一、人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定（论文文献综述）
周伟杰,吴凤梅,姚冬生,谢春芳[1]（2021）在《通过毕赤酵母表达系统获得高纯度的重组人血管内皮生长因子（rhVEGF165）》文中研究说明血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF165）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子,高纯度的VEGF165对于抗肿瘤药物和生物标志物研发检测试剂必不可少。目前关于VEGF165的异源表达方法,纯化步骤多且产物纯度不高。以毕赤酵母表达系统为基础,构建人血管内皮生长因子（VEGF165）多拷贝的表达载体。按照酵母密码子偏好性优化人血管内皮生长因子基因（vegf165）的密码子,在毕赤酵母BBPB表达载体基础上,用Biobrick生物积块的方法,构建以Pgap为启动子的五拷贝rh VEGF165表达载体,同时添加组氨酸标签。利用His标签和VEGF165自身的肝素结合结构域,仅用两步亲和层析纯化得到纯度高于98%的rh VEGF165蛋白。rh VEGF165纯化后浓度为0.45 mg/m L,且具有生物学活性。该异源表达策略简化了rh VEGF165的纯化步骤,rh VEGF165具有天然VEGF165的生物学活性,且纯度达到目前文献报道的最高水平。
张苗苗[2]（2020）在《基于原子力显微镜研究生物分子间相互作用及细胞表面性质》文中研究表明原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）具有高分辨率和超灵敏等特点,已发展成为在近生理条件下研究生物分子和活细胞表面性质的有力工具。它不仅可以用于表征样品的表面形貌特征,而且能够定量测定生物分子间相互作用、细胞表面蛋白与相应配体分子间的相互作用以及细胞弹性模量等力学性质。本论文基于AFM主要进行了以下几个方面的研究:1.基于AFM的单分子力谱技术结合分子动力学（MD）模拟研究了血管内皮生长因子（VEGF165）与肝素分子间的特异性相互作用。通过单分子力谱实验,得到了 VEGF165/肝素复合物的解离力,以及解离过程的热力学和动力学参数。VEGF165/肝素复合物的MD模拟结果显示,氢键和疏水相互作用在VEGF165蛋白和肝素之间的相互作用中起到了积极作用。根据MD模拟轨迹,采用分子力学Poisson-Boltzmann溶剂可及表面积（MM-PBSA）方法计算了VEGF165/肝素复合物的结合自由能。本研究为了解VEGF165蛋白和肝素分子之间的相互作用机制提供了新的见解。2.基于AFM的峰值力轻敲技术研究活的血管内皮细胞（HUVEC）的生物力学特性,评估了三七总皂苷（PNS）对单细胞氧化应激损伤的保护机制。结果表明,PNS可有效防止氧化应激损伤引起的细胞杨氏模量降低,帮助细胞维持基本的形态和生理功能。结合免疫荧光分析,我们认为提高细胞骨架的稳定性是PNS在氧化损伤过程中对HUVEC起保护作用的一条重要途径。本研究为探索中药在单细胞水平上的作用机制提供了新思路,揭示了 AFM在药物作用机理研究中的巨大潜力。3.基于AFM的定量纳米力学成像技术研究了膀胱癌T24细胞在上皮间质转化（EMT）过程中形貌、力学性质和细胞表面的肿瘤标志物分子——E-钙粘蛋白的变化特征。结果显示,与正常膀胱上皮细胞相比,T24细胞具有部分间质特征,且TGF-β1可以诱导T24细胞持续发生EMT。在EMT过程中,T24细胞内的细胞骨架重排和F-肌动蛋白形成,引起了细胞形貌和力学性能的变化。同时,利用分子识别成像技术定量表征了 EMT过程中T24细胞表面微量的E-cadherin的表达变化,展现了 AFM在细胞表面微量蛋白表征方面的应用前景。这项工作在单分子、单细胞水平上加强了我们对膀胱癌细胞EMT过程的认识,使我们对肿瘤细胞转移有了更深入的了解。
李哲[3]（2020）在《靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析》文中研究指明溶瘤病毒（Oncolytic viruses,Ovs）疗法是肿瘤生物治疗应用的一个热点,其原理是利用病毒的复制能力,选择性感染和裂解破坏肿瘤细胞,且正常细胞和组织无害,裂解的肿瘤细胞可以释放子代病毒和肿瘤相关抗原,刺激机体产生免疫反应进一步杀伤肿瘤细胞。此外,有研究表明:某些OVs（如溶瘤痘病毒）还能够特异性地感染并破坏肿瘤血管,间接引起未感染的肿瘤细胞凋亡或坏死。肿瘤新生血管（Tumor neo-vasculature）为肿瘤细胞的增殖和转移提供氧气和营养物质,OVs通过靶向感染和破坏肿瘤血管将进一步增强其肿瘤杀伤能力并抑制肿瘤的侵袭转移。溶瘤腺病毒,也被称为条件复制型腺病毒（conditionally replicating adenovirus,CRAd）是目前临床研究应用最多的溶瘤病毒之一。目前在研的溶瘤腺病毒主要是基于人血清5型腺病毒（Ad5）改造而来。Ad5的主要细胞受体是柯萨奇-腺病毒受体（CAR）,腺病毒通过其纤维蛋白（fiber）与受体结合,从而使其附着在细胞表面,并通过整合素受体内化。由于肿瘤血管内皮细胞表面CAR低表达或不表达,使得CRAd5缺乏感染肿瘤血管内皮细胞的能力,因而限制了溶瘤腺病毒通过破坏肿瘤血管增强其抗肿瘤作用的潜力。目前已发现60多种血清型的人腺病毒,并分为A-G七个亚群,不同血清型腺病毒因识别受体不同而感染不同的细胞类型。如C亚群的Ad5等血清型的细胞受体是CAR,而D亚群的Ad37则以唾液酸（SA）为受体。唾液酸是神经氨酸的乙酰化衍生物,唾液酸的含量与肿瘤的增值、转移、浸润等密切相关,不同形式的唾液酸与血管内皮细胞的黏附相关。因此,我们提出以下假设:1、肿瘤血管内皮细胞表面的唾液酸受体会呈现高表达。2、将Ad5纤维蛋白上识别受体的头节区（knob）替换为Ad37的knob,构建fiber嵌合型病毒,可以增强CRAd5感染肿瘤血管内皮细胞的能力。此外,有研究报道,在整合素高表达的肿瘤模型中,RGD修饰的溶瘤病毒可以增强靶向性和抗肿瘤活性。同时,RGD肽通过竞争细胞外基质整合素受体,抑制肿瘤血管的新生,降低肿瘤细胞对正常组织的浸润与黏附能力。因此,以RGD修饰fiber嵌合型病毒,将进一步增强CRAd5靶向感染肿瘤血管的能力。基于上述背景,本论文设计构建一种新型fiber嵌合型溶瘤腺病毒,以增强溶瘤腺病毒靶向感染肿瘤血管内皮细胞的能力。具体构建策略:首先,将CRAd5的knob替换为Ad37的knob构建CRAd5/K37;然后,在CRAd5/K37的knob或其它fiber区域突变或插入RGD肽进一步构建RGD修饰的嵌合溶瘤腺病毒CRAd5/K37-RGD。获得上述嵌合病毒后,深入分析其感染肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的能力和性质。本论文首先分析了靶向肿瘤血管溶瘤腺病毒修饰策略的可行性。通过流式细胞术检测发现,人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表面的唾液酸受体呈现高表达。同时在构建病毒载体之前,首先构建了两种修饰策略的嵌合fiber真核表达载体,通过Western Blot分析嵌合fiber的表达情况和三聚体形式。结果显示:嵌合fiber（F5/K37）能够正常表达并形成三聚体;在Ad37 knob区域的HI-loop环插入RGD肽影响嵌合fiber的表达和三聚体形成,进而会影响病毒包装;而在fiber的shaft区域突变插入RGD肽,不影响嵌合fiber的表达和三聚体的形成。随后,在上述设计和前期验证的基础上,构建了以肿瘤特异性启动子Survivin介导E1基因表达的fiber嵌合型溶瘤腺病毒CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD。通过腺病毒骨架质粒的构建以及病毒包装、筛选、纯化和滴度测定等步骤最终成功获得了上述两种新型溶瘤腺病毒。然后,通过Dot blot等实验验证了嵌合病毒纤维蛋白的型别变化。接下来,我们重点分析了嵌合型溶瘤腺病毒对人血管内皮细胞和肿瘤细胞的感染性质。分别以表达红色荧光蛋白（RFP）的CRAd5、CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD感染人血管内皮细胞（HUVEC）、人微脑血管内皮细胞（hCMEC/D3）、正常肝细胞和多种肿瘤细胞系,流式分析其细胞转导能力。结果表明:相比于未改造病毒CRAd5,CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD在人血管内皮细胞和多种肿瘤细胞系中的感染和表达能力得到了显着提升。对比两种嵌合病毒发现,尽管CRAd5/K37-S-RGD对一些肿瘤细胞系的感染能力低于CRAd5/K37,但其对肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的选择性更好,表明CRAd5/K37-S-RGD具有更好的安全性。然后,以人卵巢癌细胞系SKOV3为模型,通过knob蛋白阻断,进一步明确了嵌合病毒CRAd5/K37-S-RGD感染依赖的主要受体为CAR、SA及整合素等。之后,我们通过流式、RT-PCR、MTT等方法分析了溶瘤腺病毒对肿瘤血管的抑制能力。嵌合病毒CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD均能显着抑制HUVEC的细胞活力,同时,由于对肿瘤细胞的感染能力的提升,两种嵌合病毒均能显着性抑制具有促使肿瘤血管异常增生功能的肿瘤细胞旁分泌的VEGF。最后,通过在体外模拟嵌合溶瘤腺病毒感染的环境,hVEGF165能够显着提升CRAd5/K37-S-RGD的靶向感染肿瘤血管内皮细胞的能力。最后,我们以人卵巢癌细胞系SKOV3建立小鼠荷瘤模型,通过免疫荧光实验证实嵌合病毒CRAd5/K37和CRAd5/K37-S-RGD能够高效地感染小鼠肿瘤血管内皮细胞。随后,我们以鼠卵巢癌细胞系OVHM建立小鼠荷瘤模型,分析嵌合溶瘤腺病毒通过破坏肿瘤血管抑制肿瘤生长的能力。两种嵌合病毒并未能显着提升CRAd5的肿瘤生长抑制能力。分析原因,我们认为由于人腺病毒不能在鼠源细胞内有效复制,单纯的感染性增加未能对肿瘤血管产生足够的破坏进而显着抑制肿瘤细胞的生长。综上,本论文通过纤维蛋白改造成功构建了一种具有靶向感染肿瘤血管能力的新型溶瘤腺病毒,为溶瘤腺病毒载体在抗肿瘤血管生成基因治疗方面的研究和应用提供了良好的基础。
