一、胚胎干细胞与哺乳动物克隆（论文文献综述）
袁霞[1]（2021）在《CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究》文中进行了进一步梳理在哺乳动物中,可以通过体细胞核移植、体外受精和胚胎移植等胚胎工程技术以及超低温冷冻技术实现种质资源的保护和物种复原。然而由于禽类为卵生动物,其胚胎发育方式与哺乳动物相比有很大差异,导致这些胚胎工程技术和冷冻保存技术无法在禽类上广泛应用,极大地阻碍了禽类胚胎工程的研究和珍稀物种保护工作。而禽类原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）具有迁移的特性,体外培养的鸡PGCs注入正常孵化的鸡胚血管后可在受体胚胎性腺中增殖并产生了嵌合体鸡,且鸡PGCs移植到鸭早期胚胎中也能够获得嵌合体鸭,表明PGCs的异体/种间移植或许能解决禽类种质资源保存的问题。然而由于分离原代PGCs细胞数量少,且需以牺牲早期胚胎为代价,导致PGCs异种间移植应用并不广泛,禽类种质资源保护仍面临巨大难题。2006年,诱导干细胞技术问世,体细胞经过诱导重编程能够形成与胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）类似的诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPS）,诱导体细胞重编程技术的出现给为珍稀禽类的保种、转基因禽类的生产等研究开辟了新思路,诱导体细胞重编程技术能够为禽类的胚胎工程和转基因工程研究提供新的干细胞来源,诱导重编程所需的禽类体细胞的分离和冷冻技术相对简单,能够短时间获取大量的细胞,并且对个体不会造成较大伤害,因此,若能通过诱导重编程技术将禽类体细胞重编程为iPS并进一步诱导成PGCs,便能极大地解决PGCs分离困难且无法大量获得的难题。目前,诱导体细胞重编程技术已在小鼠、人、大鼠、猪、猴、牛、羊、鸡等多个物种上成功应用。本课题组前期建立了原代PGCs迁移归巢模型并成功产生了后代,同时建立了 CEF诱导鸡iPS并进一步诱导分化为iPGCs的转分化体系,但这一转分化体系的诱导效率较低,且CEF转分化形成的iPGCs细胞是否具有原代PGCs同样的产生后代的能力仍不清楚。因此,本研究利用OCT4、SOX2、NANOG、LIN28（OSNL）因子体系诱导黑羽狼山鸡CEF重编程为iPS,对该体系进行优化,通过BMP4/BMP8b/EGF体系将其诱导分化为iPGCs,进一步通过转录组测序对不同体系诱导获得的iPS细胞及iPGCs进行分析,分别比较其与原代ESCs和PGCs之间的异同,最后通过鸡胚血管移植的技术将黑羽狼山鸡iPGCs移植到受体隐性白羽鸡中,孵化出壳后饲养至性成熟,通过公母鸡自交产生后代,借助微卫星检测以及基因组重测序分析后代鸡是否来源于黑羽狼山鸡iPGCs,为实现PGCs在禽类种质资源保护过程中的广泛应用奠定基础。研究结果如下:（1）鸡iPS诱导体系的优化本研究利用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28A（OSNL）重编程体系对鸡成纤维细胞CEF进行诱导重编程,获得了与ESCs有相似特性的狼山鸡iPS,为碱性磷酸酶染色阳性,表达SSEA-1蛋白,体外能够分化形成类胚体且表达三胚层标记基因。荧光定量结果显示,从诱导重编程的第6天开始,内源性多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等的表达逐渐被激活,而成纤维细胞标记基因Thy-1的表达逐渐被沉默。对重编程过程中不同天数的糖酵解相关基因表达、酶活性、葡萄糖摄取量及乳酸产生量的变化进行检测,结果显示,从诱导的第6天开始,重编程过程中糖酵解相关基因Hk1,Ldha,Glut1,Pfkp表达逐渐上调,并且糖酵解关键限速酶己糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）及果糖-6-磷酸激酶（PFK）活性在诱导第9天均显着增强（P<0.05）。同时,葡萄糖摄取量逐渐增加,乳酸产生量出现极显着堆积（P<0.01）,表明鸡CEF诱导重编程为iPS的过程中糖酵解被激活。此外,随着重编程的进行,氧化磷酸化相关基因Ndufa10及Cox4i1的表达极显着下调（P<0.01）,且鸡iPS细胞的线粒体膜电位与CEF相比出现明显下降,表明氧化磷酸化被抑制。进一步通过添加糖酵解抑制剂和激活剂发现糖酵解能够激活内源多能性基因表达从而促进鸡iPS形成。通过生物信息学分析发现Oct4、Sox2和Nanog三个转录因子在糖酵解关键基因Hk1、Pfkp和Ldha的启动子区有共同的结合位点,双荧光素酶报告实验检测显示过表达Oct4,Sox2,Nanog极显着上调了Hk1、Pfkp和Ldha等基因的转录活性（P<0.01）,且过表达Oct4,Sox2,Nanog能够上调Hk1、Pfkp和Ldha的表达并提高糖酵解水平。因此本研究OSNL体系的基础上筛选了糖酵解激活剂2i-SP来优化iPS诱导体系,结果显示,添加2i-SP后糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Glut1的mRNA表达均上调,葡萄糖摄取量和乳酸产生量也有不同程度的提高。同时添加2i-SP后,诱导产生的iPS克隆数从24.33±2.08极显着增加至47.00±3.61（P<0.01）,流式分析检测SSEA-1阳性细胞比例也从1.59%±0.08极显着升高到11.47%±1.93（P<0.01）,表明2i-SP通过激活糖酵解来促进鸡iPS形成。以上结果表明糖酵解能够协同核心多能性因子促进鸡体细胞诱导重编程,小分子化合物2i-SP能够提高鸡iPS的形成效率。（2）不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究为了比较分析体外诱导重编程形成的鸡iPS细胞与ESCs的转录水平的异同以及添加不同小分子化合物对鸡iPS形成的影响,分析干细胞形成和糖代谢相关因子在不同诱导条件下的表达变化,本研究对不同体系诱导的鸡iPS、CEF及鸡ESCs进行RNA-seq,首先对不同样本的log10（FPKM）进行聚类热图分析,结果显示,重编程后的iPS基因表达模式与ESCs相似。对糖酵解及氧化磷酸化相关基因FPKM值进行聚类热图分析,结果显示iPS（OSNL）中糖酵解相关基因Hk1、Ldha、Pdk3、Pdk4、Pfkp、Slc2al、Hif1a等基因表达水平均高于iPS（OSNL）,而氧化磷酸化相关基因Mdufs1-6,Ndufa1-12等的表达水平均低于CEF,表明CEF诱导重编程为iPS后其代谢方式从氧化磷酸化转变为糖酵解。在iPS（OSNL）组和CEF组中,存在8376个基因差异表达,所有差异表达基因主要富集到细胞代谢相关的条目以及许多与糖代谢、脂代谢、蛋白合成相关的通路。与iPS（OSNL）vs CEF组相比,iPS（OSNL2i-SP）vs CEF组中有1 751个特异上调表达基因,主要富集到细胞生长调节、细胞周期正调控、胚胎骨骼系统形态发生等细胞生长发育调控的相关条目,并且还富集到自噬体、糖:质子转运体活动及碳水化合物代谢过程。（3）鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究本研究通过BMP4/BMP8b/EGF将黑羽狼山鸡iPS诱导分化,获得了 PAS染色阳性且表达Cvh、c-KIT、Blimp1等PGCs标记基因的iPGCs。对鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化进行检测发现在iPS诱导分化为iPGCs的过程中,糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Ldha的表达逐渐下降,并伴随着氧化磷酸化相关基因Ndufa10和Cox4i1表达的逐渐增加,同时葡萄糖摄取量逐渐减少,乳酸产生量也逐渐降低,表明鸡iPS诱导分化为iPGCs的过程中糖酵解被抑制。为了全面解析iPGCs中基因的表达情况;鉴定iPS来源的iPGCs是否具有正常的PGC相似的特性,以及研究iPGCs体外诱导形成过程中的机制,本研究对iPS诱导的iPGCs进行了转录组测序。层次聚类结果显示iPS来源的iPGCs的表达模式接近于原代PGCs。根据筛选出的PGCs标记基因表达情况制作小提琴图,结果显示iPS体外诱导的iPGCs细胞的PGCs标记基因表达模式与原代PGCs相近。在鸡iPGCs（iPS derived）组与PGCs组中,6555个基因存在差异表达,所有差异表达基因主要富集到了一些与糖类、脂类及蛋白质代谢相关的条目以及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸代谢、自噬和PPAR等信号通路,表明这些信号通路在体外诱导iPGCs的过程中可能发挥了重要的调控作用。