果 |
| 附录3 蜱虫提取DNA记录表（部分） |
| 附录4 全球血清阳性率meta分析按人群分类和按地区分类亚组分析 |
| 附录5 msp2基因合成序列及PET-30a图谱 |
| 附录6 重组rMSP2蛋白质谱检测结果 |
| 附录7 实验中主要使用仪器 |
| 附录8 实验中主要试剂及配制方法 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）犬、猫心丝虫病诊断和治疗及流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 犬心丝虫病在中国的流行分布 |
| 第二章 心丝虫共生体-沃尔巴克氏体的研究进展 |
| 第三章 心丝虫诊断方法的研究进展 |
| 3.1 微丝蚴虫体检测 |
| 3.2 免疫学诊断方法 |
| 3.3 分子生物学方法 |
| 第四章 犬心丝虫预防治疗方法的研究进展 |
| 4.1 药物预防治疗 |
| 4.2 外科治疗 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 犬猫心丝虫病不同检测方法的比较研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 动物的选择和血样的采集 |
| 1.2 血清学的检测 |
| 1.3 血液总DNA的提取 |
| 1.4 不同基因PCR检测 |
| 1.4.1 犬心丝虫16S rRNA基因PCR检测 |
| 1.4.2 犬心丝虫沃尔巴克氏菌基因PCR检测 |
| 1.5 测序 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同基因PCR扩增结果 |
| 2.2 犬心丝虫沃尔巴克体氏菌FtsZ基因亲缘性分析结果 |
| 2.3 三种不同检测方法检测犬猫心丝虫病的效果比较研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PCR检测心丝虫16SrRNA基因和沃尔巴克氏菌基因 |
| 3.2 FtsZ基因亲缘性分析结果讨论 |
| 3.3 三种不同检测方法检测犬猫心丝虫病的效果比较研究 |
| 第二章 海南和其它三个滨海城市犬猫心丝虫感染流行情况调查 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 调查对象和样本量 |
| 1.2 血液总DNA的提取 |
| 1.3 犬心丝虫16S rRNA基因PCR检测 |
| 1.4 测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同饲养方式犬群和海南及其它三个滨海城市犬心丝感染率调查 |
| 2.2 海南不同的市县犬、猫心丝虫感染率调查 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同饲养方式犬群和海南及其它三个滨海城市犬心丝感染率调查 |
| 3.2 海南不同的市县犬、猫心丝虫感染率调查 |
| 第三章 犬心丝虫内共生体沃尔巴克氏菌WSP基因的克隆与原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 PCR扩增目的基因及连接克隆载体 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 1.2.4 目的基因的诱导表达 |
| 1.2.5 重组蛋白纯化(透析) |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒PTYB12-WSP的鉴定 |
| 2.2 重组质粒的诱导表达 |
| 2.3 重组蛋白纯化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 阿福拉纳米尔贝肟(赛可信)对犬心丝虫病预防效果和安全性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及分组 |
| 1.1.1 来源 |
| 1.1.2 品种和数量 |
| 1.1.3 病例入选标准 |
| 1.1.4 试验分组 |
| 1.1.5 病例淘汰 |
| 1.1.6 动物剖检 |
| 1.2 心丝虫检测方法 |
| 1.2.1 爱得士(IDEXX SNAP~(?) 4DXTM plus)试剂盒检测法 |
| 1.2.2 分子生物学检测方法(PCR法) |
| 1.2.3 微丝蚴镜检法 |
| 1.3 试验药物 |
| 1.3.1 受试药物和对照药物及来源 |
| 1.3.2 给药方案 |
| 1.4 观察指标 |
| 2 实验结果与分析 |
| 2.1 赛可信对犬心丝虫感染预防效果药效学研究 |
| 2.1.1 第-6天使用不同检测方法检测135只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.1.2 第120天不同检测方法检测70只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.1.3 第150天不同检测方法检测130只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.1.4 第180天不同检测方法检测130只实验犬心丝虫感染情况 |
| 2.2 阿福拉纳米尔贝肟安全性评价实验 |
| 2.2.1 一般临床检查结果 |
| 2.2.2 实验犬血常规指标检测结果 |