孙天元[4]（2019）在《抗EGFR与抗VEGFR2双特异性纳米抗体的制备及其体外生物活性检测》文中认为目的:针对单克隆抗体存在的亲和力差、免疫原性强、非特异性及毒性等缺陷,本研究将研发可同时结合VEGFR2和EGFR且具有生物学活性的双特异性纳米抗体,以期为纳米抗体在肿瘤治疗方面提供新的研究方向。方法:大肠杆菌中表达目的蛋白;镍离子金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白;采用FACS法分析双特异性纳米抗体与肿瘤细胞表面抗原的结合情况;运用SPR技术定量检测纳米抗体分别与抗原EGFR和VEGFR2的结合情况;利用CCK-8试剂盒考察纳米抗体对细胞生长的抑制能力,用Graphpad Prism软件拟合曲线计算IC50值和EC50值;采用细胞划痕实验分析纳米抗体对细胞迁移能力的影响,并用Image-J软件灰度扫描计算细胞愈合率;免疫印迹法分析信号通路中磷酸化蛋白表达的情况,并用Image-J软件进行灰度扫描。结果:质粒在大肠杆菌中成功表达;经镍柱纯化得到目的蛋白,双特异性纳米抗体产量达到2 mg/L;纳米抗体可以与HT-29细胞中的抗原VEGFR2和EGFR结合;用SPR技术计算得到抗EGFR纳米抗体与抗原EGFR结合的KD值为1.53E-8 M,抗VEGFR2纳米抗体与抗原VEGFR2结合的KD值为2.138E-9 M,双特异性纳米抗体分别与抗原EGFR和抗原VEGFR2结合的KD值为5.865E-7 M和6.666E-9 M;在CCK-8实验中,生长因子EGF刺激HT-29细胞的生长,EC50值为45.2 ng/m L,生长因子VEGF的EC50值为39.1 ng/m L,抗EGFR纳米抗体抑制HT-29细胞生长的IC50值为165.6 n M,抗VEGFR2纳米抗体的IC50值为514.9 n M,双特异性纳米抗体的IC50值为9.3 n M,而西妥昔单抗的IC50值为172.5 n M;在细胞划痕实验中,阴性对照组细胞愈合率为55.45%,抗EGFR纳米抗体组、抗VEGFR2纳米抗体组和双特异性纳米抗体组分别为14.42%、8.99%和6.84%;在免疫印迹法实验中,双特异性纳米抗体作用于细胞后,信号通路中磷酸化的蛋白呈剂量依赖性减少。结论:与单靶点纳米抗体相比,双特异性纳米抗体抑制肿瘤细胞生长作用更显着,表明Bi-Nb可以同时抑制不同信号通路,以增强对肿瘤细胞杀伤能力,为双特异性纳米抗体提供新的思路,使纳米抗体在恶性肿瘤的靶向治疗中显现出更广阔的应用前景。
张天洋[5]（2019）在《利用转基因家蚕丝腺表达重组hVEGF165的研究》文中指出鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）是重要的产丝昆虫,至今已被人类饲养利用逾5000年。家蚕丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的专一场所（一头家蚕可生产约0.5克丝蛋白）,是蚕丝业最为核心的生物学基础。近些年来,随着生物技术的蓬勃发展,特别是近年在家蚕基因组计划的推动下,人们对丝腺高效合成与分泌丝蛋白的分子机制有了深入了解,同时也注意到家蚕不仅能用于产丝织绸,其丝腺还是一个理想的生物反应器。2003年,日本学者首次报道了利用转基因家蚕丝腺表达重组人Ⅲ型胶原蛋白,其后,国内外学者利用转基因家蚕丝腺已成功表达了数十种外源蛋白,少数重组蛋白素材已进入中试或产业化生产阶段,表明利用家蚕丝腺作为生物反应器生产重组蛋白,有着巨大的开发应用潜力。人血管内皮生长因子（human vascular endothelial growth factor,hVEGF）是一种对内皮细胞具有高度特异性的有丝分裂原,在血管再生和血管发生中起着重要作用。hVEGF165是hVEGF-A亚型中组织表达频率最高、最具生理相关性的一种异构体,在外周缺血性疾病或慢性伤口的治疗性血管再生研究中效果显着。目前,重组hVEGF165蛋白主要采用大肠杆菌、酵母等原核或低等真核表达系统进行体外表达和研究,其是否适合在家蚕中部丝腺表达尚不清楚。本论文以hVEGF165为靶标,探索利用转基因家蚕中部丝腺表达hVEGF165的可行性,以期为进一步开发重组hVEGF165蛋白提供理论参考和转基因素材基础。取得的主要研究结果如下:1.hVEGF165转基因家蚕的制作首先,从NCBI下载hVEGF165基因序列（NP001020539.2）,根据家蚕密码子偏好进行密码子优化后直接合成在C末端融合有6×His标签的hVEGF165序列。其次,采用酶切连接方式,将合成序列组装到以家蚕丝胶1基因（Sericin-1,Ser1）启动子为调控元件的亚克隆载体pSL1180[hSer1sp-DsRed-Ser1PA]上,进而再装到piggyBac骨架载体,构建成转基因表达载体pB[hSer1sp-hVEGF165-Ser1PA,3×P3EGFP]（简写为S1-V165）。最后,采用显微注射方法,将S1-V165超纯质粒DNA注射至家蚕早期胚胎,经荧光筛选获得了5个阳性蛾圈;基因组PCR及测序结果表明,转基因蚕制作成功,命名为S1-V165。2.hVEGF165的表达特征解剖获取S1-V165五龄幼虫的中部丝腺进行qRT-PCR检测,结果表明:在五龄第16天的中部丝腺中,hVEGF165的表达量逐渐增加,五龄第6天出现表达峰值,其mRNA含量是内源Ser1 mRNA总量的56%。随后对S1-V165五龄幼虫中部丝腺及茧壳溶解产物进行Western Blot检测,结果显示,在中部丝腺以及茧壳溶解产物中均能检测到目的蛋白,表明重组hVEGF165蛋白已成功在S1-V165家蚕中部丝腺细胞中合成并且分泌进入茧壳中。3.重组hVEGF165蛋白的促细胞增殖活性重组hVEGF165蛋白是否二聚体化是其有无生物学活性的关键。本研究分别利用PBS、8M尿素和弱碱溶液（5 g/L Na2CO3,4 g/L NaHCO3）溶解S1-V165茧壳后进行Western Blot分析,结果表明:在存在或缺乏β-巯基乙醇（还原或非还原条件下）的条件下,重组hVEGF165蛋白分别以单体或二聚体形式存在。紧接着,将灭菌处理的S1-V165茧壳蛋白浓缩液与饥饿处理后的HUVE细胞共培养24 h后,分别进行CCK-8检测及EdU染色分析。结果表明:含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液的促细胞增殖效果显着高于对照组,表明其具有促细胞增殖活性。随后,利用弱碱溶液分别处理细胞0、5、15、30 min后,进行Western Blot分析,结果表明,与对照组相比含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液处理细胞后对pMAPK44/42的瞬时磷酸化相对较高,具备激活ERK通路从而促进内皮细胞增殖的作用。4.重组hVEGF165蛋白的释放特性取S1-V165茧粉90 mg于3 mL的弱碱液中溶解72 h,采用Western Blot测定弱碱液上清液中重组hVEGF165蛋白的释放行为。结果表明,重组hVEGF165蛋白在024 h内释放速度极快,达到总释放量的80%,2472 h期间仍有少量释放。5.S1-V165茧片的促细胞增殖活性将干燥灭菌的S1-V165茧片浸泡在血清浓度为10%的培养基中,与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h后进行观察发现,细胞形态及生长状态良好,与对照组相比无明显死亡;随后利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行饥饿处理12 h,将茧片放入96孔板中与细胞共同培养72 h,利用CCK-8及EdU染色进行促细胞增殖分析,结果表明,S1-V165茧片处理过的细胞在450 nm处的吸光度显着高于对照组。综上,本研究制作获得了在家蚕中部丝腺特异表达重组hVEGF165蛋白的转基因系统,并在细胞水平证实其具有生物学活性,为进一步探索重组hVEGF165蛋白的开发应用打下了理论及素材基础。
吴凡[6]（2019）在《靶向SRPK-1的嵌合抗体用于非小细胞肺癌治疗的初步探讨》文中研究说明目的:非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）是最常见的人类肿瘤之一,以生长快速、易转移、易侵袭和易复发为其特点。有证据表明丝氨酸-精氨酸蛋白激酶-1（serine-arginine protein kinase-1,SRPK-1）的蛋白或m RNA水平在NSCLC组织中上调。然而,SRPK-1的功能和SRPK-1靶向治疗在NSCLC的进展和治疗中仍然知之甚少。本课题的研究目的拟通过基因工程抗体技术构建SRPK-1的嵌合抗体（chimeric antibody of SRPK-1,Chan SRPK-1）,通过体内体外研究证实NSCLC中SRPK-1的表达增加;评价构建合成的Chan SRPK-1对NSCLC治疗效果,探讨Chan SRPK-1治疗后NSCLC的迁移和侵袭是否受到抑制。期望通过这一研究探索Chan SRPK-1作用机制,为NSCLC提供新的治疗思路。方法:（1）通过使用常规方法筛选SRPK-1的抗体靶向,为了增强SRPK-1抗体的稳定性和半衰期,成功构建靶向SRPK-1的嵌合抗体Chan SRPK-1,在大肠杆菌表达体系中稳定表达分泌Chan SRPK-1。（2）通过使用SDS-PAGE凝胶电泳确定Chan SRPK-1;使用ELISA和western印迹分析确定Chan SRPK-1具有对SRPK-1的高亲和力,检测Chan SRPK-1表达水平及其具有与SRPK-1特异性结合的能力。（3）通过使用RT-q PCR分析和ELISA分析检测非小细胞肺癌衍生血管内皮细胞（NSCLCDVECs）和MRC-5细胞中的SRPK-1表达水平变化。（4）通过使用MTT比色法检测Chan SRPK-1对NSCLCDVECs生长的体外作用比较细胞活力。（5）通过不同浓度SRPK-1及Chan SRPK-1处理NSCLCDVECs和MRC-5细胞,比较细胞活力、测定迁移和侵袭,证实SRPK-1对迁移和侵袭的作用;Chan SRPK-1对非小细胞肺癌肿瘤细胞存活力、迁移和侵袭的抑制作用。（6）通过使用ELISA和western印迹分析确定NSCLC模型小鼠体内Chan SRPK-1对迁移相关促进蛋白的表达变化,以及分析Chan SRPK-1对肿瘤细胞松弛素D和G-肌动蛋白的表达水平以及GSK3-β的磷酸化的影响。（7）通过给荷瘤小鼠静脉注射400mg Chan SRPK-1,同时注射相同体积的PBS给对照组小鼠,每天1次注射,持续治疗14天后,分别观察25天至120天,记录荷瘤小鼠生存情况分析Chan SRPK-1治疗携带NSCLC的小鼠的肿瘤细胞生长、生存时间、根除率、转移率。结果:（1）使用SDS-PAGE凝胶电泳确定制备的Chan SRPK-1的分子量为约67.5k Da。另外,使用ELISA和western印迹分析确定Chan SRPK-1与SRPK-1保持高亲和力并且具有与SRPK-1结合的能力。（2）使用RT-q PCR分析和ELISA分析NSCLCDVECs和MRC-5细胞,结果显示NSCLCDVECs中SRPK-1的表达与MRC-5人肺细胞中的表达相比上调;Chan SRPK-1处理以剂量依赖性方式（200-2000mg/ml）中和了SRPK-1的表达;Chan SRPK-1处理也以时间依赖性方式中和了SRPK-1的表达;结果还显示Chan SRPK-1（400mg/ml）从48h起抑制NSCLCDVECs生长。