（4）鸡iPGCs介导类克隆体系的建立本研究将黑羽狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs注射至孵化2.5天的隐形白羽鸡F1的血管中,建立鸡iPGCs介导的类克隆体系,利用F1代公母鸡自交获得了类克隆鸡后代F2,并对F2代类克隆鸡进行了微卫星鉴定。狼山鸡iPGCs经PKH26红色荧光细胞膜表面标记后在显微镜下呈红色荧光,分离移植了 PKH26标记的黑羽狼山鸡iPGCs细胞后的白羽鸡种蛋的生殖嵴,在显微镜下观察到受体鸡胚生殖嵴中PKH26标记的红色荧光。移植了黑羽狼山鸡CEF诱导重编程获得的iPGCs的F1代受体隐性白羽鸡胚共100枚,继续孵化至出壳并存活的F1代受体隐性白羽鸡共45只,饲养至性成熟后进行公母鸡自交,收集所产受精蛋孵化至出壳,记为F2代,共获得517只F2代后代鸡,其中F2代阳性类克隆鸡个数为193只类克隆鸡阳性率为37.33%。F2代继续饲养,至性成熟时进行测交,收集受精种蛋孵化至出壳,鸡为F3代,共获得140只F3代后代鸡,其中阳性类克隆鸡个数为64只,类克隆鸡阳性率为45.71%,接近50%。本研究选择MCW004及MCW104微卫星位点作为黑羽狼山鸡的特异分子标记,对F2代阳性类克隆鸡进行了 MCW004及MCW104位点的微卫星测序检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点的长度均不一,但阳性后代中仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明类克隆鸡为狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs来源的后代。本研究对F2代类克隆鸡自交产生的F3代类克隆鸡同样进行了微卫星检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点长度仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明本研究的CEF转分化为iPGCs介导的类克隆技术能够稳定遗传原供体的遗传特性。
张云峰[2]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中研究指明绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
蔡晨依[3]（2021）在《小鼠胚胎干细胞分化形成内耳祖细胞的诱导条件优化的研究》文中提出耳聋是人类最常见的由感音神经性损伤引发的疾病,该病影响着全球6%以上的人口,造成了严重的社会和经济影响。耳聋疾病的主要原因是内耳毛细胞的缺失或损伤,次要原因是内耳感觉神经元受损。作为终末分化的细胞,内耳毛细胞和感觉神经元在受损后无法再生,这使得耳聋疾病难以得到有效的治疗。目前,改善听力常通过佩戴助听器、人工耳蜗等方式实现,但这些设备改善听力的基础是:耳聋患者耳蜗中仍然存在一定量的毛细胞和感觉神经元。干细胞疗法为根治耳聋疾病提供了一条有效途径。胚胎干细胞具有无限增殖和分化为多种细胞类型的潜力,体外将胚胎干细胞诱导分化为多种内耳细胞类型,这些新生的细胞用以替代哺乳动物体内先天缺失或是损伤的内耳细胞,可以达到内耳功能的恢复。因此,利用干细胞疗法治疗耳聋疾病的过程中,如何通过体外诱导得到大量且稳定的内耳细胞至关重要。本研究以小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cell,mESC）为实验材料,成功构建出体外诱导mESC高效分化为内耳祖细胞的MC3T3诱导体系,从内耳祖细胞中分离并富集耳上皮祖细胞（oepithelial progenitor,OEP）和耳神经祖细胞（otic neural progenitor,ONP）,并构建了高效诱导OEP分化为类毛细胞的体系。首先,我们将mESC制备成104cells的拟胚体,用MC3T3条件培养液诱导拟胚体7d,通过免疫荧光等实验确定分化出的细胞为高表达Pax2、Pax8和Nestin内耳祖细胞。其次,我们通过设置不同的接种密度以及用耳干细胞全培养液培养内耳祖细胞,确定以6×104个/cm2密度接种的细胞为高表达Nestin基因的ONP细胞,以10×104个/cm2密度接种的细胞为高表达Pax2和Pax8基因的OEP细胞。我们还在耳干细胞全培养基中扩增OEP和ONP,确定OEP在扩增过程中仍可稳定高表达其标志性基因和蛋白,并发现第二代的OEP最适于后续的诱导分化为类毛细胞的实验。最后,我们用MC3T3条件培养液诱导OEP细胞6d,通过免疫荧光等实验确定分化所得的细胞为高表达Brn3c、Math1和MYO7A的类毛细胞。同时,我们还通过FM1-43和MYO7A的双染实验确定本研究分化所得的类毛细胞也许具备了初步的电生理功能,通过扫描电镜实验证明分化所得的类毛细胞表面具有丰富的不成熟的杂乱纤毛结构。总之,本研究成功构建了将mESC高效地诱导分化为内耳祖细胞和类毛细胞的MC3T3诱导体系,并确定了从内耳祖细胞中分离OEP和ONP的具体方法。本研究的诱导时间短、诱导效率较高且诱导方式简单,可以为干细胞疗法治疗耳聋疾病提供大量且稳定的细胞源。
尹姝媛[4]（2020）在《猪早期胚胎和胚胎干细胞体外培养体系优化的研究》文中指出目前已经有很多关于猪多能性干细胞的报道,但尚未获得有效的培养体系可以支持干细胞长时间稳定传代并实现生殖嵌合。胚胎质量和培养体系对胚胎干细胞的成功构建都具有重要意义。早期胚胎发育需要核心转录因子和相关信号通路共同发挥作用,而胚胎干细胞建立的过程相当于在体外添加化合物和细胞因子维持内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）的多能性并提供营养物质维持其生长和增殖的过程。因此,本研究根据各阶段胚胎测序数据筛选出调控ICM发育相关通路的激活剂,再通过在猪早期胚胎体外培养液和胚胎干细胞培养液中添加该类小分子,最终确定其对猪早期胚胎质量和胚胎干细胞多能性的影响,主要结果如下:1.通过对不同发育时期猪体内胚胎转录组数据进行分析并富集信号通路,结果表明:ICM形成过程中,WNT信号通路、cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路等参与调控ICM形成。在猪孤雌胚胎培养过程中分别添加富集到信号通路的小分子,筛选到CHIR99021和rpIL6可以促进囊胚发育。2.组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6验证其对孤雌囊胚质量的作用。结果表明:囊胚率（49.23±8.40%v.s.32.34±4.15%,P<0.05）、囊胚孵化率（16.19±1.96%v.s.10.25±1.12%,P<0.05）、ICM细胞数（7.72±2.30 v.s.4.28±1.60,P<0.01）提高,多能性基因OCT4（P<0.01）、SOX2（P<0.01）和NANOG（P<0.05）以及使WNT通路和JAK-STAT通路相关基因也上调表达。此外,此体系显着提高胚胎干细胞建系效率（KOFL体系:34.70±4.77%v.s.25.12±2.10%,P<0.05;LCDMIV体系:37.82±2.56%v.s.25.26±3.18%,P<0.01）。3.用体外受精胚胎验证组合添加1μM CHIR99021和10 ng/mL rpIL6的作用。结果表明此体系可以提高体外受精胚胎囊胚率（28.47±2.16%v.s.19.65±4.02%,P<0.05）、ICM细胞数（6.60±1.50 v.s.4.50±0.89,P<0.01）、囊胚孵化率（12.03±1.73%v.s.7.27±0.79%,P<0.05）,及OCT4（P<0.01）、SOX2（P<0.05）和NANOG（P<0.01）的表达。4.基于KOFL体系筛选提高细胞多能性的胚胎干细胞培养体系。结果表明:LCDM体系和添加rpIL6的LCDM体系都可以支持猪多能性干细胞维持,提高多能性基因OCT4、SOX2和REX1的表达;在KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可以提高单细胞传代能力,细胞增殖能力和多能性基因OCT4、SOX2和KLF4的表达。5.用细胞转化筛选的体系进行从头建系并进行再次优化。结果表明:pPSCs-LCDMIV支持单细胞传代,多能性基因OCT4（P<0.05）、SOX2（P<0.01）和NANOG（P<0.01）相对于pPSCs-KOFL的表达更高,细胞可传15代以上;pEPSC体系可以利用巴马品种的猪体内胚胎构建的胚胎干细胞系,细胞可以长时间稳定传代并维持较高的多能性,且具有分化为三胚层的能力;KOFL体系基础上添加SB431542、CHIR99021和Forskolin,维持高hLIF浓度并撤除bFGF组成LSCFors体系或者维持高bFGF浓度并降低hLIF浓度组成F-LSCFors体系,两个体系均可支持从头建系,多能性基因SOX2、NANOG和KLF4表达升高,但OCT4激活受限,细胞多能性部分提高。