一、γ干扰素及淋巴细胞可阻碍肿瘤的早期发育及其免疫原性的形成（论文文献综述）
杨杰[1]（2021）在《杜仲叶多糖偶联OVA脂质立方液晶对小鼠免疫活性探究》文中进行了进一步梳理脂质立方液晶（Cubs）是一种新型药物载体,因其双连续通道结构使得其在难溶性大分子药物的包载与体内运输过程中有巨大优势,杜仲由于其资源稀少,又因其滋补的功效甚佳,所以自古就被视为名贵中药材,《神农本草经》记载,杜仲可补中益气,强筋骨,而植物多糖有着抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫活性的功能,尤其是在机体免疫层面,免疫细胞存在多种多糖受体,植物多糖可提高免疫细胞的活性,使其能在免疫反应过程中发挥更好的作用。目前尚未有关于杜仲叶多糖（PsEUL）配合Cubs在机体免疫活性探究的相关研究报道,为探究将PsEUL与卵清蛋白（OVA）偶联并通过Cubs作为疫苗佐剂对小鼠的免疫活性,本试验使用超声热水提取PsEUL并使用碳二胺盐酸盐（EDC）缩合法将PsEUL和OVA通过化学键偶联在一起,并使用植烷三醇作为两亲性脂质物质制备PsEUL-OVA/Cubs,并分别对PsEUL-OVA和PsEUL-OVA/Cubs进行体内外试验,探究其免疫活性以期为植物多糖修饰抗原和新型疫苗佐剂的开发提供一定的理论依据与数据支持。本次试验的主要方法与试验结果和结论如下:1.PsEUL的提取与优化。本试验采用超声热水提取PsEUL,使用傅里叶红外光谱对提取的PsEUL进行鉴定,并通过大孔树脂对提取的PsEUL进行脱色工艺优化,使用硫酸苯酚法测定PsEUL多糖含量。结果显示,PsEUL在红外光谱下具有典型的多糖吸收峰,并且PsEUL是含有吡喃糖和呋喃环的酸性多糖;通过硫酸苯酚法对超声水提的PsEUL的提取率进行计算,PsEUL的提取率为5.7%;通过两种方式对PsEUL进行脱色处理,当采用大孔树脂为脱色的材料,使用乙醇作为洗脱液时,乙醇浓度为5%时,脱色率和多糖保有率最佳。2.杜仲多糖与OVA偶联物（PsEUL-OVA）的制备与表征。将PsEUL在EDC中与OVA反应得到杜仲叶多糖与OVA的偶联产物PsEUL-OVA,在葡聚糖凝胶G-150的层析柱上通过记录洗脱液的紫外吸收值,得到纯化的PsEUL-OVA。并使用傅里叶红外光谱、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、扫描电子显微镜以及BCA试剂盒进行表征。将PsEUL和PsEUL-OVA分别进行红外光谱扫描,结果显示,PsEUL-OVA的红外光谱在1580 cm-1处出现了己二酰肼上对应的C=O伸缩振动峰,表明PsEUL已经成功通过共价键-CO-NH-的形成偶联到OVA上;通过SDS-PAGE检测OVA和PsEUL-OVA,与OVA相比,PsEUL-OVA的条带明显上移至压缩胶部分,表明分子量增大,表明PsEUL成功与OVA偶联;通过SEM观察发现PsEUL和PsEUL-OVA的形貌发生了明显变化,PsEUL-OVA的颗粒发生黏连,说明OVA与PsEUL成功的结合在一起;通过使用BCA法和硫酸苯酚法计算得到PsEUL-OVA的转化率（%）=46.25%±4.2%;多糖与蛋白的比为48.1%±6.8%。3.PsEUL-OVA体内外免疫活性的探究。为了探究PsEUL-OVA的免疫活性,本试验通过CCK-8法研究了PsEUL-OVA体外脾细胞和巨噬细胞活性,并测定PsEUL-OVA对脾细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌水平的影响,再以FITC标记OVA,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对FITC标记的PsEUL-OVA的吞噬效果;体内试验,90只ICR小鼠随机分为6组,空白组、PsEUL组、OVA组、PsEUL与OVA混合组、PsEUL-OVA组,弗氏佐剂（FCA）阳性对照组。各组小鼠给药后在不同时间点检测各种免疫指标的变化,通过流式细胞仪分别检测了小鼠脾脏细胞中CD4+、CD8+的表达,以及树突状细胞表面成熟标志因子CD80、CD86以及MHC-II的表达水平;同时检测了PsEUL-OVA对小鼠免疫器官指数、血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6浓度以及OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b的水平的影响。体外试验结果显示,PsEUL-OVA的浓度为200μg/m L时小鼠脾细胞活性与巨噬细胞活性显着高于其余各组（P<0.05）;PsEUL-OVA能够分别提高淋巴细胞与巨噬细胞的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4、IL-6的分泌水平;激光共聚显微镜发现巨噬细胞对PsEUL-OVA的吞噬效果显着高于其他各组。体内试验表明,PsEUL-OVA可以显着提高小鼠免疫器官指数;小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b的水平及细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平,提高脾淋巴细胞中CD4+T与CD8+T的分化,促进小鼠树突状细胞表面成熟标志因子CD80、CD86、MHC-II表达水平。4.PsEUL-OVA/Cubs的制备与表征。使用植烷三醇作为双亲性脂质物质加入F127水溶液,使用超声均质法制备PsEUL-OVA/Cubs,通过透射电镜观察、偏光显微镜观察、Zeta电位和粒径分析,并测定PsEUL-OVA/Cubs包封率与载药量对PsEUL-OVA/Cubs进行表征。结果显示,通过TEM对PsEUL-OVA/Cubs进行观察,可见制备的PsEUL-OVA/Cubs呈现出六面体与立方体结构,且分布比较均匀,大小也相对均一;在偏光显微镜下观察,常温下PsEUL-OVA/Cubs为暗视野,无偏光,将PsEUL-OVA/Cubs加热至60℃可以观察到视野逐渐变亮,结构也变明显。由此可以证实PsEUL-OVA/Cubs为立方相结构,光学特点为各向同性;通过测定PsEUL-OVA/Cubs的粒径和Zeta电位,PsEUL-OVA/Cubs平均粒径（AD）为（381.68±12.28）nm,多分散系数（PDI）为（0.175±0.01）,平均Zeta电位为（-10.43±0.3）m V,说明PsEUL-OVA/Cubs分散性良好,比较稳定;通过包封率和载药量的计算公式算出制备的PsEUL-OVA/Cubs包封率为78.12%±1.23%,载药量为80.75%±2.43%。5.PsEUL-OVA/Cubs体外免疫活性研究。本试验通过CCK-8法探究PsEUL-OVA/Cubs对体外培养的脾细胞和巨噬细胞活性的影响,并测定了PsEUL-OVA/Cubs对脾细胞和巨噬细胞的细胞因子分泌水平的影响,再以FITC标记OVA,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对FITC标记的PsEUL-OVA/Cubs的吞噬效果,最后将PsEUL-OVA/Cubs与巨噬细胞共培养,并通过高通量测序分析PsEUL-OVA/Cubs对小鼠巨噬细胞的基因表达的影响。结果显示,PsEUL-OVA/Cubs的浓度为150μg/m L时小鼠脾细胞活性与巨噬细胞活性显着高于其余各组（P<0.05）;PsEUL-OVA/Cubs能够显着提高脾淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,促进巨噬细胞分泌IL-4、IL-6;激光共聚显微镜观察发现巨噬细胞对PsEUL-OVA/Cubs的吞噬效果显着高于其他各组;高通量测序发现,PsEUL-OVA/Cubs处理小鼠巨噬细胞24h后,RAW264.7基因表达谱中出现差异表达相关基因3385个,其中显着上调1891个,其中差异表达相关基因免疫相关富集通路为肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、抗原处理和递呈信号通路、吞噬体等信号通路。6.PsEUL-OVA/Cubs体内免疫活性的探究。150只ICR小鼠分为10组,空白组、PsEUL组、OVA组、PsEUL与OVA混合组、PsEUL-OVA组、PsEUL/Cubs组、OVA/Cubs、PsEUL+OVA/Cubs组、PsEUL-OVA/Cubs组,弗氏佐剂（FCA）阳性对照组。通过流式细胞仪分别检测了小鼠脾脏细胞中CD4+、CD8+的表达和树突状细胞表面成熟标志因子（CD80、CD86和MHC-II）的表型变化;此外检测了PsEUL-OVA/Cubs对小鼠免疫器官指数、血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6的浓度以及OVA特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平的影响。结果显示,PsEUL-OVA/Cubs可显着提高小鼠免疫器官指数,显着上调小鼠血清中OVA特异性IgG及其亚类抗体水平,同时显着提高小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6水平;PsEUL-OVA/Cubs能够显着促进脾淋巴细胞中CD4+T与CD8+T的分化,显着提升小鼠树突状细胞CD80+、CD86+、MHC-II的表达水平。综上所述,PsEUL与OVA偶联可以显着提高PsEUL的免疫增强活性。PsEUL-OVA/Cubs在体外可显着增强巨噬细胞的吞噬能力,提高细胞因子的分泌水平。在体内PsEUL-OVA/Cubs可以显着提高小鼠血清OVA特异性IgG及其亚类的抗体水平,增强血清细胞因子水平以及增强T、B淋巴细胞的增殖能力,提高CD4+、CD8+的表达,促进树突细胞的成熟。根据高通量测序结果推测PsEUL-OVA/Cubs对机体免疫活性的影响是通过影响差异基因富集,从而表达与免疫相关蛋白来实现的。
李美蓉[2]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中进行了进一步梳理急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