（3）Chan SRPK-1对非小细胞肺癌迁移和侵袭的体外抑制作用结果显示,与MRC-5细胞相比,Chan SRPK-1处理组（200、400和1000mg/ml,48小时）NSCLCDVECs的存活力显着降低;与未处理组相比,SRPK-1的存在显着促进NSCLCDVECs在200、400和1000mg/ml剂量下处理24小时的迁移和侵袭;相反Chan SRPK-1显着抑制NSCLCDVECs的迁移、侵袭并促进凋亡发生。NSCLCDVECs中TCF、MMP、CT1和FBC的m RNA表达水平显着高于Chan SRPK-1处理的细胞中的m RNA表达水平（P<0.01）,Chan SRPK-1和对照组之间迁移促进蛋白的表达存在显着差异（P<0.01）。Chan SRPK-1处理的肿瘤细胞中细胞松弛素D和G-肌动蛋白表达的下调和GSK3-β的磷酸化显着不同。（4）在动物实验发现与对照组相比Chan SRPK-1处理组中的异种小鼠的肿瘤尺寸受到显着抑制;在用Chan SRPK-1治疗之后,长期存活（超过120天）显着增加;与对照小鼠相比,用Chan SRPK-1（每组中n=10）治疗延长携带NSCLC小鼠的存活时间;Chan SRPK-1治疗对荷瘤小鼠起保护作用;与对照组PBS处理的荷瘤小鼠相比,Chan SRPK-1抑制NSCLC肿瘤转移。结论:（1）结果表明通过使用常规方法构建靶向SRPK-1的嵌合抗体Chan SRPK-1,在大肠杆菌表达体系中稳定高水平表达分泌Chan SRPK-1;Chan SRPK-1具有与SRPK-1特异性结合的能力。（2）结果初步证明Chan SRPK-1在体内和体外均明显抑制NSCLC肿瘤生长、迁移和侵袭,能够控制肿瘤转移、延长生存时间、增加根除率。
汪砚雨[7]（2018）在《VEGF165基因转染血管内皮祖细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的实验研究》文中认为背景随着对急性心肌梗死后心肌缺血/再灌注损伤的深入研究,研究者发现血管内皮细胞（endothelial cells,ECs）在缺血/再灌注损伤的发生发展中扮演着重要的角色。ECs是缺血/再灌注损伤时受损的靶细胞;同时通过其广泛的生物学功能主动地参与了器官功能的损伤。成熟的内皮细胞增殖能力低,且不具有分化能力,不能修复受损的血管内皮。研究发现,血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）不仅参与人胚胎血管生成,也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程,在一定的条件下,EPCs细胞在体外能增殖,可诱导分化为成熟的内皮细胞。骨髓中获取EPCs数量和质量有限,外周血液中EPCs的数量也很少。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是调控EPCs向内皮细胞分化的重要细胞因子,VEGF165是高度特异性的细胞刺激因子,能有效动员EPCs,增加EPCs的数量、提升EPCs的功能。VEGF因其强大的促进新血管形成的作用,一直是心肌缺血促血管新生基础与临床研究中的热点。VEGF基因治疗心肌疾病动物模型得到初步证实。由于载体缘故,VEGF基因治疗只能较少的修复血管内皮细胞。经转基因手段VEGF基因对EPCs进行修饰,将基因治疗和干细胞治疗方法联合应用在血管损伤的内皮修复治疗,可提高二者促血管新生和修复血管内皮的能力。目的构建与鉴定携带绿色荧光蛋白标记的人VEGF 165基因的重组腺病毒载体Ad-hVEGF165-GFP,继而将Ad-hVEGF165-GFP转染大鼠EPCs,探讨hVEGF165基因转染EPCs的方法及效果。并将hVEGF165基因转染EPCs移植入心肌缺血/再灌注损伤大鼠体内,观察实验动物心肌组织病理学、心肌结构及梗死面积、心肌组织血管免疫荧光染色的变化,同时观察对大鼠血浆TNF-α、心肌组织NF-κB和TLR-4表达的影响,探讨hVEGF 165基因转染的EPCs对心肌缺血/再灌注损伤心肌的保护作用及其可能存在的机制。方法一、hVEGF 165基因重组腺病毒载体的构建。将hVEGF165基因进行扩增,并同源重组入表达质粒pAV-MCMV-HA-P2A-GFP,转化入DH5a感受态细胞,得到的转化子经菌落PCR鉴定和测序鉴定后,通过Ad Max腺病毒包装系统转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。包装后镜下观察HEK293细胞,测定腺病毒滴度,Western Blot检测重组腺病毒的表达。二、hVEGF 165基因重组腺病毒载体转染大鼠血管内皮祖细胞。大鼠骨髓单核细胞分离,骨髓内皮祖细胞诱导、扩增培养及鉴定,将Ad-hVEGF165转染EPCs,转染后用荧光显微镜观察细胞生长情况,用Western blot检测VEGF的蛋白。三、Ad-hVEGF165转染EPCs移植对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及其机制。48只大鼠随机分为假手术组、心肌缺血再灌注组、心肌缺血再灌注注入EPCs组、心肌缺血再灌注注入Ad-hVEGF165转染EPCs组（转染组）共4组,每组12只。缺血再灌注组使用大鼠左冠状动脉前降支结扎/开放法建立。左冠状动脉前降支结扎30分钟后松开后再灌注2小时。于建模后,将前7天培养的EPCs、转染的EPCs细胞经尾静脉注入动物体内,保证注入的量一致。再灌注2小时后分别取心肌观察缺血区和梗死区面积,并将心肌组织固定,包埋,切片后,HE染色后观察病理改变。取心肌组织血管免疫荧光染色,逆转录聚合酶链反应技术方法检测心肌组织TLR4mRNA含量,免疫组化SP法检测心肌组织NF-κB p65蛋白表达水平。经右侧颈动脉放血采集血样,ELISA法检测血浆细胞因子TNF-α水平。结果一、hVEGF 165基因重组腺病毒载体的构建:成功构建了 hVEGF 165基因重组腺病毒,转染的HEK 293细胞出现了明显的细胞病变效应,获得hVEGF 165基因重组腺病毒的滴度为1.106×108（ifu/ml）,Western Blot检测在25KD左右。二、hVEGF 165基因重组腺病毒载体转染大鼠血管内皮祖细胞:hVEGF165重组腺病毒转染EPCs后24 h,检测VEGF蛋白表达。结果显示大部分EPCs中有hVEGF蛋白表达,感染效率大约80%。和转染前相比,转染后24 hhVEGF蛋白表达随时间显着增加。三、Ad-hVEGF165转染EPCs移植对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及其机制:1、心肌细胞梗死面积:与缺血/再灌注组47.72±9.77%比较,Ad-hVEGF165转染EPCs组心肌细胞梗死面积32.26±10.44%明显减小,差异有统计学意义（P<0.01）;EPCs组（梗死面积44.19±8.15%）、与缺血/再灌注组比较,梗死面积较其稍大,差异无统计学意义（P>0.05）;而与Ad-hVEGF165转染EPCs组相比较,有明显差异,梗死面积较大,有统计学意义（P<0.05）。2、2小时心肌组织病理改变:缺血/再灌注组在显微镜下观察到多处坏死灶,坏死处原有心肌结构消失,周围散布着大量坏死的心肌细胞。Ad-hVEGF165转染EPCs组可见一些散在的坏死灶,未见大片心肌坏死细胞,炎性细胞浸润减少;单注入EPCs组与缺血/再灌注组相比较,心肌坏死细胞稍减少,炎性细胞浸润程度也有所较少,但无统计学意义。3、心肌组织血管免疫荧光染色:缺血再灌注组（血管面积密度0.67±0.15）可见血管分布稀疏,Ad-hVEGF165转染EPCs组（血管面积密度2.7 6±=0.14）血管数量明显增多,差异显着（P<0.01）;EPCs组（血管面积密度1.39±0.30）与缺血再灌组比较,血管分布稍多,差异无统计学意义（P>0.05）,与Ad-hVEGF165转染EPCs组比较少,差异有统计学意义（P<0.05）。4、血浆TNF-α水平:缺血/再灌注组大鼠注入生理盐水2h血浆TNF-α 水平 518.09±79.24 pg·ml-1 明显高于假手术组 103.23±12.33 pg·ml-1,差异有明显统计学意义（P<0.01）。Ad-hVEGF165转染EPCs组2h血浆TNF-α水平256.18±7.26pg·ml-1明显低于缺血/再灌注组,差异有明显统计学意义（P<0.01）;EPCs组与Ad-hVEGF165转染EPCs组相比,TNF-α水平升高,差异有统计学意义,与缺血再灌注组相比较低,差异不显着,无统计学意义（P>0.05）。5、心肌组织TLR4 mRNA含量:缺血/再灌注组心肌组织TLR4 mRNA积分吸光度比值0.737±0.025,明显高于对照组0.268±0.006,差异有明显统计学意义（P<0.01）。Ad-hVEGF165转染EPCs组心肌组织TLR4 mRNA积分吸光度比值0.347±0.071明显低于缺血/再灌注组,差异有明显统计学意义（P<0.01）;EPCs组与缺血再灌注组比较,积分吸光度比值稍低,差异无统计学意义（P>0.05）,EPCs组与Ad-hVEGF165转染EPCs组,积分吸光度比值较高,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。6、心肌组织NF-κBp65表达水平:缺血/再灌注组心肌组织NF-κB p65表达积分值5.33±0.61明显高于对照组0.67±0.82,差异有明显统计学意义（P<0.01）;Ad-hVEGF165 转染 EPCs 组心肌组织 NF-κB p65 表达积分值 2.75±0.42明显低于缺血/再灌注组,差异有明显统计学意义（P<0.01）。EPCs组（积分值4.38±0.29）与Ad-hVEGF165转染EPCs组比较,明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）,与缺血再灌注组比较,有所降低低,差异无统计学意义（P>0.05）。结论成功地获得重组腺病毒Ad-hVEGF165-GFP,并转染大鼠EPCs。Ad-hVEGF165转染EPCs移植对心肌缺血再灌注损伤具有明显保护作用,能够明显促进血管新生,减少心肌细胞坏死,减少心肌梗死面积。其重要机制在于抑制TNF-α等炎症因子表达水平,减轻炎症反应,并且是通过抑制其上游调控基因NF-κB p65及信号通路分子TLR4等的表达而起作用的。