6.通过转录组数据筛选pPSCS-LSCFors和pPSCS-F-LSCFors中表达的信号通路,结果表明:LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAKSTAT信号通路和MAPK信号通路等上调表达,F-LSCFors体系中cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等上调表达,参与调控细胞多能性。以上结果表明,WNT信号通路、JAK-STAT信号通路、cAMP信号通路和PI3K-AKT信号通路等对于猪早期胚胎发育和胚胎干细胞多能性具有重要的调控作用。猪早期胚胎体外培养过程中激活WNT信号通路和JAK-STAT信号通路可以促进囊胚形成并提高囊胚质量。在猪胚胎干细胞培养过程中,添加细胞因子或化合物激活cAMP信号通路、PI3K-AKT信号通路、JAK-STAT信号通路和WNT信号通路等对胚胎干细胞多能性的提高和细胞增殖具有重要的意义。本研究优化了猪早期胚胎和猪胚胎干细胞的培养体系,有利于获得更多优质胚胎及多能性提高的胚胎干细胞系。
康宇[5]（2020）在《非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究》文中研究指明哺乳动物的胚胎早期发育开始于精子和卵子融合形成合子,之后经历卵裂、囊胚孵化、子宫定植等过程最终发育为完整个体。胚胎植入前发育的过程中会发生一系列重要的生物学事件,如母源——合子转化、合子基因激活、细胞谱系分化等。这些事件的有序发生均依赖于细胞内复杂的分子调控机制,并且极易受到环境应激因素的影响,如高温和内分泌干扰素都会干扰发育中的配子和胚胎正常发育,甚至产生可遗传的表观遗传变异。非人灵长类（NHPs）由于与人类极高的相似性,对其植入前胚胎发育机制的研究有助于解答人类早期胚胎发育的重要问题,同时,非人灵长类也是人类疾病研究的重要动物模型。本论文以猕猴和食蟹猴为对象,利用体外受精技术,开展植入前胚胎发育的转录调控机制和转化研究。研究通过收集猕猴植入前胚胎各个发育阶段的胚胎单细胞样本进行转录组测序,建立了完整的猕猴体外受精胚胎植入前发育转录组图谱。之后经过深入分析胚胎植入前发育过程的转录调控模式,发现灵长类早期胚胎发育中存在转录阻滞现象,桑葚胚时期的胚胎中有部分细胞的转录组停滞在合子基因激活之前阶段。在研究中还构建了体细胞核移植胚胎和单性生殖胚胎,这两类胚胎是研究合子基因组重编程机制及父源/母源印记基因调控的重要材料,通过获取这些胚胎的植入前发育单细胞转录组数据并与正常体外受精胚胎进行比较,发现体细胞核移植（SCNT）和单性生殖（孤雄/孤雌）胚胎的转录模式存在更为普遍的延迟,分析表明这种延迟主要是由异常的表观遗传修饰而导致的合子基因组激活不完全,胚胎发育率下降。通过外源手段消除体细胞核移植胚胎异常的H3K9me3,可以提高体细胞核移植胚胎发育率并且获得克隆动物。非人灵长类是研究人类疾病的理想动物模型。本论文利用CRISPR/Cas9技术进行了食蟹猴植入前胚胎的靶向基因编辑,获得DAX1基因突变猴模型。模型动物出现人类患者肾上腺发育不全（AHC）和低促性腺素性功能减退症（HH）的相关表型,经分析发现Wnt/β-catenin信号通路的异常激活导致的血管发生缺陷可能是DAX1基因突变胎儿时期肾上腺发育不良的主要原因。研究同时发现雄性食蟹猴DAX1缺陷导致的肾上腺和性腺发育缺陷在胎儿期性腺决定阶段就已经开始。通过食蟹猴植入前胚胎的干细胞嵌合实验,证明了非人灵长类胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（i PS）和体细胞核移植来源的胚胎干细胞（NT-ESC）都可以实现食蟹猴胚胎和成体水平嵌合,并且具有三胚层及胚外组织分化潜能。通过收集分析嵌合胚胎的单细胞转录组数据发现,食蟹猴多能干细胞的胚胎嵌合效率差异与其自身的多能性状态密切相关,并且受到嵌合胚胎微环境的调控。综上,本论文研究了非人灵长类胚胎早期发育的转录调控,并构建了疾病动物模型以及嵌合体,从而开展疾病机制和干细胞多能性研究。首次绘制了完整的灵长类植入前发育转录图谱,是对灵长类早期发育调控研究领域的重要补充;利用CRISPR/Cas9技术构建的疾病猴模型表现了其它物种不能出现的、与病人高度相似的表型,是人类复杂疾病研究的理想动物模型。
吴彩霞[6]（2020）在《基于TALEN与CRISPR/Cas9基因编辑技术的Tiki基因敲除猪和兔的建立》文中认为猪和兔是重要的农业经济动物和生物医药用动物,对猪和兔进行高效精确的基因编辑并获得基因修饰猪和兔模型具有非常重要的意义。在农业育种方面,基因修饰猪和兔模型可以成功提高动物个体生长速度,改良生产和抗病抗逆性状等,大大加速优良新品种的培育进程。在生物医药领域方面,由于物种差异性的存在,仅利用小鼠,大鼠等小型啮齿类动物模型几乎不能完全模拟人类的各种复杂的生命动态过程,例如模拟人类早期胚胎发育,特定组织器官生长发育过程以及人类疾病发生发展等。猪和兔是一种理想的大动物模型,相较于灵长类大动物模型而言,猪和兔繁殖周期更短,产仔数量更多,伦理道德限制更少;与啮齿类动物相比猪和兔在解剖及生理、生化特征以及营养代谢和免疫系统等方面与人更为接近。很多研究无法直接在人体中进行,可以构建基因修饰猪和兔模型进行更广泛的实验和评估,此外,基因修饰猪和兔模型对于特定基因的功能研究,在组织或器官生长发育过程的作用等生命动态过程研究方面具有重要的研究价值。哈佛大学教授贺熹《Cell》文章证实,Tiki1在爪蟾头部生成和发育的诱导过程中起着决定性的作用,而Tiki1基因在哺乳动物系统中发挥的功能和作用机制尚未有报道。Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因而无法利用啮齿类动物模型研究Tiki1基因在哺乳动物发育过程中的作用。本实验室对1215天处于原条期到神经沟阶段的猪胚胎进行了全胚胎原位杂交,实验结果也显示Tiki1基因在胚胎前端边缘处表达,但在猪等哺乳动物的胚胎发育过程中,Tiki1是否像在爪蟾上一样,对头部的诱导起着关键性的决定作用,需要加以验证。基因敲除是研究基因功能的主要途径之一,传统的基因敲除技术是同源重组,但对于猪这种既没有成功建立能够生殖系遗传的胚胎干细胞或诱导多能干细胞,克隆效率又较低的物种来说,利用同源重组结合体细胞克隆技术获得期望的基因打靶动物是极其困难的。本实验室曾尝试利用打靶效率极低的同源重组技术获得Tiki1基因打靶猪模型但未能成功。近几年兴起的核酸酶基因编辑技术,包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑工具,由于其效率高,为猪和家兔等这样一些克隆效率低下、又缺少能生殖系遗传的全能性胚胎干细胞物种的基因修饰开辟了新渠道,极大地推动了基因编辑猪和兔模型的研究进展。其中ZFN制备复杂、打靶效率低、成本高昂限制了其在基因修饰猪和兔研究中的应用。为了探究Tiki基因在不同物种间的功能差别,本研究先后利用TALEN与CRISPR/Cas9技术构建了Tiki基因敲除猪和兔。本研究首先针对猪内源性基因Tiki1基因外显子4设计了2对TALENs质粒,并在猪孤雌胚胎水平上进行了TALENs质粒的体外活性检测,比较了我们设计的TALENs质粒注射不同浓度时打靶效率及对胚胎发育的影响。结果表明:注射浓度升高,打靶效率也相应提高,TALENs的注射浓度对体外胚胎发育的影响不明显。利用我们设计的在胚胎水平上验证有效的TALENs质粒转染猪胎儿成纤维细胞,筛选获得86个细胞克隆,经测序鉴定其中6个为阳性细胞克隆,之后利用体细胞核移植技术成功构建了4头Tiki1单等位基因打靶猪模型。本研究利用X线计算机断层扫描（CT）和核磁共振成像（MRI）等影像学技术结合病理组织切片分析及临床生理生化分析等对Tiki1单等位基因敲除猪模型进行了表型分析,未发现Tiki1单等位基因敲除猪模型具有与爪蟾上类似的表型。考虑到物种差异及兔成本低实验周期短,本研究利用TALEN技术成功构建了Tiki1单等位基因敲除兔模型,结果也未发现Tiki1单等位基因敲除兔模型具有与爪蟾上类似的表型。由于TALEN的打靶效率尚不够高,本研究利用TALEN技术获得的猪和兔全是Tiki1单等位基因敲除动物模型。为了一步获得Tiki1双等位基因敲除猪模型,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了8个阳性单细胞克隆株,随后本研究利用体细胞核移植技术构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,经测序鉴定成功获得了12头Tiki1双等位基因敲除猪模型。后续本研究利用动物步态足迹实验和跑步机加速和恒速跑步等行为学实验对Tiki1双等位基因敲除猪模型进行了行为学表型分析,结果表明未发现Tiki1双等位基因敲除猪模型具有与爪蟾上类似的表型。考虑到Tiki基因包括Tiki1和Tiki2,二者之间可能存在协同或代偿机制,由于兔实验成本低周期短,而与兔相比猪实验成本高周期长,本研究优先选择兔为研究对象,利用CRISR/Cas9技术一步直接获得了Tiki1和Tiki2同时双等位基因敲除兔模型,结果也未发现Tiki1和Tiki2同时双等位基因敲除兔模型具有与爪蟾上类似的表型。综上所述,本研究通过上述所得各种基因型的Tiki基因敲除猪和兔模型均未发现具有与爪蟾上类似的表型,并且相关模型猪和兔均可以健康存活并能不断繁殖传代。本研究证实了Tiki基因在爪蟾与哺乳动物如猪和兔等不同物种间功能存在差异,Tiki基因在猪和兔等哺乳动物上确实对其早期胚胎的头部发育乃至个体的生长、发育和繁殖不是一个至关重要的基因,成功地澄清了Tiki基因与猪和家兔等哺乳动物早期胚胎头部发育的关系不同于爪蟾。