张鑫[3]（2020）在《吉西他滨增强肺癌免疫原性和NK细胞活性的研究》文中研究表明研究背景肺癌是常见的恶性肿瘤之一。吉西他滨（gemcitabine,GEM）可以抑制DNA合成,其抗肿瘤活性已在临床上得到成功证实。GEM与顺铂（cisplatin,CDDP）的联合治疗,作为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的一线化疗方案,在临床疗效、疾病进展和生存率方面均优于单用CDDP方案。虽然GEM可以有效杀死癌细胞,但许多患者在经历常规疗程化疗后仍面临癌症复发的风险。化疗药物存在多种免疫机制。因此,预防癌症复发最有效的策略可能是调动和刺激免疫系统对抗肿瘤细胞的作用。肿瘤免疫原性的定义是通过各种途径诱导肿瘤产生免疫反应以阻止其生长。在某些抗癌治疗过程中,死亡的肿瘤细胞会释放出免疫调节因子或损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）。这些作为“危险信号”,增加了肿瘤细胞的免疫原性。高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein,HMGB1）作为内源性危险信号,招募树突状细胞（dendritic cells,DCs）与Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）结合,激活T细胞免疫应答。钙网蛋白（calreticulin,CRT）可被化疗药等刺激因素诱导,从内质网腔向细胞膜转移,使细胞膜易于被DCs吞噬。自然杀伤细胞（natural killer cells,NKs）是一种重要的抗病毒和抗癌固有免疫淋巴细胞。NKG2D配体（natural killer group 2 member D ligands,NKG2DLs）属于NKs活化性受体,对于识别和清除肿瘤至关重要。NKG2DLs主要表达于肿瘤细胞,而在健康细胞中表达较低。通过上调NKG2DLs实现增加NKs杀伤活性,可以有效增强抗肿瘤免疫。研究目的本研究拟通过检测不同剂量GEM作用肿瘤细胞后诱导免疫原性的强弱,探讨抗肿瘤机制及疗效,为以GEM为基础治疗免疫功能正常的肺癌患者提供理论依据。研究方法采用免疫荧光法检测接受GEM刺激后LLC细胞和A549细胞免疫原性分子CRT、HMGB1的暴露。Dead染色法检测化疗药刺激LLC细胞和A549细胞后的存活情况。实时定量聚合酶链反应法（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）、流式细胞术分别验证GEM刺激LLC细胞和A549细胞后,NKG2DLs的mRNA水平和蛋白水平表达。在体内,构建LLC皮下荷瘤小鼠模型。监测皮下瘤的体积、小鼠的体重。GEM联合CDDP治疗小鼠肿瘤。收获小鼠后用血细胞分析仪分析血常规,用免疫荧光法观察皮下瘤的免疫原性分子CRT、HMGB1的暴露。用流式细胞术研究脾脏免疫细胞及功能分子变化。CFSE（carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester,羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯）实验检测C57BL/6小鼠的脾脏NKs杀伤LLC细胞和GEM预刺激的LLC细胞。RTCA（real-time cellular analysis,实时细胞分析）实验检测化疗药治疗后荷瘤鼠脾脏纯化NKs杀伤未刺激的LLC细胞。肝脏、肾脏H&E染色,比较不同处理后的毒性作用。研究结果免疫荧光实验结果显示GEM刺激可以使LLC细胞和A549细胞的免疫原性分子CRT膜表达、HMGB1的暴露增加。低浓度的GEM相比于高浓度GEM刺激LLC细胞和A549细胞引起更强的CRT和HMGB1暴露。Dead染色观察到高剂量GEM引起更多LLC细胞与A549细胞死亡。qRT-PCR法检测到GEM刺激LLC细胞和A549细胞后诱导NKG2DLs mRNA水平表达上调,流式细胞术显示GEM刺激A549细胞后NKG2DLs的蛋白水平表达上调。体内实验中,免疫荧光法显示低剂量（30 mg/kg）GEM处理后皮下瘤CRT和HMGB1的每平方厘米平均荧光强度（MFI）高于中剂量（60 mg/kg）和高剂量（120 mg/kg）治疗组。低、中、高剂量GEM处理的小鼠血常规淋巴细胞绝对值无明显变化,但淋巴细胞百分比增加。所有化疗组血常规中性粒细胞绝对值和百分比均下降。小鼠脾脏流式细胞术结果显示,低剂量组NKs百分比增加,中、高剂量组未见增加。所有GEM组均检测到NKG2D表达上调。低剂量GEM组NKs功能分子IFN-γ表达增加。高剂量GEM组的Ki67的MFI和百分比与PBS组相比明显下降。CFSE实验结果显示,低剂量GEM刺激的LLC细胞对NKs杀伤更敏感。RTCA结果显示,所有GEM组NKs的细胞毒作用增强。低剂量GEM组的NKs杀伤功能强于中、高剂量两组。所有GEM组对LLC肿瘤的抑制作用显着高于PBS组。所有GEM组对小鼠体重无明显影响。H&E染色显示肝脏组织随着GEM剂量的增加出现空泡变性增加,但未见肾脏过度损伤。研究结论本研究观察到低剂量GEM治疗增加CRT的膜表达和HMGB1的暴露,上调了NKG2DLs的表达,活化NKs,增强抗肿瘤免疫。低剂量GEM治疗对免疫系统无明显毒性,通过增强免疫原性触发抗肿瘤作用。得出了如下结论:1.低剂量GEM可增强肺癌免疫原性分子的暴露低剂量GEM治疗可在体外肺癌细胞和荷瘤小鼠体内增强免疫原性分子CRT的膜表达、HMGB1的暴露。高剂量GEM可导致肺癌细胞死亡。2.GEM可诱导肺癌固有免疫系统相关免疫原性分子的上调GEM可上调人和小鼠肺癌细胞中NKG2DLs的表达,增加NKs抗肿瘤免疫反应。3.低剂量GEM可诱导肺癌小鼠模型中的NKs活化GEM减少小鼠血液中性粒细胞绝对值。低剂量GEM治疗小鼠脾脏NKs功能分子IFN-γ表达增加,高剂量GEM组Ki67下降。低剂量GEM可激活NKs免疫系统,而高剂量GEM则抑制NKs增殖。NKG2D+NKs表达IFN-γ水平高于NKG2D-NKs。低剂量GEM治疗可提升肺癌小鼠模型中的NKs免疫应答。4.低剂量GEM治疗的肺癌细胞对NKs杀伤更敏感NKs对低剂量GEM刺激后的LLC的杀伤作用更强。低剂量GEM治疗后的脾脏NKs杀伤肺癌细胞更敏感。GEM对小鼠脾脏NKs的Ki67、NKG2D和IFN-γ的表达无直接影响。5.低剂量GEM抑制小鼠肺癌生长低剂量GEM抑制小鼠肿瘤生长,对小鼠肝、肾组织无明显不良反应。
信跃文[4]（2020）在《双网络生物材料促进皮肤驻留调节性T细胞的局部浸润和功能表达对烧伤创面愈合过程的作用研究》文中研究说明目的探究皮肤驻留调节性T细胞（Tregs）对烧伤创面愈合的作用及双网络水凝胶生物材料在体内刺激条件下对皮肤驻留调节性T细胞的功能影响。方法根据实验目的将实验分为两部分。在第一部分中探究皮肤Treg细胞对烧伤创面的愈合作用时,分别设置转基因鼠(基因型为Foxp3DTR型)-白喉毒素（DT）注射组（F-DT组）（n=40）和野生型（WT）-白喉毒素注射组（C-DT组）（n=40）。两组内再依据随机数字表法将小鼠分别分为早期组与晚期组。每组的早期组分别于烧伤前1天(D-1)、烧伤后1天（D1）、第3天（D3）对小鼠进行腹腔内注射DT;每组的晚期组分别于烧伤后5天（D5）、7天（D7）、9天（D9）注射DT。于烧伤后D0、D3、D5、D7、D9、D11对小鼠创面进行拍照,数字化测量不同时间点伤口的面积以评估伤口的愈合率;流式细胞术分析F-DT组较对照组的皮肤Treg细胞浸润及功能表达变化情况;于烧伤后第7天处死小鼠,采用H&E染色于光镜下观察肉芽组织增生及再上皮化情况。在第二部分中探究乙二醇壳聚糖（GC）/海藻酸钠（Alg）双网络生物材料在体内刺激条件下对皮肤Tregs的功能影响时,将80只C57BL/6野生型小鼠依据随机数字表法随机分为2组:对照（Control）组（n=40）和双网络水凝胶生物材料组（n=40）。材料组小鼠在烧伤后将GC/Alg凝胶固定于创面上。分别于烧伤后D0、D3、D5、D7、D9、D11对小鼠创面拍照并计算伤口面积及愈合率;流式细胞术分析对照组及材料组每个时间点皮肤Tregs细胞局部浸润及功能表达变化情况。结果首先,与C-DT早期组[D3（-0.16±0.04）%]相比,F-DT早期组创面愈合率显着降低[D3（-0.23±0.03）%]（P<0.05）;与C-DT晚期组[D3（-0.15±0.01）%]相比,F-DT晚期组[D3（-0.16±0.03）%]创面愈合率变化无明显差异（P>0.05）,F-DT早期组对7-11天伤口愈合的作用较F-DT晚期组作用明显。通过GC/Alg双网络生物材料在烧伤创面固定以在体内刺激皮肤驻留Tregs后,与对照组[D5（-0.09±0.04）%]相比,材料组[D5（0.18±0.03）%]创面愈合率显着增高（P<0.05）;流式细胞术分析Tregs局部浸润时,对照组内烧伤后皮肤CD4+Foxp3+T细胞D5组[（10.59±1.77）%]较D0组[（1.5±0.65）%]表达明显增加,CD25+Tregs D3组[（18.77±3.49）%]较D0组[（10.04±0.39）%]表达明显增加;经GC/Alg体内刺激后,与对照组D3[CD4+Foxp3+T细胞（8.21±2.61）%、CD25+Tregs（18.77±3.49）%]相比,材料组皮肤CD4+Foxp3+T细胞在烧伤后3天局部创面浸润[（22.44±2.83）%]明显增加,CD25+Tregs在烧伤后3天局部创面浸润[（64.74±3.31）%]明显增加。功能表达方面,对照组内CD4+Foxp3+T细胞的CTLA-4表达水平D3组[（18.33±4.78）%]较D0组[（11.76±0.5）%]明显增加,ICOS的表达水平D3组[（19.27±2.15）%]较D0组[（5.74±0.83）%]明显增加;经GC/Alg体内刺激之后,与对照组D3[CTA-4（18.33±4.78）%、ICOS（19.27±2.15）%]相比,材料组Tregs中CTLA-4的表达水平[（58.09±4.74）%]明显增加,ICOS的表达水平[（54.08±4.33）%]明显增加,总的来说,结果差异比较具有统计学意义（P<0.05）。结论1.皮肤调节性T细胞是皮肤创面愈合过程中的重要成份,其主要早期（烧伤后3天）作用于烧伤皮肤创面,并决定晚期愈合过程的愈合速率;2.双网络生物材料GC/Alg可以通过促进皮肤Tregs的局部浸润和功能表达来促进烧伤创面的愈合过程。
姜晓玲[5]（2020）在《WP1066靶向抑制JAK2/STAT3抗胰腺癌机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨JAK2/STAT3抑制剂WP1066抑制胰腺癌细胞PANC-1和PAN02增殖及免疫调节效应,阐述其可能分子机制,为胰腺癌的临床诊疗提供新的理论依据。方法:（1）检测临床病人胰腺癌组织中p-STAT3表达变化情况;（2）CCK-8检测WP1066对细胞增殖的影响;（3）划痕实验及Transwell检测WP1066对细胞迁移及侵袭能力的影响;（4）流式细胞术检测WP1066对细胞凋亡、周期及PAN02细胞表面MHC分子的影响;（5）RT-q PCR和Western blot检测WP1066对细胞凋亡、周期、迁移相关基因及蛋白表达量的影响;（6）Confocal检测WP1066对细胞中Ki 67和p-STAT3表达量的影响;（7）构建C57BL/6小鼠移植瘤模型,动态监测小鼠精神状态、体重及移植瘤体积,荷瘤成功后,将小鼠随机分为实验组和对照组,实验组每两天一次腹腔注射40 mg/Kg WP1066,对照组注射等体积浓度DMSO,药物治疗10次后处死小鼠并获取移植瘤及肝、肾组织用于HE染色,眼球取血法获取荷瘤小鼠外周血检测肝肾功能;（8）流式细胞术检测肿瘤组织中瘤细胞表面MHC分子及PD-L1表达量变化以及移植瘤中浸润的肿瘤相关免疫细胞百分比变化;（9）流式细胞术检测各组小鼠胸腺中TECs细胞亚群数量、ETPs数量及脾脏中T细胞各亚群数量的变化;（10）小鼠淋巴细胞分层液分离小鼠脾脏淋巴细胞,与PAN02细胞共培养48 h,流式细胞术检测CD4+及CD8+T淋巴细胞中Ki 67表达量的变化和淋巴细胞分泌IFN-γ,IL-2及TGF-β的变化。