张康[8]（2017）在《VEGF（血管内皮生长因子）靶向疫苗抗原结构的优化研究》文中研究表明血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）,是胚胎发育、骨骼生长、损伤修复正常性过程中的关键调节因子,也与多种病理过程如肿瘤血管生成相关,其中VEGF165是最重要的亚型。癌症相关VEGF能够促进瘤体血管生成,为肿瘤细胞生长、分裂提供营养,也促进肿瘤细胞干细胞化和分化,增强肿瘤侵袭能力、转移能力和存活率。靶向VEGF药物在临床治疗肿瘤和眼底黄斑疾病的过程中已经使众多患者获益,研究开发靶向VEGF的新疫苗新,能够进一步降低使用成本,扩大阻断VEGF药物治疗人群,具有重要的社会意义。本论文在实验室徐爱章博士研究靶向VEGF结构域抗原疫苗的基础上,设计VEGF的表位疫苗。首先选取了VEGF三个优势表位,利用基因突变的方法将VEGF表位替换白喉毒素跨膜区（DTT）的291-296区,构建了三个表位疫苗抗原蛋白,在大肠杆菌原核系统中表达、纯化,制备得到表位疫苗抗原蛋白,设计进行动物实验免疫Balb/C小鼠,测试其免疫原性和抗体中和VEGF的能力。利用同源重组技术构建了VEGF165全长基因载体,在E.coli菌株中进行表达,使用纯化得到E.coli-VEGF165蛋白和购买的Human-VEGF165蛋白作为检测抗原,进行ELISA实验检测小鼠血清的抗体效价,评价表位疫苗的效果。用E.coli-VEGF165包被进行检测三组血清,结果显示都有很高的抗体滴度;但用Human-VEGF165包被检测,只有VEGF-III表现出一定抗体滴度,达到1×105,证明设计的表位疫苗抗原VEGF-III能引起小鼠体内的免疫反应,具有中和人VEGF活性;E.coli-VEGF165蛋白,缺乏真核系统蛋白表达后的修饰过程,提示靶向人体蛋白时,抗原的制备、免疫和检测,需要提前考虑论证实验设计。免疫1个月后小鼠抗血清中的抗体下降为免疫1周后水平的80%,随后抗体滴度缓慢下降,一段时间后仍能维持一定的水平。VEGF-III免疫小鼠之后,小鼠体内主要进行Th2型免疫应答,激活B细胞进行免疫反应。综上,VEGF-III表位疫苗可以引起小鼠体内有效的免疫应答,是一个成功的候选VEGF靶向疫苗抗原。
陈奕,贾宝辉,黄敏,尚明升[9]（2017）在《绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定》文中指出目的构建与鉴定携带绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因的重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP。方法将hVEGF165基因进行扩增,并同源重组入表达质粒pAV-MCMV-HA-P2A-GFP,转化入DH5a感受态细胞,得到的转化子经菌落聚合酶链反应（PCR）鉴定和测序鉴定后,通过Ad Max腺病毒包装系统转染HEK293细胞,进行病毒的包装和扩增。包装后镜下观察HEK293细胞,测定腺病毒滴度,Western blot检测重组腺病毒的表达。结果成功构建了重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,重组腺病毒转染的HEK293细胞出现了明显的细胞病变效应;获得重组腺病毒的滴度为1.106×108 IFU/mL;Western blot检测重组腺病毒表达在23 000左右。结论成功获得重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP,为进一步研究基因治疗脓毒症/感染性休克奠定了实验基础。
刘旭倩[10]（2016）在《人牙龈成纤维细胞构建组织工程化血管的实验研究》文中提出第一部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究目的:体外分离培养人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs）诱导分化为血管内皮细胞（vascular endothelial cell,VEC）。探讨人牙龈成纤维细胞（HGFs）在体外分化为血管内皮细胞（VEC）的潜能。方法:1牙龈组织的获取和分离正常人牙龈组织取自河北医科大学口腔医院口腔颌面外科,患者下颌阻生齿拔除术。牙龈组织手术切取后带回实验室,在无菌条件下分离牙龈上皮及结缔组织,留取牙龈结缔组织进行细胞培养。2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的培养培养液选用含15%胎牛血清的L-DMEM。牙龈结缔组织剪成1 mm×1 mm的组织块,进行原代培养。培养的细胞达到80%融合后,进行细胞传代培养。3人牙龈成纤维细胞（HGFs）的鉴定3.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞（HGFs）,选择波形蛋白（vimentin）抗体和CD31抗体鉴定成纤维细胞和血管内皮细胞。3.2人牙龈成纤维细胞（HGFs）的RT-PCR鉴定TRIzol法提取成纤维细胞的总RNA;以分光光度计测定细胞总RNA的纯度及浓度;应用反转录试剂盒RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一链cDNA;以适量反转录所得的cDNA为模版,在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增;将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,然后置于凝胶图像分析系统进行吸光度扫描,以GAPDH作为内参照校正,用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。3.3人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫细胞化学染色采用鼠抗人vimentin单克隆抗体、鼠抗人iii型胶原单克隆抗体,通过免疫细胞化学染色法检测vimentin蛋白和iii型胶原蛋白在人牙龈成纤维细胞中的表达与分布。3.4人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫荧光染色采用兔抗人s-100a4抗体和鼠抗人肌动蛋白α（α-sma）抗体,通过免疫荧光染色法检测s-100a4蛋白和α-sma蛋白在人牙龈成纤维细胞hgfs中的表达与分布。4生长曲线的测定采用mtt法测定第16代人牙龈成纤维细胞（hgfs）17天的od490nm处的吸光值。5内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达采用vimentin,血管生成素受体2（tie2）抗体和血管生长因子受体2（vegfr2）抗体,通过westernblot半定量vimentin蛋白,tie2蛋白和vegfr2蛋白在不同vegf165浓度组和不同诱导周期组中的表达量。real-timepcr相对定量法检测不同vegf165浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因,tie2基因,血管生成素2（ang2）基因的mrna相对表达量。6诱导过程中的形态学观察倒置显微镜观察8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）0,7,14,21,28,35,42和50天时的形态学变化。7诱导后血管内皮样细胞的鉴定7.1免疫细胞化学染色8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞35天后,采用鼠抗人cd34单克隆抗体、鼠抗人cd31单克隆抗体,通过免疫细胞化学染色法检测cd34蛋白和cd31蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。7.2免疫荧光染色8ng/mlvegf165诱导人牙龈成纤维细胞35天后,采用血管性假血友病因子（vwf）抗体和上皮钙粘附分子（e-cadherin）抗体,通过免疫荧光染色检测vwf蛋白和e-cadherin蛋白在诱导后血管内皮样细胞的表达与分布。7.3rt-pcr鉴定诱导后血管内皮样细胞中tie2基因的mrna相对表达量。7.4经8ng/mlvegf诱导35天后,通过透射电镜观察诱导后血管内皮样细胞的超微结构。8流式细胞仪测定诱导细胞转化率采用cd34抗体和cd31抗体,通过流式细胞仪检测诱导后血管内皮细胞中cd34和cd31的阳性表达率,以评估人牙龈成纤维细胞（hgfs）分化为血管内皮细胞（vec）的转化率。9成管能力测试检测诱导后血管内皮细胞的功能将诱导前后细胞接种于24孔板的matrigel基质胶中,olympusix71倒置显微镜下观察管状排列结构和完整度并计数管状结构的数量,对诱导后血管内皮细胞（vec）的功能进行评估。结果:1人牙龈成纤维细胞（hgfs）的基本生长情况细胞多数呈长梭形,细胞核较大,呈圆形或椭圆形。原代培养以组织块为中心向周围辐射生长,传代培养的细胞生长状态好,34天即可生长达90%100%。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）的鉴定结果2.1流式细胞仪检测人牙龈成纤维细胞（hgfs）表面抗原vimentin和cd31表达结果培养的成纤维样细胞表面抗原vimentin表达阳性,阳性率为（97.13±0.62）%;而表面抗原cd31表达率仅为（8.64±1.55）%。两者比较有统计学差异（p<0.05）。2.2细胞rt-pcr鉴定结果细胞rt-pcr结果显示人牙龈成纤维细胞（hgfs）特异性表达vimentin,s-100a4和α-sma。然而,tie2在细胞中不表达。2.3细胞的免疫细胞化学鉴定结果鼠抗人vimentin单克隆抗体和鼠抗人iii型胶原单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。2.4细胞的免疫荧光染色鉴定结果兔抗人s-100a4多克隆抗体和鼠抗人α-sma单克隆抗体荧光染色结果显示细胞分别呈绿色荧光和红色荧光表达。3人牙龈成纤维细胞（hgfs）生长曲线测定结果结果显示第2代或第3代人牙龈成纤维细胞（hgfs）的对数生长期比其余代次细胞增殖水平显着升高（p<0.05）,而第2代或第3代细胞的对数生长期细胞增殖水平无统计学差异（p>0.05）。4内皮细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达westernblot结果显示,8ng/mlvegf165诱导时tie2蛋白和vegfr2的相对表达量最高。real-timepcr结果显示,经8ng/mlvegf165诱导时tie2基因和ang2基因的mrna相对表达量达到最高。westernblot结果显示,诱导周期达到35天时tie2蛋白和vegfr2蛋白的相对表达含量最高。real-timepcr结果显示,诱导周期达到35天时tie2和ang2基因的mrna相对表达量最高。5vegf165对诱导后细胞形态学的影响人牙龈成纤维细胞（hgfs）经8ng/mlvegf165诱导714天,大部分细胞仍然呈现丛状或束状排列;1421天时,细胞逐渐排列形成多边形上皮细胞样结构;2128天时,细胞逐渐出现融合成簇现象,逐渐形成鹅卵石样或铺路石样的生长排列形式;2835天时,绝大多数细胞呈现铺路石样的生长形式以及形成血管腔样结构。