陈杨林[7]（2020）在《ACTIVIN A、bFGF、BMP4、LIF等因子介导的哺乳动物胚胎干细胞转换》文中进行了进一步梳理人和小鼠干细胞主要包括胚胎来源的多能性干细胞（Embryonic Stem Cells:ESCs）、成体细胞来源的特异性或单能性干细胞（Adult Stem Cells:ASCs）及成体细胞诱导的多能性干细胞（iduced Pluripotent Stem Cells:iPSCs）,这些细胞均具有不同程度的多能性及发育潜能。上述细胞展现出的发育潜能依赖于体外长期培养的培养体系,培养体系中除了基础培养液提供的营养物质外,添加的外源生长因子及小分子抑制剂对干细胞特性的维持至关重要。众所周知,干细胞被临床应用的前提是其具有多能性,可分化为各种器官或组织的细胞。但是在实际应用过程中,能够将干细胞诱导分化为具有特定组织特性的前体干细胞是更加重要的一步。寻找合适正确的培养基使ESCs在体内、体外分化为特定组织的前体干细胞,一直被科学家探索与关注。本研究主要在寻找合适培养基,即添加外源细胞生长因子如:碱性成纤维生长因子（bFGF）、骨形成蛋白4（BMP4）、白血病抑制因子（LIF）和激活素A（Activin A）等诱导胚胎来源干细胞分化为特定前体干细胞方面开展了实验。首先,我们尝试探索已确定的添加Activin A和bFGF,化学成分明确的N2B27干细胞基础培养基（AF medium）,是否可以用于培养不同遗传背景的小鼠囊胚,并建立多能性胚胎干细胞系（细胞命名为AFSCs）。我们选用了7种遗传背景的小鼠开展实验,发现纯合小鼠品系Sv129×Sv129、ICR×ICR和杂合小鼠品系ICR×GOF/GFP和C57BL/6×ICR的F1代胚胎可以利用上述体系建立与Sv129×GOF/GFP遗传背景AFSCs克隆状态、基因表达模式以及分化能力类似的AFSCs细胞系。其中C57BL/6×GOF/GFP遗传背景的AFSCs克隆类型不均一,细胞混杂。此外,纯合C57BL/6×C57BL/6和NOD×NOD遗传背景胚胎,在此体系中尚不能分离AFSCs细胞系,即使在体系中加入血清替代物（KSR）,对改善建系效率也并无明显作用。其次,我们探讨了生长因子bFGF、BMP4、LIF和Activin A在AFSCs向特定前体干细胞转化过程中的作用。我们发现,添加bFGF+BMP4+LIF的N2B27基础培养液（FBLM）和添加Activin A+BMP4的N2B27基础培养液（ABM）可以使AFSCs细胞特性发生明显转变,转换后的干细胞分别被命名为FBLSCs和ABSCs。FBLSCs和ABSCs具有干细胞特性,可以在体外长期自我更新并维持多能性。FBLSCs在体内胚胎中更倾向于贡献到胚胎的中胚层部位,这表明FBLSCs是一种类中胚层干细胞。ABSCs传代到50代,细胞仍然维持了多能基因Oct4和分化基因T共表达的特性;在体内ABSCs表现出神经中胚层祖细胞（neural mesodermal progenitors,NMP）、侧板中胚层（lateral plate mesoderm,LPM）和胚外细胞的特性;在E8.5-E13.5嵌合体胚胎中ABSCs贡献到胚胎的尾端上胚层、脑、脊髓、体节、卵黄囊和胎盘等部位。FBLSCs和ABSCs均展现出胚层前体干细胞的性质,因此是一类特异性的多潜能前体干细胞（Multipotent Progenitor Stem Cells,MPSCs）。最后,我们尝试了各种细胞因子组合在人ESCs体外培养过程中的调控作用,我们发现与AFSCs特征类似的primed hESCs细胞系使用添加LIF和GSK3抑制剂CHIR的培养基（CLM）进行诱导转化,hESCs细胞可以被转变为具有神经细胞属性的、可以长期稳定自我更新的原始神经细胞样干细胞（primitive nerve cell like stem cells,PNLSCs）。同时我们发现PNLSCs细胞特性的维持主要依赖WNT信号激活（CHIR）,而LIF对细胞影响较小;与hESCs相比,PNLSCs细胞发育潜能明显减弱。PNLSCs在自发分化时显示出神经细胞分化倾向,在进行定向诱导时具有分化为颅基板细胞的能力,是一种颅基板前体干细胞。综上所述,本研究探索了在化学成分明确的培养体系下,生长因子及小分子抑制剂Activin A+bFGF和bFGF+BMP4+LIF组合在小鼠AFSCs细胞转换过程中,CHIR+LIF组合在人ESCs细胞转换过程中发挥着重要的生物学作用。我们的研究将会为哺乳动物原肠胚发育和原肠胚中细胞分化的应用基础和转化研究提供重要的理论参考和实验依据。
徐辰泽[8]（2020）在《小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究》文中研究表明胚胎睾丸支持细胞（embryonic Sertoli cells,eSCs）是雄性胚胎发育过程中形成的第一种雄性特异性细胞,对性别决定具有至关重要的作用,并且分泌多种营养物质,能够对其它种类细胞,如精原干细胞（spermatogonia stem cells,SSCs）起到支持扩增或分化等功能。因此,对胚胎睾丸支持细胞发育形成机理进行研究有助于揭示胚胎性腺发育和性别决定机制,为将来的临床应用提供指导作用。然而,采用常规的组织分离方法从小鼠雄性胚胎中难以大量提取胚胎睾丸支持细胞,阻碍了对胚胎睾丸支持细胞的基础理论研究和实验应用。因此,建立新的胚胎睾丸支持细胞的体外诱导获取方法具有重要意义。近年来,有研究添加维甲酸（retinoic acid,RA）和激活素A（ActivinA）等物质,诱导小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）分化形成中间中胚层（intermediate mesoderm,IM）来源细胞,再通过卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）等蛋白因子化合物诱导胚胎睾丸支持样细胞（embryonic Sertoli-like cells,eSLCs）的形成。然而,这种诱导分化方法的分化途径和分子机制仍未阐明。另有研究将成纤维细胞进行基因重编程,通过转分化方式诱导出胚胎睾丸支持样细胞,表明5种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sox9和Dmrt1的表达可能对胚胎睾丸支持细胞的形成具有重要功能。因此,本论文根据以上小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导方法,结合已知的胚胎睾丸支持细胞在体内的发育途径和分子机理,首先在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化形成中间中胚层来源细胞,接着通过对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子分别进行时序性调控表达,成功诱导形成小鼠胚胎睾丸支持样细胞,建立了一种新的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。主要结果如下:一、比较并建立了小鼠胚胎干细胞培养和分化诱导方法。为提供分化潜能状态良好的大量小鼠胚胎干细胞,研究比较了不同滋养层和培养条件,结果表明采用TM4细胞来源的条件培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）滋养层进行培养,提高了小鼠胚胎干细胞复苏后的聚集和增殖能力。为建立合适的小鼠胚胎干细胞诱导方法,本研究首先根据已知方法通过添加维甲酸和激活素A诱导小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞进行分化。