结果:（1）临床人胰腺癌样本中p-STAT3相较于正常胰腺组织表达升高（P<0.01）;（2）0μM,2.5μM,5.0μM,7.5μM,10μM的WP1066处理PANC-1和PAN02细胞24 h,48 h和72 h后,均能不同程度抑制胰腺癌细胞的增殖,且WP1066的抑制效应在0-10μM范围内呈明显的剂量依赖性（P<0.01）;（3）WP1066处理胰腺癌细胞12 h后,细胞划痕相对愈合面积减少,抑制了胰腺癌细胞迁移（P<0.01）;WP1066处理胰腺癌细胞48 h后,穿过迁移小室膜的细胞数减少,减弱了胰腺癌细胞侵袭能力（P<0.01）;（4）WP1066处理胰腺癌细胞24 h,48 h后,细胞凋亡率均增加,存活细胞减少（P<0.05）;WP1066处理PANC-1细胞48 h后,G2/M期细胞增多（P<0.001）,阻滞细胞周期于G2/M期;WP1066处理PAN02细胞48 h后,G1/G2期细胞增多（P<0.05）,阻滞细胞周期于G1/G2期;（5）WP1066处理胰腺癌细胞48 h后,Mcl-1,Bcl-2,Kras,Cyclin B1,Cyclin D1和Cyclin E1 m RNA表达量较DMSO组均降低,Caspase-3和Bax的表达则升高,移植瘤组织中相关基因表达变化相同（P<0.05）;（6）WP1066处理胰腺癌细胞48 h后,JAK2和STAT3总蛋白水平无明显改变,而p-JAK2和p-STAT3表达减少,同时伴随Cyclin A1,Cyclin B1,Cyclin D1,Cyclin E1,Kras,Mcl-1,Bcl-2,MMP-9蛋白表达下降和Caspase-3,Cleaved caspase-3,Bax蛋白表达增加,在移植瘤组织中结果相同（P<0.05）;（7）WP1066处理胰腺癌细胞48 h后,Ki 67及p-STAT3表达量均显着下降;（8）WP1066处理PAN02细胞48 h后,细胞表面MHCⅠ和MHCⅡ类分子表达增强（P<0.05）;（9）与对照组相比较,WP1066处理移植瘤模型鼠,抑制了移植瘤生长（P<0.001）,且药物无明显肝肾毒性;（10）移植瘤组织中瘤细胞表面MHCⅠ和MHCⅡ类分子表达均增加,而PD-L1的表达下降（P<0.05）;此外,移植瘤组织中浸润的CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞百分比增多,而MDSCs和Treg细胞百分比则减少（P<0.05）;（11）WP1066诱导胸腺中TECs、c TECs及ETPs数量增加（P<0.05）,促进脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+Naive T细胞、CD8+Naive T细胞、CD4+RTEs和CD8+RTEs数量增加（P<0.05）;（12）WP1066使荷移植瘤小鼠脾脏T细胞中Ki 67表达及T细胞分泌的促进肿瘤免疫应答细胞因子IFN-γ,IL-2增加,而抑制肿瘤免疫应答的细胞因子TGF-β分泌减少（P<0.05）。结论:WP1066通过抑制JAK2和STAT3磷酸化,调控下游基因表达变化,阻滞细胞周期进程并诱导细胞凋亡,从而抑制PANC-1和PAN02细胞增殖。同时,通过增强肿瘤免疫原性和胸腺功能、增加抗肿瘤免疫细胞向肿瘤组织浸润及调控T细胞分泌细胞因子,促进细胞免疫应答,发挥抗肿瘤效应。因此,WP1066是一种较有潜力的抗胰腺癌的小分子抑制剂。
李育萌[6]（2020）在《鹦鹉热衣原体多表位融合疫苗的设计优化及抗感染保护作用研究》文中研究表明背景与目的:鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci,Cps）是一种能够引起多宿主感染的专性胞内寄生菌,其感染不同宿主能够引起不同感染性疾病,包括人、禽鸟、家畜以及部分哺乳动物均是Cps的易感宿主。近年来,Cps感染性疾病在世界范围内均呈逐年递增趋势,2019年全球Cps在人和动物中的感染率以及发病率已达十年来新高。有效防控Cps感染对于保障公众卫生健康、促进国家畜牧业发展具有重要意义。而疫苗接种作为预防衣原体感染的最佳方式,也越来越受到人们的重视。尽管多年来衣原体在减毒活菌疫苗、亚单位疫苗等方面已取得了一定成绩,但由于上述疫苗仍存在毒副作用大、效力不强等局限,到目前为止尚无临床可用的衣原体抗感染疫苗。多表位融合疫苗是目前疫苗研究的热点,其具有抗原特异性强、致敏成分少、稳定性高等特点,较传统疫苗更具优势,然而有关衣原体多表位融合疫苗的报道仍然较少。因此,本研究拟通过生物信息学预测鉴定Cps MOMP以及CPSITp6蛋白的优势抗原表位,并以此为基础构建Cps多表位融合抗原,评估其免疫原性以及抗感染保护作用。随后通过设计最佳的免疫策略,同时构建新型疫苗佐剂,以进一步优化、完善Cps的多表位融合疫苗。本研究将为衣原体疫苗的设计开发提供新的思路与依据,对未来Cps的防控具有重要意义。方法:1.GenBank查找Cps MOMP以及CPSITp6蛋白的氨基酸序列,通过DNAStar分析蛋白的二级结构,IEBD预测蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性,随后采用SYFPEITHI软件评估蛋白序列中的潜在T细胞位点并计算抗原指数。最后根据以上分析综合预测MOMP以及CPSITp6蛋白的优势抗原表位片段。2.构建MOMP以及CPSITp6蛋白的优势抗原表位肽段,通过腹腔注射免疫BALB/c小鼠3次后,取血清检测IgG、IgA抗体评估体液免疫应答水平;取BALB/c小鼠脾细胞检测各肽段对脾细胞增殖的影响,以及刺激脾细胞分泌细胞因子IFN-γ以及IL-10的水平。3.构建MOMP以及CPSITp6的多表位融合抗原,腹腔注射免疫BALB/c小鼠后,检测血清IgG、IgM、IgA以及IgG亚类抗体水平。取BALB/c小鼠脾细胞上清检测细胞上清IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-10的分泌水平;末次免疫2w后,最佳Cps感染剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,10 d后取肺组织进行Cps包涵体计数、H&E染色以及免疫组化染色评估融合抗原的抗感染保护作用。4.多表位融合抗原腹腔注射免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞进行磁珠分选分别消耗CD4+或者CD8+细胞,随后将分选后的脾细胞过继转移至新的BALB/c小鼠体内。1d后Cps滴鼻感染BALB/c小鼠,感染7 d后处死小鼠取肺组织进行Cps包涵体计数。5.采用滴鼻、肌肉联合免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫2 w后取血清、鼻腔灌洗液以及生殖道灌洗液分别检测血清抗体以及分泌型IgA水平（sIgA）;ELISA、流式细胞术分别检测脾细胞上清以及细胞内的细胞因子水平;末次免疫2 w后,最佳Cps感染剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,检测肺组织Cps载量、肺上清炎症因子水平以及病理损伤情况,并通过qRT-PCR检测不同组织中Cps的含量。6.基于CNPs以及HBc-144构建CNPs/HBc-144新型疫苗佐剂,通过理化性质检测分析新型佐剂的及稳定性以形态结构。随后将CNPs/HBc-144与融合抗原结合后连续免疫7 d,并监测BALB/c小鼠的体重变化。免疫7 d后,处死BALB/c小鼠,取肺组织以及注射部位肌肉组织进行H&E染色。7.CNPs/HBc-144-Ags联合免疫BALB/c小鼠4次,间隔2w。分别收集每次免疫BALB/c小鼠的血清、鼻腔灌洗液以及生殖道灌洗液,检测血清IgG、IgA以及sIgA抗体水平;流式细胞术检测细胞内CD4+、CD8+细胞水平以及CD44/CD62分泌水平,并检测细胞上清以及细胞内细胞因子水平;随后进一步检测感染BALB/c小鼠的肺组织Cps载量、肺上清炎症因子水平以及病理损伤情况。最后通过qRT-PCR检测心、肝、脾等组织中的Cps载量。结果:1.通过 DNAStar 以及 IEBD 预测分析,MOMP 的第 24-32、86-100、262-272、328-340 位以及 CPSITp6 蛋白的第 15-25、109-119、173-181、280-290位为潜在的抗原表位片段。而其中MOMP第24-32、262-272 位以及 CPSITp6 蛋白第 109-119、173-181 位含有潜在T细胞位点且抗原指数较高。2.MOMP24-32、MOMP262-272、CPSITp6109-119、CPSITp6173-181 多肽片段均能在免疫BALB/c小鼠体内诱导产生较高的血清IgG、IgA水平;此外,各多肽片段还能够显着刺激免疫BALB/c小鼠脾细胞增殖,诱导脾细胞上清中Th1型细胞因子IFN-γ的分泌。3.多表位融合抗原免疫BALB/c小鼠后,其血清IgG、IgM、IgA以及IgG亚类抗体水平均显着高于阴性对照组,细胞上清IFN-γ、IL-2的分泌水平也平显着上升。此外,Cps感染后,融合抗原免疫BALB/c小鼠的肺组织衣原体包涵体滴度以及肺组织上清中IFN-γ、IL-6分泌水平均显着低于阴性对照组,且肺组织炎性浸润程度较轻。4.过继转移消耗CD8+细胞的抗原特异性脾细胞能够显着降低BALB/c小鼠肺组织中Cps载量。而过继转移消耗CD4+细胞的融合抗原特异性脾细胞较PBS以及FA过继转移组并无显着差异。5.滴鼻、肌肉联合免疫组血清IgG以sIgA水平均显着高于对照组;联合免疫能够有效刺激免疫BALB/c小鼠脾细胞的增殖,且脾细胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α以及IL-17A分泌水平也显着高于单独免疫组;此外,联合免疫组BALB/c小鼠的肺组织Cps载量以及肺上清中IFN-γ、TNF-α IL-6水平较对照组均显着降低,且血液、肝脏、脾脏等组织中Cps含量均显着低于对照组。6.经理化检测分析,CNPs/HBc-144-Ags为大小相似的圆形颗粒结构,且分布均匀。颗粒平均粒径181.6±41.2 nm,Zeta电位+6.62±0.23 mV,多分散指数 0.391±0.083;而 CNPs/HBc-144-Ags 连续免疫7 d后,BALB/c小鼠体重平稳,并未出现体重减轻。此外,病理检测结果显示,注射部位肌肉以及肺组织结构完好,并未出现严重的炎性浸润。7.CNPs/HBc-144-Ags在免疫BALB/c小鼠体内诱导产生的血清IgG、IgA水平均随免疫次数增加显着上升,但较CNPs-Ags以及HBc-144-Ags对照组并无显着差异,而CNPs/HBc-144-Ags诱导的sIgA则显着高于对照组。CNPs/HBc-144-Ags免疫BALB/c小鼠脾细胞上清中IFN-γ、IL-2以及IL-17A分泌水平均显着上升,且细胞内IFN-γ水平也显着高于对照组。此外,CNPs/HBc-144-Ags组BALB/c小鼠脾细胞中CD44/CD62的分泌水平要显着高于对照组。CNPs/HBc-144-Ags能够有效降低Cps感染后BALB/c小鼠肺组织衣原体载量、减轻肺组织的炎性病理损伤,并有效减少Cps在肝、脾、肾等组织中的含量。结论:1.MOMP24-32、MOMP262-272、CPSITp6109-119、CPSITp6173-181 为 Cps MOMP以及CPSITp6蛋白的优势抗原表位片段,具有良好的免疫原性,能够诱导产生体液免疫以及细胞免疫应答。2.基于Cps MOMP以及CPSITp6构建的多表位融合抗原能够诱导产生较强的体液免疫以及细胞免疫应答,有效抵抗小鼠Cps肺组织感染;多表位融合抗原诱导产生的细胞免疫应答可能主要由CD4+细胞介导。3.滴鼻、肌肉联合免疫能够增强Cps多表位融合抗原诱导的黏膜、体液免疫以及细胞免疫应答,并有效增强抗Cps感染免疫保护作用,抑制Cps感染后在BALB/c小鼠体内的扩散;4.CNPs/HBc-144新型疫苗佐剂能显着增强Cps多表位融合抗原诱导的黏膜免疫以及细胞免疫应答,同时促进记忆性T细胞分泌,形成记忆性免疫应答抵抗Cps体内感染。