6免疫细胞化学染色对诱导后细胞的鉴定鼠抗人cd34单克隆抗体和鼠抗人cd31单克隆抗体染色结果显示细胞呈阳性反应。7rt-pcr鉴定诱导后细胞tie2基因的表达rt-pcr结果显示,与对照组相比,tie2基因在诱导后细胞中显着表达。8免疫荧光染色对诱导后细胞的鉴定兔抗人vwf抗体和兔抗人e-cadherin抗体荧光染色结果显示细胞分别呈红色荧光表达。9诱导后细胞超微结构的观察透射电镜观察显示,细胞表面呈现微绒毛结构,细胞胞浆内出现溶酶体结构及内皮细胞特有的weibel-palad小体（w-p小体）。10流式细胞仪检测分析人牙龈成纤维细胞（hgfs）向血管内皮细胞（vec）分化的转分化率诱导后细胞组cd34和cd31细胞表型阳性率与对照组相比,差异有显着性,具有统计学意义（p<0.05）。11成管能力测试实验比较诱导前后细胞形成小管的能力诱导形成的细胞组在matrigel基质胶中24小时呈现管状样结构,与对照组相比,诱导组成管数目显着增高,具有统计学差异（p<0.05）。第二部分人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的研究目的:体外分离培养人牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,hgfs）并诱导分化为血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell,vsmc）,证实人牙龈成纤维细胞（hgfs）具有在体外分化为血管平滑肌细胞（vsmc）的潜能。方法:1人牙龈组织的获取,分离和细胞的培养同第一部分。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）的鉴定2.1人牙龈成纤维细胞（hgfs）的rt-pcr鉴定同第一部分。2.2人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫细胞化学染色同第一部分。2.3人牙龈成纤维细胞（hgfs）免疫荧光染色同第一部分。3生长曲线的测定同第一部分。4平滑肌细胞相关标记物在诱导分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达采用波形蛋白（vimentin）,肌动蛋白α（α-sma）和肌球蛋白（sm-mhc）抗体,通过westernblot半定量vimentin蛋白,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在不同pdgf-bb浓度组和不同诱导周期组中的表达量。real-timepcr相对定量法检测不同pdgf-bb浓度组和不同诱导周期组中vimentin基因,α-sma基因,sm-mhc基因,calponin1（cnn1）基因和平滑肌22α（sm22α）基因的mrna相对表达量。5诱导过程中细胞的形态学观察倒置显微镜观察10ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）0,7,14,21,28和35天时的形态学变化。6诱导后细胞的鉴定6.110ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）28天后,采用兔抗人α-sma抗体和鼠抗人sm-mhc抗体,通过免疫细胞化学染色法检测α-sma蛋白和sm-mhc蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。6.2采用cnn1抗体和sm22α抗体,通过免疫荧光染色检测cnn1蛋白和sm22α蛋白在诱导后血管平滑肌样细胞的表达与分布。6.3rt-pcr鉴定诱导后细胞中α-sma基因和sm-mhc基因的表达量。6.4经10ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导人牙龈成纤维细胞（hgfs）28天后,通过透射电镜观察诱导后细胞的超微结构。结果:1人牙龈成纤维细胞（hgfs）的基本生长情况:结果同第一部分。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）的鉴定2.1细胞rt-pcr的鉴定细胞特异性表达vimentin基因和s-100a4基因,弱表达α-sma基因,不表达sm-mhc基因。2.2细胞的免疫细胞化学鉴定:结果同第一部分。2.3细胞的免疫荧光染色鉴定:结果同第一部分。3人牙龈成纤维细胞（hgfs）生长曲线的测定结果:结果同第一部分。4平滑肌细胞相关标记物在分化中的人牙龈成纤维细胞（hgfs）中的表达westernblot结果显示,诱导浓度达到10ng/mlpdgf-bb时,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相对表达量最大;诱导周期达到28天时,α-sma蛋白和sm-mhc蛋白的相对表达含量最高。real-timepcr结果显示,当经10ng/mlpdgf-bb诱导时α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因和sm22α基因的mrna相对表达量最高;诱导周期达到28天时,α-sma基因,sm-mhc基因,cnn1基因,sm22α基因的mrna相对表达量最高。5诱导过程中细胞的形态学观察人牙龈成纤维细胞（hgfs）经10ng/mlpdgf-bb（含2ng/mltgf-β1）诱导07天,大部分细胞仍然呈现丛状;721天时,部分细胞呈现凋亡状态,细胞数量呈现一段时间的减少状态,但仍然为丛状排列;2128天时,细胞伸出伪足并相互连接,在密集与稀疏处相互交错略呈“峰谷”状,可与成纤维细胞相鉴别;2835天,绝大多数细胞已呈典型的“峰谷”状生长排列方式。6免疫细胞化学染色对诱导后细胞的鉴定结果显示,诱导后细胞兔抗人α-sma抗体呈强阳性反应,鼠抗人sm-mhc抗体呈阳性反应。对照组α-sma仍呈阳性反应,sm-mhc单克隆抗体呈阴性反应。7免疫荧光染色对诱导后细胞的鉴定结果显示,诱导后细胞sm22α抗体和cnn1抗体分别经rhodamine和fitc荧光染色呈阳性反应,胞浆分别呈红色荧光和绿色荧光表达。8细胞rt-pcr检测诱导后细胞α-sma和sm-mhc基因的表达诱导组α-sma基因mrna的相对含量明显高于未诱导组,具有统计学差异（p<0.05）;诱导组sm-mhc基因mrna的相对含量明显高于未诱导组,具有统计学差异（p<0.05）。9诱导后细胞超微结构观察结果透射电镜观察可见胞浆中有少量高尔基复合体,线粒体,粗面内质网,大量粗细不一的肌丝样结构或肌丝束以及电子密度较高的密体样结构等。第三部分兔脱细胞血管基质联合类人Ι型胶原合成支架材料的生物学特性及其细胞相容性的研究目的:应用冻干技术将类人i型胶原蛋白（human-likecollageni,hlc-i）合成高分子材料与兔脱细胞血管基质（acellularvascularmatrix,acvm）支架材料复合,制备acvm-0.25%hlc-i血管支架材料,探讨其生物学特性及与细胞的相容性。方法:1acvm基质的制备称量家兔体重,注射麻醉并结扎预取动脉分支,迅速切取血管,浸入生理盐水中,冲洗管腔后浸入含有1%苯扎溴铵的pbs复合液中60分钟,冲洗后0.1%胰蛋白酶处理6小时,冲洗后移入1%tritonx-100中72小时,制备的acvm基质浸入pbs中保存于4?c冰箱。2acvm基质he染色,观察脱细胞情况。3acvm基质masson染色,观察脱细胞情况及acvm基质中的胶原成分。4acvm与hlc-i的复合丙烯酸预处理acvm基质,紫外灯辐射30分钟,蒸馏水洗净数次后放入真空干燥器中;预处理acvm浸入到碳化二亚胺水溶性中,4oc冰箱中1小时;将不同浓度hlc-i（0.10mg/ml,0.25mg/ml,0.50mg/ml,0.75mg/ml,1.00mg/ml）复合于acvm基质表面12小时;清洗后acvm-hlc-i支架减压干燥,4oc保存备用。5人牙龈成纤维细胞（hgfs）的培养扩增及鉴定,实验方法同第一部分。6mtt法测定hlc-i与acvm的交联的最佳浓度在不同浓度acvm-hlc-i支架上接种人牙龈成纤维细胞（hgfs）,分别培养1,4,7天时测量各孔od490nm的吸光值,以确定hlc-i与acvm基质交联的最佳浓度。7支架的吸水性测试实验分为两组,acvm-0.25%hlc-i支架组和acvm支架组,室温条件下,分别称量两组材料浸入pbs前后的重量,干燥状态下重量标记为w0,浸湿24小时后重量标记为w1。支架材料的吸水量百分比计算公式:w1-w0/w0×100%。8支架的力学性能测定采用zwick/roellz020型万能力学实验机来检测标本的拉伸强度,断裂强度和断裂伸长率。实验分为未脱细胞的兔血管组,单纯acvm支架组和acvm-0.25%hlc-i支架组进行检测,记录应力和应变,绘制出应力-应变曲线。9支架的压力爆破实验实验分为未脱细胞的兔血管组,单纯acvm支架组和acvm-0.25%hlc-i支架组。用注满生理盐水的压力枪进行压力爆破实验。10扫描电镜观察支架表面结构a组为未脱细胞的血管组织;b组为acvm支架;c组为acvm-0.25%hlc-i支架,分别观察支架的侧面和内面。11cck-8试剂盒检测acvm-0.25%hlc-i支架的体外细胞毒性待测样品分为acvm-0.25%hlc-i支架组和单纯acvm支架组,铺于96孔板中,与100μl细胞悬液培养24,48和72小时,用cck-8试剂盒进行检测,酶标仪测定各组在450nm处的吸光度,通过计算细胞毒性活力（%）,即相对生长率来评价支架的体外细胞毒性。结果:1acvm基质大体观察结果acvm基质呈乳白色,管腔塌陷,管壁变薄,弹性消失并可折叠。2he染色观察acvm基质脱细胞程度结果显示,内膜层呈现透明状,无蓝染细胞核及细胞碎片等残留物,中膜层已经无平滑肌细胞结构,未见蓝染细胞核及细胞碎片等物质,整个管壁变薄,纤维结构稀疏。3masson染色观察acvm基质胶原成分及脱细胞程度结果显示,acvm基质中血管内皮细胞,血管平滑肌细胞和大部分肌纤维等成分脱落,大部分为染成绿色的胶原纤维和少量染成红色的肌纤维,但纤维结构稀疏。4人牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,hgfs）的培养、传代及鉴定结果结果同第一部分。5mtt法测定hlc-i与acvm支架的最佳复合浓度细胞接种于不同浓度hlc-i复合的acvm支架后经1,4和7天培养后,mtt实验结果显示,0.25%hlc-i复合于acvm支架上更有利于细胞的增殖,即为acvm-0.25%hlc-i支架。6acvm-0.25%hlc-i的吸水性测试结果结果显示,acvm-0.25%hlc-i支架与acvm支架相比,吸水能力无差别,二者无统计学差异（p>0.05）。7acvm-0.25%hlc-i支架材料的生物力学测定结果acvm-0.25%hlc-i支架的应力和应变均大于acvm支架,而与未脱细胞兔血管无统计学差异。