接着,针对Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子,比较了直接在细胞中进行转录表达调控和添加外源重组蛋白两种方法的诱导效果。结果表明通过慢病毒介导的转录表达调控方法更能有效诱导潜在的小鼠胚胎睾丸支持细胞祖细胞,即体腔上皮样细胞（coelomic epithelial-like cells）（CK18+）和性腺发育相关细胞（AMH+）的分化形成。二、建立了小鼠胚胎干细胞向小鼠胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型。为了在体外模拟出体内小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的发育途径,研究根据小鼠胚胎中雄性性腺细胞的发育规律,在小鼠胚胎干细胞向中间中胚层来源细胞诱导分化后,采用四环素启动子和光控启动子控制Wt、G1ata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1这6种发育相关因子进行时序性表达,并在诱导14天后鉴定出有潜在的胚胎睾丸支持样细胞（FSHR+/AMH+）形成。通过细胞形态学、特异性标志物的蛋白表达和标志性基因的转录表达,鉴定和分析了小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化的过程。结果表明:小鼠胚胎干细胞在0-8.5天分化形成中间中胚层来源细胞;在9.5-11.5天从中间中胚层来源细胞中分化形成体腔上皮体细胞样细胞（coelomic epithelial somatic-like cells）;在11.5-12.5天体腔上皮体细胞样细胞分化为SF1阳性前体样细胞（SF1-positive precursor-like cells,SPLCs）,并发育为 SF1 阳性性腺前体样细胞（SF1-positive gonadal precursor-like cells,SGPLCs）;在12.5天之后SF1阳性性腺前体样细胞发育形成胚胎睾丸支持样细胞;在12.5-14.5天,胚胎睾丸支持样细胞形成环状结构;在14.5天之后,细胞组成的环状结构继续发育为管束状结构,与小鼠睾丸生精小管骨架结构相似。这些结果显示,建立的小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化过程与已知的小鼠胚胎内性腺发育和细胞分化途径相似。三、初步鉴别6种发育相关因子对小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化途径的诱导作用。研究通过对6种发育相关因子Wt1、Gata4、Sf1、Sry、Sox9和Dmrt1的表达调控进行组合,利用不同细胞的特异性标志物进行鉴定,初步鉴别出这些因子对小鼠胚胎干细胞诱导分化途径的影响。结果表明Wt1和Gata4拘调控表达与分化形成体腔上皮体细胞样细胞有关;Sf1基因的表达与SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的形成相关;Sry和Sox9基因在诱导作用上表现相似,与SF1阳性性腺前体细胞向雄性分化决定的过程相关;Dmrt1基因的表达影响到胚胎睾丸支持样细胞形成的细胞数量。四、基于小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,研究不同发育分化阶段的分子机理。为了探索小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化机理,研究将分化过程分为三个阶段:（1）体腔上皮体细胞样细胞、SF1阳性前体样细胞和SF1阳性性腺前体样细胞的分化形成阶段;（2）SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞的分化阶段;（3）胚胎睾丸支持样细胞发育维持阶段。分子机制主要采用慢病毒转染方法调控目标因子进行过表达,或采用CRISPR/Cas9敲除（knock out,KO）方法抑制目标因子的表达来进行研究。结果显示:（1）Wt1基因的过表达有利于激活体腔上皮组织发育相关基因,并上调Gata4和Sf1的转录表达。Gata4能激活功能因子Lhx9进行表达。Wt1和Gata4可能对体腔上皮体细胞样细胞和SF1阳性前体样细胞分化形成具有重要作用;（2）Sf1能激活Amh、Amhr2、Insl3、Dax1等因子的表达,并促进体腔上皮体细胞样细胞向SF1阳性前体细胞的分化发育。另外,Sf1基因的表达可能对细胞的上皮样向间质样形态转变（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）、迁移和聚集能力具有影响。Sf1无法单独激活雄性分化决定关键因子Sry和Sox9的表达。然而,Sf1的表达缺失将阻碍雄性分化决定过程;（3）Sry和Sox9是雄性分化决定的关键基因。Sry的过表达能激活Sox9进行表达,然而Sox9的过表达无法单独激活Sry进行表达。Sry或Sox9的过表达能激活一些相似的雄性分化决定相关下游基因,促进SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞进行诱导分化。在Sry和Sox9不表达的情况下,SF1阳性性腺前体样细胞可能发生雌性分化决定过程,向卵巢支持样细胞（ovarian supporting-like cell）（AMH+/WNT4+）进行分化发育;（4）Dmrt1的过表达能激活Amh、Ptgds、Fgt9、Gdnf等雄性发育相关的功能因子,抑制Wnt4、Foxl2等雌性分化决定因子,从而帮助维持雄性发育过程、保持胚胎睾丸支持样细胞的生理特性、促进其形成生精小管的组织结构、并避免发生睾丸支持样细胞向卵巢支持样细胞的转化。五、诱导胚胎睾丸支持样细胞的功能成熟,并检验其生理特性和生精滋养功能。为验证这些诱导胚胎睾丸支持样细胞是否具有与天然胚胎睾丸支持细胞相似的潜在生理功能和特性,实验先采用包含睾酮等物质的条件培养基促进诱导形成的小鼠胚胎睾丸支持样细胞的发育和功能成熟,再通过流式细胞分选后用于小鼠睾丸组织的细胞移植试验和精原干细胞共培养试验。结果显示,在小鼠睾丸生精小管移植实验中,注入的睾丸支持样细胞能够与小鼠自身睾丸细胞相融合、分散生长、并无明显成瘤性,与阳性对照组中异源小鼠睾丸提取的成熟睾丸支持细胞的移植结果相似,表明这些诱导睾丸支持样细胞的生理特性接近于天然形成的成熟睾丸支持细胞;在精原干细胞共培养试验中,诱导睾丸支持样细胞能够滋养精原干细胞发育为雄性配子样细胞,表明诱导出的睾丸支持样细胞具备一定的生殖细胞滋养功能。综上,本论文建立了一种小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型,并基于模型研究了相关的分子机理,为胚胎发育学、性别决定机理和临床应用提供了研究基础和技术平台。
赵谭军,刘丽,常亚青,湛垚垚[9]（2020）在《水产动物精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术研究进展》文中认为生殖细胞及胚胎的低温冷冻保存不仅是水产动物种质资源保存的重要技术手段之一,也是为水产动物优良新品种创制和培育提供基础育种材料的主要途径。精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术是近年来水产研究领域新兴的一种低温冷冻保存技术,与传统冷冻保存的精子或胚胎相比,冷冻保存的精原干细胞及胚胎干细胞具有自我更新及多向分化的潜能,同时还具有可以进行体外分化与移植等优势。本文综述了近年来水产动物精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术研究及其应用成果,以期进一步丰富和完善水产动物精子和胚胎冷冻及保存技术的资料体系,为充分利用低温冷冻保存技术提高水产经济动物优质种质资源保护和新种创制效率提供参考。
丁一夫,李劲松,周琪[10]（2019）在《哺乳动物单倍体胚胎干细胞的建立与应用》文中研究说明哺乳动物胚胎干细胞通常为二倍体,限制了其在后基因组时代功能基因研究上的应用.近年来,随着不同物种单倍体胚胎干细胞的建立,科学家获得了一种可用于高通量正反向遗传筛选的细胞工具.单倍体胚胎干细胞具有类似于二倍体胚胎干细胞的无限增殖能力、基因表达模式、分化潜能等特点,可以在细胞水平开展遗传筛选研究;通过不同物种单倍体干细胞的融合形成异源二倍体细胞可以用于研究基因的演化.另外,小鼠单倍体胚胎干细胞可代替配子用于产生动物,这为研究基因印记在胚胎发育过程中的作用、快速构建携带复杂基因修饰的模式动物、进行个体水平遗传筛选等提供了一个新的遗传学工具.最近,单倍体胚胎干细胞的基因组标签计划的提出,以构建所有编码蛋白质基因的标签小鼠资源平台为目的,将促进蛋白质研究的标准化,并为揭开胚胎发育复杂而有序的蛋白质调控网络提供工具.