周舸[7]（2020）在《肝细胞癌组织中PD-1和TIM-3的表达及其意义》文中认为目的:通过检测程序性死亡受体1（Programmed death-1,PD-1）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cell immunoglobulin domain and mucindomain containing molecule-3,TIM-3）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达,分析两者之间的关系及与各临床病理特征的关系,同时分析两者对预后的影响,探讨PD-1和TIM-3表达在肝细胞癌中的临床意义,从而为免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor,ICI）治疗在肝细胞癌患者中的临床应用提供更多的理论依据。方法:1、收集2013年1月至2015年12月于中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院接受手术治疗的46例肝细胞癌患者组织蜡块,回顾性分析所有患者的病例资料和随访资料。2、采用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色法检测PD-1和TIM-3在癌组织、癌旁组织中的表达情况,分析两者之间的关系,及与临床病理特征、预后之间的关系。结果:1、肝癌组织中PD-1阴性、弱阳性、中阳性、强阳性表达率分别为26.09%（12/46）、26.09%（12/46）、41.30%（19/46）、6.52%（3/46）,癌旁组织中为60.87%（28/46）、34.78%（16/46）、4.35%（2/46）、0.00%（0/46）,二者比较P=0.000<0.01;肝癌组织中TIM-3阴性、弱阳性、中阳性、强阳性表达率分别为8.70%（4/46）、39.13%（18/46）、39.13%（18/46）、13.04%（6/46）,癌旁组织中TIM-3阴性、弱阳性、中阳性、强阳性表达率分别为15.22%（7/46）、60.87%（28/46）、21.74%（10/46）、2.17%（1/46）,二者比较P=0.001<0.01。2、Spearman秩相关性分析显示,癌中PD-1和TIM-3的表达水平具有相关性（rs=0.397,P=0.006）。3、肝细胞癌组织中PD-1表达强弱与肿瘤大小（rs=0.480,P=0.001）、门静脉癌栓（rs=0.307,P=0.038）和TNM分期（rs=0.5340,P=0.000）有显着相关性;肝细胞癌组织中TIM-3的表达强弱与门静脉癌栓（rs=0.301,P=0.042）、病理分化程度（rs=0.356,P=0.015）和TNM分期（rs=0.416,P=0.004）显着相关。4、46例患者的1年、3年及5年总生存期（Overall survival,OS）分别为89.1%,56.5%和34.4%,平均OS为45.36±3.87个月,中位OS为39.00±3.39个月;1年、3年及5年无病生存期（Disease-free survival,DFS）分别为52.2%,21.7%和10.9%,平均DFS为23.41±3.52个月,中位DFS为13.0±2.26个月。单因素分析显示,PD-1的表达强弱（χ2=2.077,P=0.043）、肿瘤大小（χ2=10.238,P=0.001）、病理分化程度（χ2=13.939,P=0.001）、TNM分期（χ2=27.929,P=0.000）是影响HCC患者OS的预后因素;病理分化程度（χ2=14.764,P=0.001）、TNM分期（χ2=18.137,P=0.000）是影响HCC患者DFS的预后因素。多因素分析显示,病理分化程度（HR=4.723,95%CI:1.952-11.428,P=0.001）、肿瘤大小（HR=3.234,95%CI:1.327-7.883,P=0.010）、TNM分期（HR=3.254,95%CI:1.076-9.835,P=0.037）、TIM-3的表达水平（HR=0.572,95%CI:0.329-0.995,P=0.048）均是HCC患者OS的独立预后因素;病理分化程度（HR=2.945,95%CI;1.527-5.682,P=0.001）、TNM分期（HR=3.511,95%CI:1.259-9.793,P=0.016）均是HCC患者DFS的独立预后因素。结论:1.HCC癌组织中PD-1和TIM-3的表达水平均高于癌旁组织。2.HCC癌组织中PD-1和TIM-3的表达呈正相关。3.HCC组织中PD-1表达强弱与肿瘤大小、门静脉癌栓和TNM分期相关,TIM-3表达强弱与门静脉癌栓、病理分化程度和TNM分期相关,提示PD-1和TIM-3的表达可能促进了肿瘤的进展。4.PD-1和TIM-3的高表达可能预示着HCC患者的预后差。
刘霖[8]（2019）在《基于人mPGES1的CTL表位广谱多抗原肽的设计及体外抗肝癌活性的研究》文中研究表明【背景和目的】微粒体前列腺素E2合成酶1（microsomal Prostaglandin E Synthase 1,mPGES1）是合成前列腺素E2（Postaglandin E2,PGE2）所需关键限速酶之一,不仅参与炎症过程,还可影响肝癌的发生发展、侵袭转移及复发。mPGES1在多种肿瘤细胞表面呈高表达,而在正常组织细胞表面呈极低表达或不表达的状态,可视为肿瘤相关抗原（Tumor-associated Antigen,TAA）,也是肝癌预防及治疗的有效分子靶点。肿瘤疫苗中的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）表位疫苗,尤其是利用树突状细胞（Dendritic Cell,DC）负载CTL表位制备的DC疫苗,被认为是新一代肿瘤免疫治疗策略中前景较好的治疗方式之一。为了设计及合成人mPGES1的CTL表位广谱多抗原肽（Multiple Antigen Peptide,MAP）并检测其体外抗肝癌活性,本课题筛选人mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位,设计并合成以聚赖氨酸为核心的四分支树状结构MAP,分离培养小鼠骨髓来源DC以负载MAP合成疫苗,观察其对肝癌细胞的体外杀伤作用。【方法】（1）SYFPEITHI预测获取mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位,筛选出与HLA-A2和HLA-A3两种基因型均有较高预测分值的九肽;MHCPred预测工具分析所选九肽与HLA的结合能力,分值大于5.0被认为具有结构亲和性。（2）标准固相肽合成法（SPPS）合成3种以聚赖氨酸为核心组成紧密有序的四分支树状结构MAP,即（VSRIPARLK）4、（LRVQGTIIA）4、（VTHAVRGVL）4（以下简称M1、M2、M3）;合成1种普通单链结构MAP即VSRIPARLK（以下简称M5）。（3）反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析鉴定MAP的纯度情况;液相色谱/质谱联用（LC/MS）检测MAP分子量与理论值的差异。（4）小鼠骨髓来源DC分离和培养至成熟;倒置荧光显微镜下观察细胞形态;扫描电子显微镜下观察表面结构;流式细胞仪鉴定细胞表面分子标志物CD83、CD86及CD11c的表达情况。（5）小鼠脾淋巴细胞分离和培养;各MAP与成熟小鼠DC共孵后,再与小鼠脾淋巴细胞共培养以诱导mPGES1特异性CTL增殖作为效应细胞。培养人肝癌细胞株HepG2、Huh-7、MHCC97h及SMMC7721,Western Blot检测各细胞株mPGES1表达情况,筛选出高、中、低水平表达mPGES1的3株作为靶细胞。（6）按照1:3、1:1、3:1、10:1、25:1、50:1设定效-靶比（Effector Cells:Target Cells Ratio,E:T Ratio）,分组进行杀伤实验:（1）负载M1的小鼠DC及淋巴细胞,记为M1组;（2）负载M2的小鼠DC及淋巴细胞,记为M2组;（3）负载M3的小鼠DC及淋巴细胞,记为M3组;（4）同时负载M1、M2、M3三种四分支MAP的小鼠DC及淋巴细胞,记为M4组;（5）负载单链肽M5的小鼠DC及淋巴细胞,记为M5组;（5）无MAP负载的小鼠DC及淋巴细胞,记为M0组。另设不加任何免疫细胞的人肝癌细胞为Control组。（7）CCK-8法检测效应细胞的毒性作用;在效-靶比为10:1的条件下,Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪检测靶细胞的凋亡情况;在效-靶比为25:1的条件下,ELISA法检测细胞上清液中小鼠细胞因子IFN-γ的分泌水平。【结果】（1）获取mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位,合成四分支树状结构MAP和单链结构MAP;各MAP的纯度均高于95%,符合国际多肽的实验标准;MAP的分子量分别为4495.00 kDa、4215.60 kDa、4140.00 kDa和1040.20 kDa,与理论值无明显差异。（2）分离和培养小鼠骨髓来源DC至成熟,光镜下见特殊的树枝状突起形态,电镜下见典型的网纱状、突起状表面结构,符合DC形态特征;细胞表面分子标志物CD83、CD86、CD11c表达水平较高,分别为89.61%、89.74%、95.16%,均符合DC表型特征。（3）分离和培养小鼠脾淋巴细胞,与负载MAP的成熟小鼠DC共孵后获得效应细胞;培养高表达mPGES1的MHCC97h、中等表达的Huh-7、低表达的HepG2人肝癌细胞作为靶细胞。（4）设定1:3、1:1、3:1、10:1、25:1、50:1为效-靶比,CCK-8法检测结果显示:随效应细胞浓度上升或随效-靶比增大,效应细胞对靶细胞的毒性作用越强;当杀伤同一种靶细胞且效-靶比相同时,M1组、M2组、M3组和M4组效应细胞对靶细胞产生的毒性作用均较M5组和M0组明显增强（p<0.05）;当使用同一种效应细胞进行杀伤时,效应细胞对靶细胞产生的毒性作用在MHCC97h中最强,依次为MHCC97h、Huh-7、HepG2（p<0.05）。（5）设定10:1为效-靶比,Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞仪检测结果显示:当杀伤同一种靶细胞时,凋亡效应在M3组或M4组中最明显,依次为M3组或M4组、M1组或M2组、M5组或M0组（p<0.05）,其中M3组和M4组之间未见明显差异、M1组和M2组之间未见明显差异、M5组和M0组之间未见明显差异（p>0.05）;当使用同一种效应细胞进行杀伤时,凋亡效应在MHCC97h中最明显,依次为MHCC97h、Huh-7、HepG2（p<0.05）。（6）设定25:1为效-靶比,ELISA法检测结果显示:当杀伤同一种靶细胞时,小鼠细胞因子IFN-γ分泌水平在M3组或M4组中最高,依次为M3组或M4组、M1组或M2组、M5组或M0组（p<0.05）,其中M3组和M4组之间无明显差异、M1组和M2组之间无明显差异、M5组和M0组之间无明显差异（p>0.05）;当使用同一种效应细胞进行杀伤时,小鼠细胞因子IFN-γ分泌水平在MHCC97h中最高,依次为MHCC97h、Huh-7、HepG2（p<0.05）。【结论】（1）成功合成人mPGES1的HLA-A2/A3限制性CTL表位广谱MAP。（2）成功分离、获取小鼠骨髓来源DC并培养至成熟,其表面结构及分子表型均符合成熟DC特征。（3）负载人mPGES1的CTL表位四分支MAP的小鼠DC疫苗可通过分泌细胞因子IFN-γ在体外特异性杀伤人肝癌细胞,杀伤效率与细胞mPGES1表达水平呈正比;其抗肝癌效应较单链结构MAP强,且与CTL优势表位VTHAVRGVL有关,而与CTL表位数量无关。