acvm-0.25%hlc-i支架的抗拉伸能力与未处理的天然兔血管更加接近,而acvm支架的抗拉伸能力最差。acvm-0.25%hlc-i支架的断裂强度和断裂伸长率均与未处理的天然兔血管相近,而acvm支架断裂强度与未处理的天然兔血管相比有所降低,其断裂伸长率却有所增加。8acvm-0.25%hlc-i支架材料的压力爆破实验结果acvm-0.25%hlc-i支架的爆破压力大于单纯acvm基质的爆破压力（p<0.05）;而acvm-0.25%hlc-i支架与未经脱细胞处理兔血管的爆破压力无差别（p>0.05）。9扫描电镜观察acvm-0.25%hlc-i支架表面结构的超微结构经0.25%的hlc-i复合后,扫描电镜可见acvm-0.25%hlc-i支架与acvm基质相比,纤维更加致密,内膜层,中膜层和外膜层分界不清,各层均未见细胞分布。10acvm-0.25%hlc-i支架的体外细胞毒性测试结果acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的相对生长率（rgr）在24,48和72小时时各时间点均在75%以上,acvm-0.25%hlc-i支架和acvm支架的体外细胞毒性评估均合格。随着时间的增加（24,48和72小时）,细胞在两种支架材料上的增殖情况为逐渐上升的趋势。第四部分体外构建组织工程化血管及裸鼠体内动态强化的研究目的:采用分层方式将人牙龈成纤维细胞（humangingivalfibroblasts,hgfs）诱导分化形成的血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell,vsmc）和血管内皮细胞（vascularendothelialcell,vec）种植于acvm-0.25%hlc-i支架上构建初级组织工程化血管,再将初级组织工程化血管埋植于裸鼠皮下进行动物体内动态强化实验,探讨人牙龈成纤维细胞（hgfs）联合acvm-0.25%hlc-i支架构建组织工程化血管的可行性及裸鼠体内作用力对构建的组织工程化血管的影响。方法:1acvm-0.25%hlc-i支架材料的制备与处理,实验方法同第三部分。2acvm-0.25%hlc-i支架材料的消毒处理3eduapollo488标记诱导形成的血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）及鉴定标记率4eduapollo488标记血管平滑肌细胞（vsmc）并种植于acvm-0.25%hlc-i支架采用多次沉淀法将eduapollo488标记的诱导血管平滑肌细胞（vsmc）（1×106/ml）种植于acvm-0.25%hlc-i支架上,连续培养7天。5dapi标记诱导形成的血管内皮细胞（vec）及荧光显微镜下观察标记率6凝胶法种植诱导的血管内皮细胞（vec）将dapi标记的血管内皮细胞（vec）与matrigel基质按照4:1的比例混合制备成vecs-matrigel凝胶,均匀涂抹于种植有vsmcs-acvm-0.25%hlc-i支架材料的表面,置于37?c,5%co2的培养箱内,12小时后加入含15%fbs的1640:l-dmem=1:1的培养液,连续培养3天。7种子细胞种植支架后he染色观察8种子细胞种植支架后免疫组化染色兔抗人肌动蛋白（α-sma）抗体或鼠抗人肌球蛋白（sm-mhc）抗体特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架上的血管平滑肌细胞（vsmc）。鼠抗人cd34抗体和鼠抗人cd31抗体特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面生长的血管内皮细胞（vec）。9种子细胞种植支架后免疫荧光染色9.1免疫荧光单标鉴定calponin1（cnn1）蛋白和平滑肌22α（sm22α）蛋白特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面及内部生长的血管平滑肌细胞（vsmc）,荧光二抗采用fitc;血管性假血友病因子（vwf）蛋白和上皮钙粘附分子（e-cadherin）蛋白特异性标记acvm-0.25%hlc-i支架表面生长的血管内皮细胞（vec）,荧光二抗采用rhodamine,激光扫描共聚焦显微镜采集图像。9.2免疫荧光双标鉴定一抗采用兔抗人sm22α抗体和鼠抗人vwf抗体或鼠抗人cnn1抗体和兔抗人e-cadherin抗体;一抗采用兔抗人α-sma抗体和鼠抗人cd34抗体或鼠抗人sm-mhc抗体和兔抗人cd31抗体;荧光二抗采用山羊抗鼠rhodamine和山羊抗兔fitc或山羊抗兔rodamine和山羊抗鼠fitc进行免疫荧光双标。同时标记acvm-0.25%hlc-i支架上的两种细胞。10扫描电镜观察11裸鼠体内动态强化实验将单纯acvm-0.25%hlc-i支架组和构建的血管组植入裸鼠皮下。分别于术后第3、6、9周再次麻醉动物,取出植入皮下的组织进行固定,行组织学观察,荧光染色观察和压力承受实验测定。11.1组织学观察11.2eduapollo488和dapi荧光染色示踪细胞11.3压力承受实验测定实验分为裸鼠体内埋植的单纯acvm-0.25%hlc-i支架组,构建的血管组和正常血管组,用注满生理盐水的压力枪进行压力爆破实验。结果:1细胞示踪标记率结果eduapollo488标记的诱导血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）在荧光显微镜下可见90%以上的细胞被标记上;经dapi标记的诱导血管内皮细胞（vec）在荧光显微镜下可见90%以上的细胞被标记上。2体外构建组织工程化血管2.1he染色观察单独种植诱导的血管平滑肌细胞（vsmc）于acvm-0.25%hlc-i支架时,可见细胞在支架材料内部及表面均匀生长;单独种植诱导的血管内皮细胞（vec）于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架表面时,细胞单层排列分布于支架表面;种植两种细胞于acvm-0.25%hlc-i支架时可见内层为诱导血管内皮细胞（vec）层,中间为matrigel-vsmcs层,最外层为纤维支架层。2.2免疫组化染色结果单独种植诱导的血管平滑肌细胞（vsmc）于acvm-0.25%hlc-i支架时,细胞呈α-sma和sm-mhc抗原阳性反应。单独种植诱导的血管内皮细胞（vec）于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架时,细胞呈cd34和cd31抗原阳性反应。2.3免疫荧光染色结果2.3.1免疫荧光单标结果单独种植诱导的血管平滑肌细胞（vsmc）于acvm-0.25%hlc-i支架时,cnn1和sm22α抗原阳性反应,支架内部和表面的细胞被fitc染成绿色荧光,细胞核被dapi染成蓝色。单独种植诱导的血管内皮细胞（vec）于matrigel-acvm-0.25%hlc-i支架时,vwf和e-cadherin抗原阳性反应,支架表面的细胞被rhodamine染成红色荧光,细胞核被dapi染成蓝色。2.3.2免疫荧光双标结果分层种植于acvm-0.25%hlc-i支架的种子细胞中,支架材料内部的细胞sm22α,cnn1,α-sma或sm-mhc抗原阳性反应,胞浆fitc呈绿色荧光表达,表面的部分细胞vwf,e-cadherin,cd34或cd31抗原阳性反应,胞浆rhodamine呈红色荧光表达,细胞核均被dapi染成蓝色。2.4扫描电镜观察结果结果显示,横断面尚可见双层细胞结构,内表面可见诱导形成的血管内皮细胞（vec）均匀分布且与支架具有良好的生物相容性,细胞与细胞之间呈铺路石样结构。3裸鼠体内动态强化实验结果3.1标本大体观察3周时,单纯支架组和细胞支架组均位于裸鼠的皮下,周围有极薄的裸鼠组织包裹,管腔坍塌,管腔中间有少量裸鼠组织长入;6周时,管型结构完整,裸鼠组织长入,使得管壁相对增厚,管腔中间有裸鼠组织长入;9周时,管型结构仍然完整,周围和中间的裸鼠组织包裹增厚更明显。3.2组织学观察he染色可见,3周时,单纯支架组管壁结构清晰,周围有少量纤维组织包绕和少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁中有大量种植细胞和少量裸鼠细胞长入,周围有少量纤维组织包绕和大量炎细胞浸润。6周时,单纯支架组有少量降解,管壁中有裸鼠细胞长入,周围少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁中有大量细胞,结构清晰,周围有纤维组织包绕,炎细胞浸润减少。9周时,单纯支架组逐渐降解,周围有大量纤维结缔组织包绕和少量炎细胞浸润;细胞支架组管壁仍然十分清晰,管壁中有大量细胞,大部分来源于诱导形成的血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）,少数来源于裸鼠细胞的长入,周围少量纤维组织包绕,炎细胞浸润几乎看不到。3.3eduapollo488和dapi荧光染色示踪细胞结果实验组裸鼠皮下植入培养9周后,acvm-0.25%hlc-i支架上诱导血管平滑肌细胞（vsmc）被eduapollo488标记呈绿色荧光,诱导血管内皮细胞（vec）被eduapollo488标记呈绿色荧光,同时被dapi标记呈蓝色荧光,证实这些细胞来源于之前种植于支架的种子细胞。3.4压力承受实验测定结果acvm-0.25%hlc-i支架组与组织工程化血管组相比,具有统计学差异（p<0.05）;组织工程化血管组与正常血管组相比,无统计学差异（p>0.05）结论:1人牙龈成纤维细胞（hgfs）能在体外诱导分化为血管内皮细胞（vec）。2人牙龈成纤维细胞（hgfs）能在体外诱导分化为血管平滑肌细胞（vsmc）。3类人i型胶原蛋白（hlc-i）与兔脱细胞血管基质（acvm）联合制备的acvm-0.25%hlc-i支架材料具备充分的促进细胞粘附,细胞增殖和细胞迁移能力以及良好的机械性和生物力学性能。4人牙龈成纤维细胞（hgfs）诱导分化为血管平滑肌细胞（vsmc）和血管内皮细胞（vec）,分层种植于acvm-0.25%hlc-i支架材料上,体外能够成功构建组织工程化血管组织。5裸鼠体内强化实验证实,由人牙龈成纤维细胞（hgfs）诱导分化的血管内皮细胞（vec）和血管平滑肌细胞（vsmc）联合acvm-0.25%hlc-i支架材料,在裸鼠体内生长9周,构建的组织工程化血管组织形态完好。
二、人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定（论文提纲范文）
（2）基于原子力显微镜研究生物分子间相互作用及细胞表面性质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 原子力显微镜概述 |
| 1.2 原子力显微镜的工作原理和工作模式 |
| 1.2.2 原子力显微镜的工作原理 |
| 1.2.3 原子力显微镜的工作模式 |
| 1.3 基于原子力显微镜的力学测量技术 |
| 1.3.1 单分子力谱的基本原理 |
| 1.3.2 定量纳米力学成像 |