二、胚胎干细胞与哺乳动物克隆（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎干细胞与哺乳动物克隆（论文提纲范文）
（1）CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 原始生殖细胞(PGCs) |
| 1.1.1 鸡PGCs的起源和迁移 |
| 1.1.2 鸡PGCs的分离和培养 |
| 1.1.3 PGCs细胞的体外诱导 |
| 1.1.4 PGCs的应用 |
| 1.2 细胞重编程 |
| 1.2.1 细胞重编程的研究进展 |
| 1.2.2 体细胞诱导重编程的分子机制 |
| 1.2.3 体细胞诱导重编程体系的优化 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞的应用 |
| 1.3 本课题前期研究发现 |
| 1.4 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 鸡CEF诱导重编程为iPS |
| 2.1.5 鸡iPS的鉴定 |
| 2.1.6 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.1.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.1.8 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用 |
| 2.1.9 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 鸡CEF诱导重编程为iPS及鉴定 |
| 2.2.2 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.2.3 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.2.4 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用研究 |
| 2.2.5 小分子化合物2i-SP优化鸡iPS诱导体系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第3章 不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 细胞分离纯化 |
| 3.1.5 RNA抽提和质量检测 |
| 3.1.6 cDNA文库构建及测序 |
| 3.1.7 RNA-seq数据分析步骤 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 RNA样品检测结果 |
| 3.2.2 测序数据产出统计 |
| 3.2.3 参考序列比对分析 |
| 3.2.4 RNA-seq整体质量评估 |
| 3.2.5 不同体系诱导的iPS细胞相关性分析 |
| 3.2.6 不同体系诱导的iPS细胞差异表达基因筛选 |
| 3.2.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中差异表达基因功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 鸡iPS/ESCs诱导分化为iPGCs |
| 4.1.5 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化研究 |
| 4.1.6 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组测序 |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鸡iPS诱导分化为iPGCs |
| 4.2.2 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化 |
| 4.2.3 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组学研究 |
| 4.2.4 鸡iPGCs (iPS-derived)与PGCs差异表达基因功能分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 鸡iPGCs介导类克隆体系的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器和设备 |
| 5.1.4 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.1.5 类克隆鸡微卫星检测 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.2.2 微卫星检测类克隆鸡品种关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 全文结论与创新点 |
| 论文有待进一步深入研究的问题 |
| 附录 |
| 原始数据表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）小鼠胚胎干细胞分化形成内耳祖细胞的诱导条件优化的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 内耳的发育与再生 |
| 1.2.1 哺乳动物内耳的发育 |
| 1.2.2 哺乳动物内耳的再生 |
| 1.3 诱导PSC生成内耳细胞的方法 |
| 1.3.1 体外诱导PSC分化为类毛细胞的实验方案 |
| 1.3.2 体外诱导PSC分化为神经元的实验方案 |
| 1.3.3 体外诱导PSC同时分化为类毛细胞和神经元的实验方案 |
| 1.4 干细胞疗法治疗听力损伤 |
| 1.4.1 干细胞疗法需要解决的问题 |
| 1.4.2 未分化的干细胞移植 |
| 1.4.3 部分分化的祖细胞移植 |
| 1.5 展望 |
| 参考文献 |
| 2 MC3T3 条件培养液诱导mESC分化为内耳祖细胞 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验细胞株及实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 各类型细胞的培养 |
| 2.3.2 mESC的鉴定 |
| 2.3.3 拟胚体（EB）的制备 |
| 2.3.4 EB的三胚层标志性基因的检测 |
| 2.3.5 MC3T3 条件培养液的制备 |
| 2.3.6 内耳祖细胞的诱导分化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 mESC的干性鉴定 |
| 2.4.2 EB分化能力的鉴定 |
| 2.4.3 内耳祖细胞标志性基因表达时间的确定 |
| 2.4.4 内耳祖细胞的鉴定 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 3 内耳祖细胞中分离并富集耳上皮祖细胞和耳神经祖细胞 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 不同接种密度分离OEP和 ONP |
| 3.3.2 OEP和 ONP的鉴定 |
| 3.3.3 OEP和 ONP的传代扩增 |
| 3.3.4 不同代数OEP和 ONP标志性基因的检测 |
| 3.3.5 分离后的OEP和 ONP特异性蛋白的检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 不同接种密度分离OEP和 ONP |
| 3.4.2 不同代数OEP和 ONP标志性基因的检测 |
| 3.4.3 OEP和 ONP特异性蛋白的检测 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 4 MC3T3 条件培养液诱导OEP分化为类毛细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 类毛细胞的诱导分化 |
| 4.3.2 类毛细胞的结构和功能鉴定 |
| 4.3.3 不同的饲养层细胞对OEP向毛细胞诱导分化的影响 |
| 4.4 结论 |
| 4.4.1 类毛细胞标志性基因表达时间的确定 |
| 4.4.2 类毛细胞标志性基因的检测 |
| 4.4.3 类毛细胞特异性蛋白的检测 |
| 4.4.4 类毛细胞电生理功能的检测 |
| 4.4.5 扫描电镜检测类毛细胞表面纤毛 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 5 结论与展望 |
| 附录(各类细胞培养液的配置) |
（4）猪早期胚胎和胚胎干细胞体外培养体系优化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用中英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 猪早期胚胎发育的相关研究 |
| 1.3 多能性干细胞的分类 |
| 1.3.1 干细胞的多能性等级分类 |
| 1.3.2 干细胞来源分类 |
| 1.4 胚胎干细胞的生物学特征 |
| 1.4.1 形态学特征 |
| 1.4.2 多能性特征 |
| 1.4.3 遗传可操作性 |
| 1.5 猪胚胎干细胞建系影响因素进展研究 |
| 1.5.1 胚胎种类 |
| 1.5.2 胚胎接种方法 |
| 1.5.3 饲养层细胞 |
| 1.5.4 培养体系 |
| 1.5.5 传代方法 |
| 1.6 胚胎干细胞多能性通路研究 |
| 1.6.1 JAK-STAT信号通路 |
| 1.6.2 PI3K-AKT信号通路 |
| 1.6.3 WNT信号通路 |
| 1.6.4 MAPK信号通路 |
| 1.6.5 TGF-β信号通路 |
| 1.6.6 Na?ve和 Primed细胞多能性调控差异 |
| 1.7 .胚胎干细胞鉴定方法 |
| 1.7.1 形态学鉴定 |
| 1.7.2 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)染色 |
| 1.7.3 核型分析 |
| 1.7.4 实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,q RT-PCR) |
| 1.7.5 免疫荧光(Immunofluorescence staining,IF)染色 |
| 1.7.6 免疫印迹(Western blotting,WB) |
| 1.7.7 体外分化能力 |
| 1.7.8 畸胎瘤形成 |
| 1.7.9 嵌合体实验 |
| 1.8 胚胎干细胞应用前景及存在的问题 |
| 1.8.1 胚胎干细胞的应用前景 |
| 1.8.2 胚胎干细胞存在的问题 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验材料和动物 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 猪卵母细胞体外成熟培养 |
| 2.2.2 猪孤雌胚胎获取 |
| 2.2.3 猪体外受精胚胎获取 |
| 2.2.4 猪体内胚胎获取 |
| 2.2.5 饲养层细胞制备 |
| 2.2.5.1 小鼠胎儿成纤维细胞原代分离 |
| 2.2.5.2 小鼠胎儿成纤维细胞传代培养及冻存 |
| 2.2.6 猪胚胎干细胞系构建及培养 |
| 2.2.6.1 猪胚胎干细胞系的构建 |
| 2.2.6.2 猪胚胎干细胞的传代培养 |
| 2.2.6.3 猪胚胎干细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.7 多能性鉴定 |