王文涛[9]（2019）在《自然杀伤细胞和乙肝病毒特异性T细胞与中断核苷（酸）类似物后的病毒学复发和肝脏损伤相关性的研究》文中指出背景与目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一个全球性的公共卫生问题,其疾病谱多样,可表现为无症状的携带者、肝炎活动、肝硬化或肝功能失代偿。核苷（酸）类似物（nucleos（t）ide analogue,NA）治疗能够有效地抑制HBV DNA的复制水平,使肝功能复常,延缓肝硬化的进展,降低肝脏失代偿或肝细胞癌的发生,从而改善部分患者的预后。然而,NA治疗对共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）却无直接抑制作用,难以彻底根治HBV感染,其中断治疗以后极易发生病毒学复发和肝脏损伤,甚至诱发重症肝炎导致患者的死亡。根据先前的临床观察,HBsAg携带者或已实现临床治愈的HBsAg阴性患者,在接受激素、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂等之后,发生HBV再激活的风险增加,表明了免疫因素即使在先前自发病毒控制的病人仍然在抑制病毒过程中发挥着极其重要的作用。目前尚不清楚慢性乙型肝炎中断NA治疗之后的病毒学复发是否与机体免疫状态存在着联系。自然杀伤（natural killer,NK）细胞和病毒特异性T细胞是两种最主要的效应细胞,在清除HBV过程中扮演着非常重要的角色。然而,慢性HBV感染阶段,特别在是高病毒血症的患者,NK细胞和HBV特异性T细胞表现为功能失调,抗病毒能力明显减弱。本研究着重从免疫学的角度出发,分析NK和病毒特异性T细胞反应在中断NA治疗之后的纵向变化,并分析其与病毒学复发和肝脏损伤之间的相关性。为了进一步阐明其在影响病毒学反应中的作用,中断NA治疗时的细胞免疫也与自发性病毒控制的非活动性携带者和失败的病毒控制的HBeAg阴性肝炎患者进行横断面比较。方法1.研究设计:我们共随访24例经NA治疗HBeAg阴性的患者,在取得完全病毒学缓解（HBV DNA<500 copies/mL）之后,巩固治疗时间至少超过两年,中断治疗时血清HBsAg水平>200 IU/mL,随访至少超过一年,根据一年以内是否出现HBV DNA>1×104 copies/mL,我们将其分为两组:病毒学复发组（virologic relapse,VR）和非复发组（no virologic relapse,NVR）;我们也随访了19例基线血清HBsAg水平>200 IU/mL的非活动性携带者;此外,28例HBeAg阴性的慢性肝炎患者作为对照组。2.门诊或住院部采集患者外周血样,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,并留取血浆,冻存。3.流式细胞术分别检测NK细胞及其亚型的频率、表型、分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α的能力和细胞毒活性。4.利用HBV核心抗原和S抗原的肽库分别刺激PBMCs,体外培养10天后,流式细胞术检测CD4+或CD8+T细胞产生细胞因子IFN-γ和IL-2的水平。5.体外IFN-γ的酶联免疫斑点实验（ELISpot）。结果研究队列的临床特点中断NA治疗后一年以内,14名患者发生病毒学复发（HBV DNA>1×104copies/mL）,其中9名患者发生临床复发（同时满足HBV DNA>1×104 copies/mL和ALT>80 U/L）,一年以内累积的病毒学复发和临床复发率分别为58.3%和37.5%。作为对比,IC组在一年的随访中仅有2名患者出现血清HBV DNA水平>1×104copies/mL,其中只有1名患者出现ALT异常（ALT>80 U/L）,均低于中断NA治疗组（P<0.05）。血清HBsAg水平与ENEG组相比,VR组和NVR组中断治疗时,以及IC组血清HBsAg水平明显较低（P<0.01）。然而,VR组、NVR组和IC组之间的血清HBsAg水平无统计学差异（P>0.05）。NVR组中断治疗后一年以内血清HBsAg水平维持相对稳定,而VR组病毒学反弹时的血清HBsAg水平明显高于中断NA治疗时的血清HBsAg水平（P<0.05）。NK细胞的频率VR组和NVR组NK细胞及CD56bright亚型的频率无明显差异（P>0.05）,且与ENEG组和IC组相比无明显差异（P>0.05）。与中断NA治疗时相比,无论是VR组还是NVR组,NK细胞及CD56bright亚型的频率在一年的随访中均无明显变化（P>0.05）。NK细胞的表型VR组和ENEG组NK细胞表达抑制性受体CD96的水平明显高于NVR组和IC组（P<0.05）。VR组NK细胞表达的抑制性受体NKG2A水平明显高于IC组（P<0.05）。同样,VR组在停药后第1、6月NK细胞表达CD96的水平,和第3月NK细胞表达NKG2A的水平均显着高于NVR组（P<0.05）。此外,与VR、NVR、IC组相比,ENEG期CD69+NK细胞频率明显增加（P<0.05）。纵向上来看,NVR组NK细胞表面受体的表达在一年的随访中相对稳定。与此对比,VR组NK细胞表达活化性受体NKp44、NKG2C和CD69的水平在第6个月和第12个月时相较中断治疗时明显增加。NK细胞功能与ENEG组相比,VR组的NK细胞在中断NA治疗时产生IFN-γ的能力部分恢复,但是无论是IL-12/IL-18还是PMA/离子霉素刺激,均明显弱于NVR组和IC组（P<0.05）。与IC组相比,VR组在中断NA治疗时NK细胞产生TNF-α的能力相对减弱（P<0.05）。NK细胞的杀伤活性是通过检测穿孔素、颗粒酶B的表达以及CD107a的脱颗粒来决定,以上四组的细胞毒活性并无明显差异。此外,VR组在中断NA治疗之后第1、3、6、12月NK细胞产生IFN-γ的能力均明显低于NVR组（P<0.05）。在纵向分析中,NVR组在中断NA治疗后一年以内NK细胞表达IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B和CD107a水平无明显改变（P<0.05）。相比之下,与中断NA治疗时相比,VR组停药后第6、12月NK细胞表达穿孔素和CD107a的水平均明显增加（P<0.05）。NK细胞功能与肝脏损伤的相关性与中断NA治疗时和HBV DNA<1×104 copies/mL时相比,VR组在HBV DNA>1×104 copies/mL时NK细胞表达穿孔素和CD107a的水平明显增加,而NK细胞表达IFN-γ的能力却没有相应改善,表明了NK细胞功能向细胞毒活性发生偏移。此外,增加的穿孔素或CD107a阳性的NK细胞频率与病毒学复发时的血清ALT水平呈正相关（P=0.003和P<0.001）。病毒特异性T细胞反应HBV核心抗原（core）肽库刺激的T细胞反应,在中断治疗时及其后第3、6和12月CD4+T细胞产生IFN-γ,在第6月时CD8+T细胞产生IFN-γ,在第1、6月时CD4+T细胞产生IL-2的水平均明显低于NVR组（P<0.05）。与此同时,VR组和NVR组HBV S抗原肽库刺激的T细胞反应并无显着性差异。横断面分析显示,与ENEG组相比,NVR组core肽库刺激的CD4+T细胞产生的IFN-γ和IL-2的水平显着提高（P<0.05）。然而,与ENEG组相比,VR组core或S抗原肽库刺激的T细胞反应却无明显改善。与ENEG和VR组相比,IC组core抗原肽库刺激的T细胞反应均明显增强（P<0.05）。体外IFN-γELISpot分析显示NVR组中断治疗后第3、6月时core肽库刺激的SFC值明显高于VR组（P<0.05）。此外,在core肽库刺激的反应中,NVR组在中断治疗时SFC值高于ENEG组,VR组和ENEG组则明显低于IC组（P<0.05）。除NVR组停药后第6月时产生IFN-γ的S抗原特异性CD8+T细胞外,与中断治疗时相比,我们未观察到core或S特异性T细胞应答的实质性变化。结论低的NK细胞产生IFN-γ的能力和core特异性T细胞反应与中断NA治疗之后的病毒学复发有关。与非活动性携带者相比,经NA治疗的患者显示出更受损的NK和病毒特异性T细胞反应,这与后者停药后比较高的病毒学复发和临床复发率相一致。NK细胞在病毒学复发时呈现为活化性的表型,功能向细胞毒活性发生偏移,且这种增加的细胞毒活性与中断NA治疗之后的肝脏损伤有关。本研究的科学价值我们的本研究有助于理解中断NA治疗之后病毒学复发和临床复发背后的免疫学机制,并为安全停药提供指导。针对NK细胞和HBV特异性T细胞的免疫治疗可以逆转病毒与宿主免疫之间的失衡,从而有助于实现更持久的病毒控制,甚至到达临床治愈。此外,我们的研究也提供了一种有希望的策略:如果难以实现HBsAg血清学清除,在部分患者可通过治疗实现有效的免疫重建,将其诱导成类似于非活动性携带者的状态,进而实现安全的断药。