| 2.2.3 血液生化学检查结果 |
| 2.3 实验结果分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五章 总结、创新与展望 |
| 1 主要结论 |
| 1.1 结论1 |
| 1.2 结论2 |
| 1.3 结论3 |
| 1.4 结论4 |
| 2 创新之处 |
| 3 建议与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）家畜常见支原体检测方法的研究进展（论文提纲范文）
| 1 分离培养检测 |
| 2 血清学检测 |
| 3 分子生物学检测 |
（7）鸡毒支原体套式PCR检测方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料及菌株 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 鸡毒支原体菌体培养 |
| 1.4 PCR模板的制备 |
| 1.5 引物的设计 |
| 1.6 不同引物的敏感性比较 |
| 1.7 套式PCR方法的建立 |
| 1.8 PCR的特异性试验 |
| 1.9 PCR的敏感性试验 |
| 1.1 0 临床应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同引物的灵敏性检测 |
| 2.2 套式PCR检测方法的建立 |
| 2.3 PCR的特异性试验 |
| 2.4 PCR的敏感性试验 |
| 2.5 临床应用 |
| 3 讨论 |
（8）蜱传疾病实验检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 莱姆病(Lyme disease,LD) |
| 2 森林脑炎(Tick-borne encephalitis,TBE) |
| 3 人 类 粒 细 胞 无 形 体 病 (Human Granulocytic Anaplasmosis,HGA) |
| 4 Q热(Q fever) |
| 5 斑点热(spotted fever) |
（9）古尔班通古特沙漠南缘蜱携带无形体的调查（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样本采集地自然概况 |
| 1.2 蜱采集地点的设置及分类 |
| 1.3 样品采集、分类和鉴定 |
| 1.4 从蜱标本中提取DNA |
| 1.5 PCR扩增 |
| 1.6 PCR产物的克隆与序列测定 |
| 1.7 16S rRNA基因序列比对与系统发生分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 古尔班通古特沙漠南缘不同生境条件下蜱种类 |
| 2.2 不同蜱种样本中的无形体套式PCR及半套式PCR检测结果 |
| 2.3 16S rRNA基因高变区序列测定与分析 |
| 2.4 无形体科16S rRNA基因5′末端高变区系统发生分析 |
| 3 讨论 |
（10）采用套式PCR检测细菌性阴道病病原体加德纳菌及细菌耐药性测定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 标本采集 |
| 1.3 质控菌株 |
| 1.4 革兰染色镜检线索细胞 |
| 1.5 pH检测与BV试验 |
| 1.6 细菌分离及培养 |
| 1.7 套式PCR |
| 1.7.1 DNA模板提取 |
| 1.7.2 引物合成与PCR |
| 1.8 药敏试验 |
| 1.9 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 BV和NBV发病率 |
| 2.2 套式PCR灵敏度和特异性 |
| 2.3 细菌分离培养及套式PCR检测阳性率 |
| 2.4 药敏试验结果 |
| 3 讨论 |
四、套式PCR检测细菌16SrRNA基因（论文参考文献）
- [1]恒河猴肠道菌群与白介素-17基本特征的研究[D]. 崔艳芳. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [2]肠道菌群失调介导的细菌移位在子痫前期发生中的作用及机制研究[D]. 陈夏. 南方医科大学, 2020(01)
- [3]牛鼻腔微生物多样性分析及牛支原体RPA检测方法的建立[D]. 韩杨. 宁夏大学, 2020(03)
- [4]云南省嗜吞噬细胞无形体分布情况调查及无形体表面蛋白MSP2原核表达[D]. 王峰. 昆明医科大学, 2019(06)
- [5]犬、猫心丝虫病诊断和治疗及流行病学研究[D]. 王金花. 海南大学, 2019(06)
- [6]家畜常见支原体检测方法的研究进展[J]. 张莉,魏润生,康新华,王佳,王子坚,周峰,豆思远. 畜牧兽医杂志, 2017(05)
- [7]鸡毒支原体套式PCR检测方法的建立及应用[J]. 赵杰,徐建义,隋兆峰,迟灵芝,杨明彩,沈美艳,韩春杨. 中国兽医科学, 2015(07)
- [8]蜱传疾病实验检测方法研究进展[J]. 刘梦莹,许士奇. 中国病原生物学杂志, 2015(01)
- [9]古尔班通古特沙漠南缘蜱携带无形体的调查[J]. 孟庆玲,乔军,盛金良,王俊伟,王为升,姚娜,陈创夫,张丽娟. 中国兽医学报, 2012(08)
- [10]采用套式PCR检测细菌性阴道病病原体加德纳菌及细菌耐药性测定[J]. 高剑云,陈建忠,周坚红. 中国卫生检验杂志, 2010(05)