| 1.3.3 原子力探针的功能化 |
| 1.4 原子力显微镜的在生物学研究中的应用 |
| 1.4.1 分子生物学方面 |
| 1.4.2 细胞生物学方面 |
| 1.5 本文的选题意义与研究内容 |
| 第二章 基于单分子力谱定量研究肝素和血管内皮生长因子的相互作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 AFM探针的功能化和表征 |
| 2.2.3 硅片基底的功能化和表征 |
| 2.2.4 AFM力学测量 |
| 2.2.5 MD模拟过程 |
| 2.2.6 圆二色谱检测 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 AFM探针和硅片基底的功能化与表征 |
| 2.3.2 不同载入速率下VEGF_(165)和肝素间相互作用力的测定 |
| 2.3.3 VEGF_(165)和肝素结合的自由能变化 |
| 2.3.4 VEGF_(165)与肝素相互作用的MD模拟 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于单细胞定量纳米力学测量评估三七总皂苷对氧化应激损伤的保护机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 MTT实验 |
| 3.2.3 AFM实验 |
| 3.2.4 免疫荧光实验 |
| 3.2.5 杨氏模量计算 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 氧化应激模型的构建和评估 |
| 3.3.2 PNS对HUVEC细胞活力的影响 |
| 3.3.3 PNS对氧化应激损伤HUVEC细胞的形态和力学性质的影响 |
| 3.3.4 PNS对HUVEC细胞骨架抗氧化应激损伤的保护作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于原子力显微镜研究膀胱癌细胞的上皮间质转化过程 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 细胞划痕实验 |
| 4.2.3 流式细胞术 |
| 4.2.4 免疫荧光成像 |
| 4.2.5 AFM测量 |
| 4.2.6 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 膀胱癌细胞体外EMT模型的构建和评估 |
| 4.3.2 EMT过程中膀胱癌细胞形貌的变化 |
| 4.3.3 EMT过程中膀胱癌细胞力学性质的变化 |
| 4.3.4 EMT过程中膀胱癌细胞表面E钙黏蛋白表达的变化 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（3）靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肿瘤血管简介 |
| 1.2 溶瘤腺病毒简介 |
| 1.2.1 溶瘤病毒定义 |
| 1.2.2 腺病毒简介 |
| 1.2.3 溶瘤腺病毒的基因工程修饰策略 |
| 1.3 溶瘤腺病毒在抗血管生成基因治疗中的应用 |
| 1.4 RGD肽在肿瘤抗血管生成治疗中的应用 |
| 1.5 论文设计 |
| 1.5.1 论文思路 |
| 1.5.2 实验设计 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒、菌种、动物 |
| 2.1.2 主要材料和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 受体表达分析 |
| 2.2.2 真核表达载体和腺病毒骨架质粒的构建 |
| 2.2.3 Western-Blot |
| 2.2.4 腺病毒包装、筛选、扩增、纯化及滴度检测 |
| 2.2.5 Dot-blot |
| 2.2.6 溶瘤腺病毒感染性质检测 |
| 2.2.7 溶瘤腺病毒抑制肿瘤血管能力检测 |
| 2.2.8 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性检测 |
| 2.2.9 免疫荧光 |
| 2.2.10 数据统计分析 |
| 第3章 实验结果与讨论 |
| 3.1 靶向肿瘤血管的腺病毒载体修饰策略可行性分析 |
| 3.1.1 HUVEC细胞α2-3-SA表达分析 |
| 3.1.2 不同修饰策略的真核表达载体的构建 |
| 3.1.3 不同修饰策略的嵌合Fiber表达的验证 |
| 3.2 靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒的获得 |
| 3.2.1 腺病毒骨架质粒的构建 |
| 3.2.2 靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒的包装、筛选、纯化及鉴定 |
| 3.3 溶瘤腺病毒的感染性质分析 |
| 3.3.1 溶瘤腺病毒的转导能力分析 |
| 3.3.2 溶瘤腺病毒的溶瘤作用分析 |
| 3.3.3 溶瘤腺病毒的感染依赖的受体分析 |
| 3.4 .靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒抑制肿瘤血管能力分析 |
| 3.4.1 溶瘤腺病毒的抑制HUVEC能力分析 |
| 3.4.2 溶瘤腺病毒抑制VEGF作用分析 |
| 3.4.3 VEGF对 CRAd感染能力的影响 |
| 3.5 靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒体内靶向感染能力分析 |
| 3.5.1 溶瘤腺病毒体内靶向感染能力分析 |
| 3.5.2 溶瘤腺病毒体内抗肿瘤活性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）抗EGFR与抗VEGFR2双特异性纳米抗体的制备及其体外生物活性检测（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 纳米抗体的概述 |
| 2 双特异性抗体的发现及分类 |
| 3 靶点选择 |
| 3.1CD105 |
| 3.2 VEGFR2 |
| 3.3 EGFR |
| 3.4 EGFR与 VEGFR2 的相关联性 |
| 4 本课题的意义及创新性 |
| 第一章 纳米抗体在原核系统中的表达 |
| 1 材料和试剂 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 目的基因的合成 |
| 2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及目的质粒在大肠杆菌中的转化实验 |
| 2.3 纳米抗体的诱导及可溶性表达 |
| 2.4 纳米抗体的纯化 |
| 2.5 考马斯亮蓝染色法和免疫印迹法对蛋白纯化结果的检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 纳米抗体的制备 |
| 3.2 纳米抗体的表达 |
| 4 讨论及小结 |
| 第二章 纳米抗体的亲和力检测 |
| 1 材料和试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 SPR法测定纳米抗体与抗原亲和力 |
| 2.2 FACS分析纳米抗体与细胞表面抗原的结合活性 |
| 3 结果 |
| 3.1 SPR法检测纳米抗体与抗原的亲和力 |
| 3.2 流式细胞术检测纳米抗体与抗原亲和力 |
| 4 讨论及小结 |
| 第三章 纳米抗体的体外生物功能学研究及分子机制探究 |
| 1 材料和试剂 |
| 1.1 实验材料和试剂 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CCK-8法检测纳米抗体对HT-29细胞增殖的抑制作用 |
| 2.2 细胞划痕实验检测纳米抗体对HT-29细胞的迁移能力影响 |
| 2.3 免疫印迹法检测分子机制 |
| 3 结果 |
| 3.1 CCK-8法检测纳米抗体对HT-29细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2 细胞迁徙实验(划痕实验) |
| 3.3 在 HT-29 细胞中用免疫印迹法检测分子机制情况 |
| 4 讨论及小结 |
| 第四章 结论及工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间发表论文 |
| 文献综述 浅谈纳米抗体在肿瘤治疗方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）利用转基因家蚕丝腺表达重组hVEGF165的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 家蚕丝腺生物反应器 |
| 1.2.1 家蚕生物反应器的优势 |
| 1.2.2 家蚕生物反应器表达系统 |
| 1.2.3 家蚕转基因表达系统的应用 |
| 1.3 人血管内皮生长因子 |
| 1.3.1 人血管内皮生长因子的位置与结构 |
| 1.3.2 人血管内皮生长因子受体 |
| 1.3.3 人血管内皮生长因子的外源表达及应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 转基因家蚕的制作 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器与试剂 |
| 3.1.3 主要溶液及配制 |
| 3.1.4 家蚕转基因表达载体的构建 |
| 3.1.5 显微注射及荧光筛选 |
| 3.1.6 基因组PCR |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 显微注射和阳性个体筛选 |
| 3.2.2 转基因表达个体的分子确认 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 hVEGF165 的表达特征 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器与试剂 |
| 4.1.3 主要溶液及配制 |
| 4.1.4 hVEGF165 基因转录表达检测 |
| 4.1.5 重组hVEGF165 蛋白的表达检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 hVEGF165 基因的转录表达 |
| 4.2.2 重组hVEGF165 蛋白的表达检测 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 重组hVEGF165 蛋白的生物活性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.1.3 主要溶液及配制 |