唐环宇[10]（2018）在《人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的免疫原性调控机制研究》文中指出研究背景:视网膜色素上皮（Retinal pigmented epithelium,RPE）细胞是一层位于脉络膜毛细血管和视网膜感光细胞之间的多边形极性细胞,其离子转运、营养分泌、屏障作用以及吞噬代谢产物的功能对于维持视网膜感光细胞内外环境的稳定极其重要。包括糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性等致盲性眼病的发生都与RPE细胞的功能障碍有关,目前国内外对于此类疾病尚无明确有效的药物治疗手段。感光细胞和RPE细胞等终末分化细胞损伤后无法依靠自身再生修复,导致不可逆的视力丧失。近年来大量研究表明,干细胞替代疗法可有效缓解上述视网膜变性疾病的发展[1,2]。目前研究人员利用胚胎干细胞（hESC-RPE）和多能干细胞（iPS-RPE）成功诱导出表型与成RPE相近的治疗细胞,并且通过大量的动物和临床实验中证实,干细胞来源的RPE细胞移植对于视网膜变性疾病有明确的短期疗效[3,4],但研究发现这些治疗细胞在视网膜微环境中的长期生存并不理想,关键问题之一在于宿主对治疗细胞的免疫应答。研究表明:如果对受体的免疫应答不进行有效干预,绝大多数视网膜下腔的外源性RPE细胞在一定时间后都将发生免疫排斥反应[5]。视网膜独特的屏障结构,加上视网膜固有细胞分泌的一系列免疫调节因子,使视网膜在正常情况下处于免疫豁免状态,相对稳定的免疫微环境是神经视网膜发挥功能的重要前提。但视网膜色素变性的发生与炎症和自身免疫反应关系密切,血视网膜屏障的破坏和小胶质细胞的激活进一步改变了视网膜的免疫微环境[6,7]。此外,干细胞移植操作也可以损伤血视网膜屏障并引起炎症反应[8,9]。受到以上因素综合影响,移植后的RPE治疗细胞处于复杂的免疫微环境中,这是影响其移植后长期疗效的不利条件。为克服受体视网膜对外源性RPE细胞的免疫排斥反应,在移植手术前后需要系统应用多种免疫抑制剂。而免疫抑制剂的使用不但效果有限,还可能损伤患者的肝肾功能并且引起机会感染[10-12]。除此之外,干细胞临床转化研究人员正以各种方式探索获得可以逃避受体免疫攻击的“万能细胞”。目前已有科学家通过诱导PDL1和CTLA-4等抑制性配体在干细胞的表达,有效减少免疫细胞对治疗细胞的攻击[13],据此我们提出以下问题:胚胎干细胞来源的色素上皮（hESC-RPE）细胞的免疫原性是否也有关键调控点?能否通过一定手段处理治疗细胞以减少免疫排斥反应?研究目的:通过研究视网膜色素变性免疫微环境的变化,寻找威胁hESC-RPE细胞治疗细胞移植后长期生存的关键因素,并据此探索调控hESC-RPE细胞免疫原性的重要信号通路,找到干预hESC-RPE细胞免疫原性的有效方法,以改善细胞生存、保护细胞功能,更好地实现干细胞治疗视网膜色素变性的临床转化。研究方法:本研究分为三个部分:第一部分:视网膜色素变性的免疫微环境研究按照RCS大鼠发育与视网膜色素变性不同阶段的关系,将RCS分为变性早期（出生后20天,P20d）变性中期（出生后40天,P40d）、和变性晚期（出生后60天,P60d）。利用大鼠细胞因子蛋白芯片研究变性晚期RCS大鼠视网膜免疫微环境的变化;利用RT-PCR技术对变性早、中、晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞相关细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平进行评估。利用流式细胞术定量分析变性晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞的数量和激活状态并以免疫组织化学染色技术研究变性晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞分布;通过ELISA技术定量分析变性不同阶段RCS大鼠视网膜匀浆中IFN-γ的浓度,研究视网膜中IFN-γ浓度与视网膜色素变性的关系。第二部分:hESC-RPE细胞的诱导分化与细胞免疫原性研究将hESCs诱导为hESC-RPE细胞,并通过细胞免疫荧光染色和流式细胞术鉴定色素上皮细胞特异性标记物在hESC-RPE细胞的表达情况;利用RT-PCR技术检测胚胎干细胞特征基因和色素上皮细胞特征基因在hESC-RPE细胞的mRNA表达情况;流式细胞术检测hESC细胞向hESC-RPE细胞分化后人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）的表达变化,以及细胞因子IFN-γ处理hESC-RPE细胞前后HLA抗原的表达变化,研究IFN-γ对hESC-RPE细胞免疫原性的影响。第三部分:Ruxolitinib对hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究利用RNA-Sequence（RNA-Seq）技术对IFN-γ和Ruxolitinib处理后hESC-RPE细胞中基因表达谱进行分析;在不同Ruxolitinib浓度阻断预处理后,再以IFN-γ刺激hESC-RPE细胞:流式细胞术检测药物作用下HLA-ABC、HLA-DR、HLA-E和HLA-G的表达水平变化,研究Ruxolitinib与hESC-RPE细胞HLA表达的量效关系,利用RT-PCR技术从mRNA水平证实Ruxolitinib对hESC-RPE细胞HLA相关基因表达的影响,并利用Western-Blot验证Ruxolitinib对hESC-RPE细胞免疫原性的调控机制。通过共培养实验评估Ruxolitinib预处理对hESC-RPE细胞免疫原性的调控:ELISA试剂盒检测hESC-RPE细胞与CD4+T淋巴细胞共培养后上清中IFN-γ的浓度,评估hESC-RPE细胞对CD4+T淋巴细胞的激活;LDH实验检测hESC-RPE细胞与CD8+T淋巴细胞和NK细胞共培养后上清中乳酸脱氢酶水平,评估hESC-RPE细胞对细胞毒性免疫细胞的激活;细胞免疫化学技术分析Ruxolitinib预处理后hESC-RPE细胞对CD8+T淋巴细胞和NK细胞趋化作用的变化。利用两种动物模型验证Ruxolitinib对免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用:用Ruxolitinib预处理后将Luc慢病毒标记的hESC-RPE细胞移植于人源化免疫系统小鼠皮下,IVIS Spectrum活体成像系统观察并记录移植后不同时间点细胞代谢荧光素底物后产生的生物发光信号,以评估Ruxolitinib对人免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用;将Ruxolitinib预处理的hESC-RPE细胞移植于RCS大鼠视网膜下腔,分别在移植后不同时间点利用fERG检测大鼠视网膜电生理功能,以间接评估移植后在RCS大鼠视网膜下腔hESC-RPE细胞的存活和功能。研究结果:第一部分:视网膜色素变性的免疫微环境研究1.出生后60天RCS大鼠视网膜中IL-2和IFN-γ等淋巴细胞相关细胞因子的浓度显着升高,提示变性晚期视网膜中可能存在淋巴细胞的浸润和激活。2.CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11等趋化因子和IFN-γ、IL-2等细胞因子在RCS大鼠视网膜中mRNA表达水平显着高于相应天龄对照大鼠,且以上炎症因子在RCS大鼠视网膜中随天龄增加而表达上调。3.变性晚期RCS大鼠内层视网膜中有大量淋巴细胞的浸润,其中CD4+T淋巴细胞和NK细胞是视网膜中IFN-γ的重要来源。4.RCS大鼠视网膜中IFN-γ浓度随天龄增加而升高,且在出生后60天与对照大鼠视网膜中IFN-γ浓度形成统计学差异。第二部分:hESC-RPE细胞的诱导分化与细胞免疫原性研究1.分化诱导第70天的hESC-RPE细胞高表达色素上皮细胞特异性标记物Bestrophin、CRALBP、MITF和RPE65,其中Bestrophin主要表达于细胞膜,CRALBP主要表达于胞浆,RPE表达于细胞膜和胞浆,MITF主要表达于细胞核。2.在hESC向hESC-RPE细胞分化的过程中,干细胞特征性基因OCT4、Nanog和SOX2表达显着下调,而色素上皮细胞特征性基因表达显着上调。3.HLA-ABC、HLA-DR、HLA-E和HLA-G抗原在正常培养条件下hESC和hESC-RPE细胞的表达均较低;但在IFN-γ处理后,hESC-RPE细胞所有HLA抗原表达均显着上调。第三部分:Ruxolitinib对hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究1.IFN-γ对hESC-RPE细胞的主要生物学效应为上调HLA抗原的表达,增强细胞抗原提呈作用、促进免疫排斥反应的发生。2.IFN-γ可通过提高hESC-RPE细胞STAT1蛋白表达和磷酸化水平诱导细胞HLA抗原表达,而一定浓度的Ruxolitinib预处理细胞可有效阻断IFN-γ的效应。3.IFN-γ对hESC-RPE细胞的紧密连接和吞噬功能都有损害,但一定浓度Ruxolitinib预处理可以保护细胞功能。4.IFN-γ可上调hESC-RPE细胞免疫原性,表现为hESC-RPE细胞对免疫细胞的趋化和激活,而Ruxolitinib预处理可降低hESC-RPE细胞的免疫原性。5.Ruxolitinib预处理可延长细胞在人源化免疫系统小鼠体内的存活时间;将Ruxolitinib预处理的hESC-RPE细胞移植于RCS大鼠视网膜下腔,在移植后早期（6周内）视网膜fERG检测结果与系统服用免疫抑制剂无显着差别,均能延缓RCS视网膜色素变性大鼠视功能的衰退。研究结论:1.视网膜色素变性改变了视网膜内相对免疫豁免的微环境,视网膜中淋巴细胞趋化因子和细胞因子表达水平逐渐升高,并在病变后期引起淋巴细胞的浸润和激活。淋巴细胞分泌的细胞因子IFN-γ在视网膜中浓度显着增加,表明细胞免疫的参与是其病变发生机制之一。2.胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化后,细胞免疫原性维持极低水平,但IFN-γ的刺激可显着提高hESC-RPE细胞免疫原性。IFN-γ对hESC-RPE细胞的主要生物学效应为上调HLA抗原的表达增强细胞抗原提呈作用、促进免疫排斥反应的发生。3.首次将JAK-STAT信号通路抑制剂Ruxolitinib应用于干细胞免疫原性研究,并且在hESC-RPE细胞上验证了Ruxolitinib调节细胞免疫原性的机制:通过阻断STAT1的蛋白表达和磷酸化抑制细胞在IFN-γ刺激下HLA抗原的上调,降低细胞的免疫原性,有效减少其对CD4+辅助性T淋巴细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的趋化和激活作用。4.创新性地运用人源化免疫系统小鼠模型,证明Ruxolitinib预处理对免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用;并通过RCS大鼠视网膜下腔细胞移植实验证明Ruxolitinib可以改善hESC-RPE细胞在变性视网膜免疫微环境中的存活,更好地保护RCS大鼠视觉功能。
二、γ干扰素及淋巴细胞可阻碍肿瘤的早期发育及其免疫原性的形成（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、γ干扰素及淋巴细胞可阻碍肿瘤的早期发育及其免疫原性的形成（论文提纲范文）
（1）杜仲叶多糖偶联OVA脂质立方液晶对小鼠免疫活性探究（论文提纲范文）
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| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物多糖的研究概况 |
| 1.2 天然高分子化合物的偶联研究概况 |
| 1.2.1 天然高分子化合物的介绍及应用 |
| 1.2.2 天然高分子化合物的偶联方法 |
| 1.2.3 天然高分子化合物偶联物在生物医学的研究与应用 |
| 1.3 脂质立方液晶的研究 |
| 1.3.1 脂质立方液晶 |
| 1.3.2 脂质立方液晶作为载药体的优势 |