| 2.2.7.1 碱性磷酸酶染色 |
| 2.2.7.2 核型分析 |
| 2.2.7.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.7.4 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.7.5 RNA提取 |
| 2.2.7.6 反转录 |
| 2.6.7.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 拟胚体形成 |
| 2.2.9 脂质体转染 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 试验设计 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同发育时期的猪体内胚胎的转录组分析 |
| 3.2 hLIF、rpIL6、CHIR99021、bFGF、BMP4、PD0325901 以及SB431542 等对猪孤雌胚胎囊胚发育的影响 |
| 3.3 不同浓度的CHIR99021及WNT通路的抑制剂IWR1 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.4 不同浓度的rpIL6及JAK-STAT通路的抑制剂AZD1480 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.5 组合添加CHIR99021和rpIL6 对猪孤雌胚胎发育的影响 |
| 3.6 组合添加CHIR99021和rpIL6 对猪IVF胚胎发育的影响 |
| 3.7 LCDM体系干细胞系构建及多能性鉴定 |
| 3.7.1 LCDM相关体系转化 |
| 3.7.2 LCDM相关体系孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.8 pEPSC体系胚胎干细胞建系多能性鉴定 |
| 3.8.1 pEPSC体系优化 |
| 3.8.2 pEPSC体系的猪孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.8.3 pEPSC体系的猪体内胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.9 KOFL体系中添加SB431542、CHIR99021和Forskolin可获得多能性提高的干细胞系 |
| 3.10 LSCFors体系胚胎干细胞构建及多能性鉴定 |
| 3.10.1 LSCFors体系转化 |
| 3.10.2 LSCFors体系孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.11 F-LSCFors体系胚胎干细胞构建及多能性鉴定 |
| 3.11.1 F-LSCFors体系细胞转化 |
| 3.11.2 F-LSCFors体系的孤雌胚胎来源的胚胎干细胞建系及多能性鉴定 |
| 3.12 LSCFors和 F-LSCFors体系细胞基因表达差异分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪早期胚胎体外培养液的优化 |
| 4.2 猪胚胎干细胞体外培养液的优化 |
| 5 小结 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新之处 |
| 5.3 本研究的不足 |
| 5.4 本研究的下一步工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 非人灵长类胚胎早期发育 |
| 1.2.1 配子形成 |
| 1.2.2 受精 |
| 1.2.3 卵裂 |
| 1.2.4 囊胚形成 |
| 1.2.5 植入 |
| 1.2.6 早期胚胎发育的分子调控 |
| 1.2.7 早期胚胎发育与环境应激 |
| 1.3 非人灵长类胚胎早期发育调控研究 |
| 1.3.1 单细胞组学技术揭示胚胎早期发育的分子调控 |
| 1.3.2 利用体细胞核移植研究胚胎重编程过程 |
| 1.4 非人灵长类疾病模型研究 |
| 1.4.1 非人灵长类基因组编辑研究现状 |
| 1.4.2 基因编辑技术的安全性问题 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基于单细胞转录组测序的猕猴胚胎植入前发育研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料与方法 |
| 2.3.1 动物来源 |
| 2.3.2 实验主要试剂 |
| 2.3.3 实验主要仪器 |
| 2.3.4 卵母细胞采集 |
| 2.3.5 建立体外受精/体细胞核移植/孤雌激活/孤雄发育胚胎 |
| 2.3.6 胚胎培养 |
| 2.3.7 单细胞样本收集 |
| 2.3.8 单细胞转录组数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 单精子注射、体细胞核移植、单性生殖胚胎的植入前转录图谱 |
| 2.4.2 猕猴胚胎植入前发育的转录阻滞 |
| 2.4.3 猕猴植入前胚胎转录组的母源—合子转化 |
| 2.4.4 表观遗传调控相关基因的异常表达与胚胎阻滞相关 |
| 2.4.5 通过降低核移植胚胎中异常的H3K9me3修饰提高胚胎发育率 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 第三章 建立DAX1基因靶向编辑的食蟹猴模型 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料与方法 |
| 3.3.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.3.2 动物来源、卵采集、体外受精 |
| 3.3.3 建立DAX1基因靶向编辑食蟹猴 |
| 3.3.4 编辑效率检测:T7酶切及测序 |
| 3.3.5 脱靶检测 |
| 3.3.6 H&E染色 |
| 3.3.7 免疫组化和免疫荧光检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 建立DAX1基因靶向修饰的食蟹猴模型 |
| 3.4.2 Cas9介导的模型猴生殖系细胞DAX1基因靶向突变 |
| 3.4.3 DAX1基因突变引起模型猴猴睾丸发育异常 |
| 3.4.4 DAX1基因突变不会导致支持细胞发育异常 |
| 3.4.5 DAX1基因突变导致Wnt/β-catenin信号通路异常上调 |
| 3.4.6 DAX1基因突变引起模型猴肾上腺发育异常 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 第四章 食蟹猴胚胎的干细胞嵌合研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料与方法 |
| 4.3.1 食蟹猴多能干细胞系的建立 |
| 4.3.2 多能干细胞的荧光标记 |
| 4.3.3 干细胞体外分化实验 |
| 4.3.4 构建嵌合体胚胎 |
| 4.3.5 胚胎培养/延迟培养及胚胎移植 |
| 4.3.6 免疫组化染色 |
| 4.3.7 胚胎移植、孕检、胎儿及新生猴组织样本采集 |
| 4.3.8 胎猴/新生猴组织处理 |
| 4.3.9 特异性基因PCR检测 |
| 4.3.10 单细胞RNA-seq |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 建立多能干细胞嵌合猴胚胎 |
| 4.4.2 建立多能干细胞嵌合食蟹猴 |
| 4.4.3 通过基因表达谱分析揭示多能干细胞的嵌合机制 |
| 4.4.4 食蟹猴pESCs在成体猴生殖系的嵌合 |
| 4.4.5 胚胎微环境影响多能干细胞嵌合效率 |
| 4.5 讨论及小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间发表论文目录 |
| 附录 B 实验动物伦理审批表 |
| 附录 C 其他需要说明的内容 |
（6）基于TALEN与CRISPR/Cas9基因编辑技术的Tiki基因敲除猪和兔的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一篇 :综述 |
| 第一章 :基因编辑猪在大动物分子遗传育种以及生物医学上的应用 |
| 1.1 培育抗病力和适应性强的动物品种 |
| 1.2 培育提高生产性能的动物品种 |
| 1.3 培育改善动物肉类品质的动物品种 |
| 1.4 培育“环保型”动物品种 |
| 1.5 作为人类疾病动物模型 |
| 1.6 作为异种器官移植供体 |
| 第二章 :基因编辑克隆猪培育主要技术环节及其影响因素 |
| 2.1 卵母细胞 |
| 2.2 供体细胞 |
| 2.3 核移植重构胚胎的构建 |
| 第三章 :大动物遗传修饰相关的精准基因编辑技术研究进展 |
| 3.1 传统的同源重组技术 |
| 3.2 ZFN基因编辑技术研究进展 |
| 3.3 转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALEN)研究进展 |
| 3.4 CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究进展 |
| 第二篇 :研究内容 |
| 第一章 :利用TALEN基因编辑系统对猪和兔进行Tiki1 基因敲除的研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 :利用CRISPR/Cas9 基因编辑系统对猪和兔进行Tiki基因敲除的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 全文结论及创新之处 |
| 未来研究展望 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）ACTIVIN A、bFGF、BMP4、LIF等因子介导的哺乳动物胚胎干细胞转换（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 人和小鼠多能干细胞概述 |
| 1.2.1 小鼠多能干细胞 |
| 1.2.2 人多能干细胞 |
| 1.2.3 多能干细胞向其它细胞转换 |
| 1.2.4 多能干细胞转换过程中的关键信号因子 |
| 参考文献 |
| 第二章 利用ACTIVIN A和 bFGF建立不同遗传背景小鼠AFSCs |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同遗传背景小鼠囊胚收集及培养 |
| 2.3.2 不同遗传背景AFSCs细胞系建立 |
| 2.3.3 不同遗传背景AFSCs细胞特性分析 |
| 2.3.4 血清替代物在AFSCs细胞系建立过程中的作用 |
| 2.4 结论及讨论 |
| 第三章 生长因子ACTIVIN A、BMP4、LIF和 b FGF对小鼠AFSCs向其它多能细胞转换的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 生长因子bFGF、BMP4和LIF介导的AFSCs细胞状态转换 |
| 3.3.2 BMP4和Activin A介导的AFSCs细胞状态转换 |
| 3.4 结论及讨论 |
| 第四章 细胞因子LIF和小分子抑制剂CHIR99021 在人胚胎干细胞转换中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Na?ve状态hESCs向 primed状态转换 |