| 5.1.4 重组hVEGF165 蛋白的提取与浓缩 |
| 5.1.5 HUVE细胞培养 |
| 5.1.6 重组hVEGF165 蛋白促细胞增殖活性 |
| 5.1.7 重组hVEGF165 蛋白在茧粉中的释放特征分析 |
| 5.1.8 蚕茧薄片促细胞增殖分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组hVEGF165 蛋白二聚体检测 |
| 5.2.2 重组hVEGF165 蛋白的促进细胞增殖活 |
| 5.2.3 重组hVEGF165 蛋白的释放特征 |
| 5.2.4 转基因茧片的促细胞增殖活性分析 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 总结与结论 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（6）靶向SRPK-1的嵌合抗体用于非小细胞肺癌治疗的初步探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、靶向 SRPK-1 的嵌合抗体的构建表达及其生物活性鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料和仪器 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 构建靶向SRPK-1 的嵌合抗体 |
| 1.2.2 测定SRPK-1 的嵌合抗体体外活性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、靶向SRPK-1 的嵌合抗体用于非小细胞肺癌治疗的初步探讨 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物、仪器 |
| 2.1.2 实验材料和试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 ChanSRPK-1对NSCLC细胞中SRPK-1 表达的体外作用 |
| 2.2.2 ChanSRPK-1 对非小细胞肺癌迁移和侵袭的体外抑制作用 |
| 2.2.3 ChanSRPK-1对NSCLCDVECs的作用通过靶向TCF和在NSCLC的小鼠体内作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）VEGF165基因转染血管内皮祖细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建 |
| 2.1.1 实验材料及主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体转染大鼠血管内皮祖细胞 |
| 2.2.1 实验动物和主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 Ad-VEGF165转染EPCs移植对心肌缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及其机制 |
| 2.3.1 主要试剂 |
| 2.3.2 主要仪器 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 VEGF 165基因重组腺病毒载体的构建 |
| 3.2 VEGF 165基因重组腺病毒载体转染大鼠血管内皮祖细胞 |
| 3.3 Ad-VEGF165转染EPCs移植对心肌缺血再灌注损伤大鼠的影响 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（8）VEGF（血管内皮生长因子）靶向疫苗抗原结构的优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 综述 |
| 1.1 肿瘤免疫治疗 |
| 1.1.1 抗肿瘤免疫反应 |
| 1.1.2 免疫治疗主要方法 |
| 1.1.3 肿瘤疫苗进展 |
| 1.1.4 疫苗的免疫途径 |
| 1.1.5 肿瘤逃逸 |
| 1.2 血管表皮生长因子VEGF |
| 1.2.1 VEGF发现的过程 |
| 1.2.2 VEGF亚型 |
| 1.2.3 VEGF基因表达调控 |
| 1.2.4 VEGF受体 |
| 1.2.5 VEGF在肿瘤发展中的作用 |
| 1.2.6 VEGF疫苗研究现状 |
| 1.3 载体与佐剂 |
| 1.3.1 DTT载体 |
| 1.3.2 佐剂 |
| 1.4 课题研究目的及技术路线 |
| 1.4.1 研究背景 |
| 1.4.2 研究目的 |
| 1.4.3 课题技术路线 |
| 2 构建载体与纯化目的蛋白 |
| 2.1 实验试剂、材料与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 提取pGEX-6P-1 质粒 |
| 2.2.3 扩环突变PCR |
| 2.2.4 凝胶回收 |
| 2.2.5 Dpn I酶消化 |
| 2.2.6 转DH5a感受态 |
| 2.2.7 挑取单克隆菌落 |
| 2.2.8 小规模表达目的蛋白 |
| 2.2.9 大规模表达目的蛋白 |
| 2.2.10 纯化目的蛋白 |
| 2.2.11 目的蛋白柱下酶切及纯化 |
| 2.2.12 目的蛋白的浓缩保存及定量 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 VEGF载体的构建 |
| 2.3.2 目的蛋白表达 |
| 2.3.3 目的蛋白的产量 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 VEGF165蛋白构建纯化 |
| 3.1 实验试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 扩增VEGF165克隆载体 |
| 3.2.2 引物设计与合成 |
| 3.2.3 目的基因扩增 |
| 3.2.4 pET-28a(+)质粒酶切 |
| 3.2.5 同源重组 |
| 3.2.6 VEGF165蛋白小规模表达 |
| 3.2.7 VEGF165蛋白大规模表达纯化 |
| 3.2.8 VEGF165蛋白的浓缩保存及定量 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 E.coli-VEGF165表达载体的构建 |
| 3.3.2 VEGF165表达纯化 |
| 3.3.3 VEGF165蛋白产量 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 动物免疫及效价测定 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.2 动物实验设计 |
| 4.2.1 小鼠分组 |
| 4.2.2 免疫剂量 |
| 4.2.3 免疫方式与采血 |
| 4.3 ELISA检测实验 |
| 4.3.1 抗体滴度检测实验 |
| 4.3.2 抗体亚型检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 小鼠免疫与采血 |
| 4.4.2 抗体检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（9）绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒与细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PCR引物的设计及重组表达质粒的构建 |
| 1.2.2 重组腺病毒的构建 |
| 1.2.3 腺病毒滴度检测 |
| 1.2.4 Western blot检测目的基因表达水平 |
| 2.1 目的基因测序结果 |
| 2.2 目的基因鉴定结果 |
| 2.3 重组质粒菌落鉴定结果 |
| 2.4 腺病毒包装过程绿色荧光蛋白表达结果 |
| 2.5 腺病毒滴度检测结果 |
| 2.6 重组腺病毒的表达结果 |
| 3 讨论 |
（10）人牙龈成纤维细胞构建组织工程化血管的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人牙龈成纤维细胞诱导分化为血管平滑肌细胞的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 兔脱细胞血管基质联合类人 Ι 型胶原合成支架材料的生物学特性及其细胞相容性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 体外构建组织工程化血管及裸鼠体内动态强化的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 组织工程化血管内皮细胞种子细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 组织工程化血管支架材料的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定（论文参考文献）
- [1]通过毕赤酵母表达系统获得高纯度的重组人血管内皮生长因子（rhVEGF165）[J]. 周伟杰,吴凤梅,姚冬生,谢春芳. 生物工程学报, 2021(11)
- [2]基于原子力显微镜研究生物分子间相互作用及细胞表面性质[D]. 张苗苗. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [3]靶向肿瘤血管的溶瘤腺病毒构建及感染性质分析[D]. 李哲. 吉林大学, 2020(08)
- [4]抗EGFR与抗VEGFR2双特异性纳米抗体的制备及其体外生物活性检测[D]. 孙天元. 大理大学, 2019(05)
- [5]利用转基因家蚕丝腺表达重组hVEGF165的研究[D]. 张天洋. 西南大学, 2019(01)
- [6]靶向SRPK-1的嵌合抗体用于非小细胞肺癌治疗的初步探讨[D]. 吴凡. 天津医科大学, 2019(02)
- [7]VEGF165基因转染血管内皮祖细胞治疗心肌缺血再灌注损伤的实验研究[D]. 汪砚雨. 郑州大学, 2018(12)
- [8]VEGF（血管内皮生长因子）靶向疫苗抗原结构的优化研究[D]. 张康. 上海交通大学, 2017(03)
- [9]绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定[J]. 陈奕,贾宝辉,黄敏,尚明升. 生物医学工程与临床, 2017(01)
- [10]人牙龈成纤维细胞构建组织工程化血管的实验研究[D]. 刘旭倩. 河北医科大学, 2016(05)
标签：内皮细胞论文; 血管内皮生长因子论文; 转化生长因子-β论文; 成纤维细胞生长因子论文; 基因合成论文;