| 1.4 小结与展望 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 PsEUL的提取与优化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要药品及试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 杜仲叶多糖的提取 |
| 3.2.2 杜仲叶多糖红外光谱(IR)分析 |
| 3.2.3 硫酸苯酚法测定杜仲叶多糖的含量 |
| 3.2.4 杜仲叶多糖脱色方法 |
| 3.2.5 统计方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 杜仲叶多糖红外光谱分析 |
| 3.3.2 杜仲叶多糖含量测定结果 |
| 3.3.3 杜仲叶多糖脱色效果 |
| 3.4 分析讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 PsEUL-OVA的制备与表征 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 主要药品及试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 多糖与蛋白的偶联 |
| 4.2.2 PsEUL-OVA结构表征 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 PsEUL-OVA分离纯化 |
| 4.3.2 红外光谱分析 |
| 4.3.3 SDS-PAGE结果 |
| 4.3.4 扫描电镜结果 |
| 4.3.5 多糖与蛋白的结合程度 |
| 4.4 分析讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 PsEUL-OVA体内外免疫活性的探究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验细胞株 |
| 5.1.3 主要药品及试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 小鼠脾细胞培养 |
| 5.2.2 巨噬细胞培养 |
| 5.2.3 PsEUL-OVA对小鼠脾细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 5.2.4 PsEUL-OVA对小鼠RAW264.7 巨噬细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 5.2.5 PsEUL-OVA对小鼠脾细胞/巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响 |
| 5.2.6 巨噬细胞吞噬试验 |
| 5.2.7 小鼠体内免疫分组及血清和免疫器官处理 |
| 5.2.8 流式细胞术分析 |
| 5.2.9 血清抗体水平测定 |
| 5.2.10 血清细胞因子分析 |
| 5.2.11 统计方法 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 体外试验结果 |
| 5.3.2 体内试验 |
| 5.4 分析讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 PsEUL-OVA脂质立方液晶(PsEUL-OVA/Cubs)的制备与表征 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 主要药品及试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 PsEUL-OVA/Cubs制备 |
| 6.2.2 PsEUL-OVA/Cubs结构表征 |
| 6.2.3 PsEUL-OVA/Cubs包封率与载药量测定 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.3.1 透射电镜结果 |
| 6.3.2 偏光显微镜观察结果 |
| 6.3.3 Zeta电位和粒径分析结果 |
| 6.3.4 PsEUL-OVA/Cubs包封率与载药量测定结果 |
| 6.4 分析讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 PsEUL-OVA/Cubs体外免疫活性的探究 |
| 7.1 试验材料 |
| 7.1.1 试验细胞株 |
| 7.1.2 主要药品及试剂 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.2 试验方法 |
| 7.2.1 小鼠脾淋巴细胞培养 |
| 7.2.2 巨噬细胞培养 |
| 7.2.3 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 7.2.4 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠RAW264.7 巨噬细胞毒性(细胞活性)试验 |
| 7.2.5 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞/巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响 |
| 7.2.6 巨噬细胞吞噬试验 |
| 7.2.7 PsEUL-OVA/Cubs对RAW264.7 巨噬细胞免疫相关基因表达的影响 |
| 7.2.8 统计方法 |
| 7.3 试验结果 |
| 7.3.1 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞毒性(细胞活性)试验结果 |
| 7.3.2 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠巨噬细胞活性试验结果 |
| 7.3.3 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠脾细胞/巨噬细胞细胞因子分泌水平的影响 |
| 7.3.4 巨噬细胞对PsEUL-OVA/Cubs吞噬试验 |
| 7.3.5 PsEUL-OVA/Cubs对RAW264.7巨噬细胞相关基因 |
| 7.4 分析讨论 |
| 7.5 本章小结 |
| 第8章 PsEUL-OVA/Cubs体内免疫活性的探究 |
| 8.1 试验材料 |
| 8.1.1 试验动物 |
| 8.1.2 主要药品及试剂 |
| 8.1.3 主要仪器 |
| 8.2 试验方法 |
| 8.2.1 小鼠体内免疫分组及血清和免疫器官处理 |
| 8.2.2 流式细胞术分析 |
| 8.2.3 血清抗体水平测定 |
| 8.2.4 血清细胞因子分析 |
| 8.2.5 统计方法 |
| 8.3 试验结果 |
| 8.3.1 小鼠免疫器官指数 |
| 8.3.2 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠血清中OVA特异性IgG的影响结果 |
| 8.3.3 PsEUL-OVA/Cubs对小鼠血清细胞因子的影响结果 |
| 8.3.4 流式细胞术分析结果 |
| 8.4 分析讨论 |
| 8.5 本章小结 |
| 第9章 全文总结 |
| 9.1 结论 |
| 9.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）吉西他滨增强肺癌免疫原性和NK细胞活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 肺癌的免疫治疗和分子靶向治疗综述 |
| 第一部分 肺癌的免疫治疗 |
| 2.1 应激反应 |
| 2.1.1 CRT |
| 2.1.2 HMGB1 |
| 2.1.3 HSPs |
| 2.1.4 ATP |
| 2.2 NKs的抗肿瘤作用 |
| 2.2.1 NKs的定义及功能 |
| 2.2.2 NKs对肿瘤的免疫监视 |
| 2.2.3 NKs清除肿瘤 |
| 2.2.4 NKG2D和抗肿瘤免疫 |
| 2.3 解除肿瘤微环境中的免疫抑制 |
| 2.4 抑制免疫逃逸 |
| 2.4.1 免疫检查点抑制剂 |
| 2.4.2 TIGIT |
| 2.4.3 TIM-3 |
| 2.4.4 LAG-3 |
| 2.5 免疫系统对化疗疗效的影响 |
| 2.6 癌症疫苗 |
| 第二部分 肺癌的分子靶向治疗 |
| 2.7 EGFR-TKIs |
| 2.8 ALK基因重排 |
| 2.9 ROS-1 基因重排 |
| 2.10 K-Ras基因突变 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 细胞培养相关试剂 |
| 3.2.3 细胞刺激和小鼠治疗化疗药 |
| 3.2.4 细胞分选相关试剂 |
| 3.2.5 免疫荧光相关试剂 |
| 3.2.6 流式细胞术相关试剂 |
| 3.2.7 NKG2D抗体流式细胞术相关试剂 |
| 3.2.8 RNA提取及逆转录PCR和实时荧光定量PCR相关试剂 |
| 3.2.9 小鼠组织细胞分离相关试剂 |
| 3.2.10 CFSE试剂 |
| 3.2.11 Dead染色试剂 |
| 3.3 实验仪器 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 细胞培养 |
| 3.4.2 细胞冻存与复苏 |
| 3.4.3 化疗药刺激细胞 |
| 3.4.4 LLC细胞皮下荷瘤小鼠模型 |
| 3.4.5 LLC细胞皮下荷瘤小鼠化疗药治疗 |
| 3.4.6 小鼠脾脏单个核细胞分离 |
| 3.4.7 流式细胞术检测表面分子 |
| 3.4.8 流式细胞术检测胞内分子 |
| 3.4.9 磁珠分选(MACS)NKs |
| 3.4.10 流式细胞分选 |
| 3.4.11 免疫荧光染色 |
| 3.4.12 细胞总RNA提取 |
| 3.4.13 逆转录(RT)反应 |
| 3.4.14 荧光定量PCR(q-PCR) |
| 3.4.15 血常规检测 |
| 3.4.16 NKs体外杀伤(CFSE) |
| 3.4.17 NKs体外杀伤(RTCA) |
| 3.4.18 H&E染色 |
| 3.4.19 流式细胞术检测NKG2DLs的表达 |
| 3.4.20 Dead染色 |
| 3.4.21 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 第一部分低剂量GEM可增强肺癌免疫原性分子的暴露 |
| 4.1.1 GEM诱导肺癌免疫原性的体外研究 |
| 4.1.2 GEM诱导肺癌免疫原性的体内研究 |
| 4.1.3 小结 |
| 4.2 第二部分低剂量GEM治疗可增强NKs驱动的肿瘤免疫 |
| 4.2.1 GEM可诱导肺癌固有免疫系统相关免疫原性分子上调 |
| 4.2.2 小鼠血常规检测 |
| 4.2.3 GEM治疗可活化小鼠NKs |
| 4.2.4 低剂量GEM治疗增加NKs IFN-γ表达,高剂量GEM治疗损害NKs增殖 |
| 4.2.5 NKG2D+NKs表达IFN-γ水平高于NKG2D-NKs |
| 4.2.6 小鼠脾脏淋巴细胞变化 |
| 4.2.7 淋巴细胞的门控策略及典型流式图 |