| 4.3.2 细胞因子LIF和小分子CHIR99021 诱导的primed hPSCs状态转变 |
| 4.3.3 原始神经细胞样干细胞(PNLSCs)发育及分化潜力检测 |
| 4.4 结论及讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 期刊论文 |
| 会议论文 |
（8）小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 胚胎干细胞的研究现状 |
| 1.1.1 胚胎干细胞的来源与种类 |
| 1.1.2 胚胎干细胞的体外培养 |
| 1.1.3 胚胎干细胞的分化诱导 |
| 1.1.4 胚胎干细胞的临床应用 |
| 1.2 睾丸支持细胞的研究现状 |
| 1.2.1 睾丸支持细胞的特性 |
| 1.2.2 睾丸支持细胞的滋养功能 |
| 1.2.3 睾丸支持细胞的免疫豁免功能 |
| 1.2.4 睾丸支持细胞骨架结构有助于形成血睾屏障 |
| 1.2.5 胚胎睾丸支持细胞诱导雄性分化决定 |
| 1.3 胚胎干细胞向胚胎睾丸支持细胞的分化途径研究 |
| 1.3.1 胚胎睾丸支持细胞的分化来源 |
| 1.3.2 小鼠胚胎睾丸支持细胞的发育形成过程 |
| 1.3.3 小鼠胚胎睾丸支持细胞形成的分子机理 |
| 1.3.3.1 体腔上皮和中性性腺的形成相关因子 |
| 1.3.3.2 雄性分化决定相关因子 |
| 1.3.3.3 胚胎睾丸支持细胞的生长发育相关因子 |
| 1.3.4 现有的胚胎睾丸支持细胞体外诱导方法 |
| 1.3.4.1 控制胚胎干细胞的细胞群落细胞量方法 |
| 1.3.4.2 通过加入重组蛋白,诱导中胚层来源细胞向睾丸支持样细胞分化 |
| 1.3.4.3 通过重编程成纤维细胞诱导转分化出睾丸支持样细胞 |
| 1.4 本文主要研究内容、目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 工具耗材 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.2.1 常用试剂 |
| 2.2.2.2 配制试剂和培养基 |
| 2.2.2.3 细胞材料 |
| 2.2.2.4 核酸分子实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞提取方法 |
| 2.3.1.1 小鼠胚胎干细胞的提取 |
| 2.3.1.2 小鼠胚胎成纤维细胞的提取 |
| 2.3.1.3 精原干细胞和成熟睾丸支持细胞的提取 |
| 2.3.2 核酸扩增技术 |
| 2.3.2.1 聚合酶链反应技术(PCR) |
| 2.3.2.2 感受态细胞转化 |
| 2.3.2.3 核酸琼脂凝胶电泳 |
| 2.3.3 基因转导方法 |
| 2.3.3.1 慢病毒转染 |
| 2.3.3.2 脂质体转染 |
| 2.3.3.3 聚醚酰亚胺阳离子聚合物转染 |
| 2.3.4 细胞鉴定方法 |
| 2.3.4.1 定量聚合酶链反应技术(qPCR) |
| 2.3.4.2 蛋白质印迹分析(WB) |
| 2.3.4.3 免疫荧光电镜检测方法(IF) |
| 2.3.4.4 免疫细胞化学检测法(ICC) |
| 2.3.4.5 流式细胞分析技术(FCM) |
| 2.3.4.6 PKH26活细胞荧光染色 |
| 2.3.4.7 组织石蜡切片制箭 |
| 第3章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 小鼠胚胎干细胞的诱导分化方法 |
| 3.2.1.1 目的基因扩增方法 |
| 3.2.1.2 pcDNA3.1(+)载体常表达质粒的构建 |
| 3.2.1.3 FUW-TetO载体四环素控制表达质粒的构建 |
| 3.2.1.4 FUW-lightO载体光控制质粒的构建 |
| 3.2.2 小鼠胚胎干细胞的体外培养方法 |
| 3.2.2.1 TM4细胞和小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备 |
| 3.2.2.2 TM4细胞条件培养基的制备 |
| 3.2.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞定向分化实验设计方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化方法分析 |
| 3.3.1.1 慢病毒转染、脂质体转染和阳离子聚合物对目的基因的转染效率比较 |
| 3.3.1.2 目的基因重组蛋白在不同细胞系中的表达 |
| 3.3.1.3 基因转导调控诱导和蛋白因子诱导胚胎干细胞定向分化效果比较 |
| 3.3.2 TM4细胞对小鼠胚胎干细胞体外培养结果 |
| 3.3.2.1 TM4细胞作为滋养层对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响 |
| 3.3.2.2 TM4细胞条件培养基对小鼠胚胎干细胞聚集、增殖和多能性影响 |
| 3.3.3 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞体外诱导分化过程鉴定 |
| 3.3.3.1 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程的形态学分析 |
| 3.3.3.2 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程特异性生物标志物分析 |
| 3.3.3.3 小鼠胚胎干细胞诱导分化过程中细胞标志性基因的转录表达鉴定 |
| 3.3.3.4 上皮细胞和间质细胞标志性基因表达鉴定分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化模型的分子机理 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 关键因子的诱导功能鉴定方法 |
| 4.2.2 关键因子的分子调控机理研究方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 关键因子在胚胎干细胞诱导分化过程中的功能分析 |
| 4.3.1.1 关键因子对胚胎干细胞诱导分化过程的影响 |
| 4.3.1.2 Sry和Sox9功能比较分析 |
| 4.3.1.3 剔除Sry表达调控后的关键因子诱导功能分析 |
| 4.3.2 诱导分化阶段及其关键因子的功能分析 |
| 4.3.2.1 体腔上皮发育和SF1阳性前体样细胞形成阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.2 SF1阳性性腺前体样细胞向胚胎睾丸支持样细胞分化阶段的因子功能鉴定 |
| 4.3.2.3 胚胎睾丸支持样细胞生长发育相关因子功能鉴定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 诱导形成的小鼠睾丸支持样细胞的功能鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 诱导睾丸支持样细胞与精原干细胞共培养实验 |
| 5.2.1.1 睾丸支持样细胞滋养层的制备方法 |
| 5.2.1.2 睾丸支持样细胞与精原干细胞的共培养方法 |
| 5.2.2 诱导睾丸支持样细胞的小鼠睾丸移植实验 |
| 5.2.2.1 诱导睾丸支持样细胞和天然睾丸支持细胞的活细胞染色方法 |
| 5.2.2.2 诱导睾丸支持样细胞注射小鼠睾丸组织的移植方法 |
| 5.2.2.3 移植细胞的鉴定方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 诱导睾丸支持样细胞对精原干细胞体外发育为雄性配子样细胞的结果分析 |
| 5.3.2 诱导睾丸支持样细胞移植在小鼠睾丸组织中的生长情况 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 讨论、结论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.1.1 小鼠胚胎干细胞体外向胚胎睾丸支持样细胞的诱导分化模型 |
| 6.1.2 小鼠胚胎干细胞向胚胎睾丸支持样细胞诱导分化模型的分子机理探讨 |
| 6.2 结论 |
| 6.3 创新点 |
| 6.4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 附录 3 |
| 附件 |
（9）水产动物精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 精原干细胞和胚胎干细胞基本特征 |
| 1.1 水产动物精原干细胞 |
| 1.2 水产动物胚胎干细胞 |
| 2 干细胞分离方法及冷冻保存技术 |
| 2.1 水产动物精原干细胞分离及冷冻保存技术 |
| (1)精原干细胞的分离。 |
| (2)冷冻保存基础液和抗冻剂。 |
| (3)精原干细胞的冷冻保存过程与方式。 |
| (4)复苏。 |
| (5)生产应用。 |
| 2.2 水产动物胚胎干细胞分离及冷冻保存技术 |
| (1)胚胎干细胞的分离。 |
| (2)冷冻保存基础液和抗冻剂。 |
| (3)胚胎干细胞的冷冻保存过程和方式。 |
| (4)复苏。 |
| (5)生产应用。 |
| 3 存在问题及展望 |
| 3.1 存在问题 |
| 3.2 展望 |
（10）哺乳动物单倍体胚胎干细胞的建立与应用（论文提纲范文）
| 1 不同物种单倍体胚胎干细胞的建立 |
| 1.1 小鼠单倍体胚胎干细胞的建立 |
| 1.2 大鼠单倍体胚胎干细胞的建立 |
| 1.3 非人灵长类单倍体胚胎干细胞的建立 |
| 1.4 人单倍体胚胎干细胞的建立 |
| 2 单倍体胚胎干细胞的特性 |
| 2.1 单倍体胚胎干细胞的自发二倍体化 |
| 2.2 单倍体胚胎干细胞均携带X染色体 |
| 2.3 单倍体胚胎干细胞的多能性和自我更新能力 |
| 2.4 单倍体细胞作为配子替代物的能力 |
| 3 单倍体胚胎干细胞的应用 |
| 3.1 单倍体胚胎干细胞在细胞水平的应用 |
| 3.2 单倍体干细胞作为配子替代物用于制备小鼠 |
| 4 单倍体胚胎干细胞研究的展望 |
四、胚胎干细胞与哺乳动物克隆（论文参考文献）
- [1]CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究[D]. 袁霞. 扬州大学, 2021
- [2]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [3]小鼠胚胎干细胞分化形成内耳祖细胞的诱导条件优化的研究[D]. 蔡晨依. 浙江大学, 2021(01)
- [4]猪早期胚胎和胚胎干细胞体外培养体系优化的研究[D]. 尹姝媛. 华中农业大学, 2020(04)
- [5]非人灵长类早期胚胎发育与疾病模型研究[D]. 康宇. 昆明理工大学, 2020(04)
- [6]基于TALEN与CRISPR/Cas9基因编辑技术的Tiki基因敲除猪和兔的建立[D]. 吴彩霞. 吉林大学, 2020(08)
- [7]ACTIVIN A、bFGF、BMP4、LIF等因子介导的哺乳动物胚胎干细胞转换[D]. 陈杨林. 内蒙古大学, 2020(01)
- [8]小鼠胚胎干细胞诱导分化为胚胎睾丸支持样细胞方法和分子机理研究[D]. 徐辰泽. 华东理工大学, 2020(01)
- [9]水产动物精原干细胞和胚胎干细胞冷冻保存技术研究进展[J]. 赵谭军,刘丽,常亚青,湛垚垚. 大连海洋大学学报, 2020(05)
- [10]哺乳动物单倍体胚胎干细胞的建立与应用[J]. 丁一夫,李劲松,周琪. 中国科学:生命科学, 2019(12)