| 4.2.8 CFSE杀伤实验 |
| 4.2.9 皮下荷瘤小鼠GEM治疗后脾脏NKs杀伤LLC细胞 |
| 4.2.10 RTCA杀伤实验 |
| 4.2.11 GEM对小鼠脾脏NKs Ki67,IFN-γ和 NKG2D的表达无直接影响 |
| 4.2.12 小结 |
| 4.3 第三部分低剂量GEM抑制小鼠肺癌的生长 |
| 4.3.1 LLC皮下荷瘤小鼠皮下瘤拍照及小鼠体重 |
| 4.3.2 LLC皮下荷瘤小鼠肝脏、肾脏H&E染色 |
| 4.3.3 小结 |
| 第5章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）双网络生物材料促进皮肤驻留调节性T细胞的局部浸润和功能表达对烧伤创面愈合过程的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、皮肤Treg在烧伤创面愈合过程中的作用 |
| 1.1 动物、仪器与试剂 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 仪器与试剂 |
| 1.2 实验方法及观察指标 |
| 1.2.1 烧伤动物模型的制备 |
| 1.2.2 皮肤Treg的阶段性诱导性耗竭及相应分组 |
| 1.2.3 伤口的测量与组织形态学分析 |
| 1.2.4 皮肤淋巴细胞的分离 |
| 1.2.5 皮肤Treg的荧光抗体染色 |
| 1.2.6 流式细胞学测定 |
| 1.3 统计学方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 烧伤愈合过程中皮肤Treg细胞浸润占比变化 |
| 1.4.2 体内注射DT期间对烧伤愈合过程中皮肤局部Treg细胞的浸润影响 |
| 1.4.3 早期注射DT耗竭Treg对小鼠皮肤创面愈合的影响 |
| 1.4.4 晚期注射DT耗竭Treg对小鼠皮肤创面愈合的影响 |
| 1.4.5 早期与晚期注射 DT 耗竭 Treg 对小鼠皮肤创面愈合作用的组织形态学表现 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 二、GC/Alg材料在烧伤创面愈合过程的作用及对皮肤Treg的作用 |
| 2.1 动物、仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法及观察指标 |
| 2.2.1 GC/Alg双网络水凝胶生物材料的制备 |
| 2.2.2 实验动物分组及材料的固定 |
| 2.2.3 伤口的测量与组织形态学分析 |
| 2.2.4 皮肤Treg荧光抗体染色 |
| 2.2.5 流式细胞学测定 |
| 2.3 统计学方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 固定GC/Alg材料对小鼠皮肤创面愈合的影响 |
| 2.4.2 固定 GC/Alg 材料的小鼠对皮肤 Treg 细胞浸润和功能表达的影响 |
| 2.4.3 固定GC/Alg材料的小鼠皮肤创面愈合的组织形态学表现 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 实验所需主要试剂及配制方法 |
| 综述 皮肤调节性T细胞与创面愈合及免疫疾病的关系研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）WP1066靶向抑制JAK2/STAT3抗胰腺癌机制的研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床标本检测结果 |
| 2.2 体外实验结果 |
| 2.3 体内实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 胰腺癌免疫治疗新进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录:攻读硕士学位期间发表的部分学术论着 |
（6）鹦鹉热衣原体多表位融合疫苗的设计优化及抗感染保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 Cps MOMP、质粒蛋白CPSIT_p6优势抗原表位的预测、鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 Cps多表位融合疫苗抗感染免疫保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 滴鼻、肌肉注射联合免疫对Cps多表位融合疫苗免疫效果的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 新型疫苗佐剂增强Cps多表位融合抗原抗感染保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 本研究受以下基金资助 |
| 致谢 |
（7）肝细胞癌组织中PD-1和TIM-3的表达及其意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 随访 |
| 1.3 免疫组化(SP 法) |
| 1.4 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 PD-1和TIM-3在肝癌组织中的表达情况 |
| 2.2 癌组织PD-1、TIM-3表达与患者临床病理参数的关系 |
| 2.3 肝癌组织中PD-1、TIM-3的表达与患者预后的关系 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 缩略语/符号说明 |
| 附录 B 《常见肿瘤AJCC分期手册(第八版)》中肝癌的TNM分期标准 |
| 附录 C 《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》中肝癌的临床分期标准 |
| 附录 D 个人简历 |
| 附录 E 综述 |
| 参考文献 |
（8）基于人mPGES1的CTL表位广谱多抗原肽的设计及体外抗肝癌活性的研究（论文提纲范文）
| 附录 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 人mPGES1的HLA-A2/A3 限制性CTL表位广谱多抗原肽的设计、合成及鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 三种m PGES1 四分支MAP的结构设计 |
| 2 合成m PGES1 广谱MAP的 RP-HPLC分析 |
| 3 合成m PGES1 广谱MAP的 LC/MS检测 |
| 讨论 |
| 第二部分 小鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 光学显微镜下小鼠DC的细胞形态 |
| 2 扫描电镜下成熟小鼠DC的表面结构 |
| 3 流式细胞仪鉴定的成熟小鼠DC表型 |
| 讨论 |
| 第三部分 人mPGES1的CTL表位多抗原肽负载小鼠树突状细胞疫苗的体外抗肝癌活性检测 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 靶细胞的筛选 |
| 2 效应细胞毒性作用的检测 |
| 3 疫苗诱导凋亡效应的检测 |
| 4 细胞因子IFN-γ分泌水平的检测 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）自然杀伤细胞和乙肝病毒特异性T细胞与中断核苷（酸）类似物后的病毒学复发和肝脏损伤相关性的研究（论文提纲范文）
| 华中科技大学博士学位论文创新点概述 |
| 中英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 研究队列的临床特点 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 NK细胞与中断NA治疗后的病毒学复发及肝脏损伤相关性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBV特异性T细胞与中断NA治疗后的病毒学反应相关性的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述:固有和适应性免疫应答在HBV感染中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表论文 |
（10）人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的免疫原性调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 视网膜色素变性的免疫微环境研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 hESC-RPE细胞的诱导分化与免疫原性变化研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Ruxolitinib对免疫微环境中hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 视网膜变性疾病的细胞替代治疗与免疫排斥反应 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的与课题相关的论文及获奖情况 |
| 致谢 |
四、γ干扰素及淋巴细胞可阻碍肿瘤的早期发育及其免疫原性的形成（论文参考文献）
- [1]杜仲叶多糖偶联OVA脂质立方液晶对小鼠免疫活性探究[D]. 杨杰. 西南大学, 2021
- [2]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [3]吉西他滨增强肺癌免疫原性和NK细胞活性的研究[D]. 张鑫. 吉林大学, 2020(08)
- [4]双网络生物材料促进皮肤驻留调节性T细胞的局部浸润和功能表达对烧伤创面愈合过程的作用研究[D]. 信跃文. 天津医科大学, 2020
- [5]WP1066靶向抑制JAK2/STAT3抗胰腺癌机制的研究[D]. 姜晓玲. 三峡大学, 2020(06)
- [6]鹦鹉热衣原体多表位融合疫苗的设计优化及抗感染保护作用研究[D]. 李育萌. 南华大学, 2020
- [7]肝细胞癌组织中PD-1和TIM-3的表达及其意义[D]. 周舸. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [8]基于人mPGES1的CTL表位广谱多抗原肽的设计及体外抗肝癌活性的研究[D]. 刘霖. 福建医科大学, 2019(07)
- [9]自然杀伤细胞和乙肝病毒特异性T细胞与中断核苷（酸）类似物后的病毒学复发和肝脏损伤相关性的研究[D]. 王文涛. 华中科技大学, 2019(03)
- [10]人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的免疫原性调控机制研究[D]. 唐环宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)