一、丙型肝炎病毒核蛋白与转录调节因子NFAT1C和YY1的结合位点分析（论文文献综述）
陈秦俊杰[1]（2021）在《环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究》文中认为研究背景和目的肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是发病率仅次于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的一种高度恶性的肝脏恶性肿瘤,其特点是发病隐匿,侵袭性高,患者就诊时往往已处于疾病的中晚期阶段,此时绝大多数患者已经失去手术治疗的机会,故ICC患者整体预后极差。近几十年来,ICC的发病率在全球范围内逐渐升高,其常见的主要危险因素包括:肝内胆管结石、原发性硬化性胆管炎、肝血吸虫病、肝硬化、胆管囊肿、Caroli病、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、肥胖和吸烟等。ICC目前仍缺乏有效的治疗手段,手术切除是最有效的治疗方法,但由于ICC患者接受手术治疗的比例较低加之术后高复发率,导致ICC患者5年总体生存率低于10%。环状RNA（CircRNAs）是生物体内一类含量丰富、多样且保守的新型非编码RNA分子,它们是由前体m RNA通过直接的反向拼接或由外显子跳跃环化产生。目前绝大多数circRNAs被认为可以充当分子海绵,即通过吸附细胞内的mi RNAs来实现对下游基因的调控。另外,还有少部分circRNAs可以与RNA结合蛋白（RNA-binding protein,RBP）相互作用,从而改变下游基因的转录水平。甚至有极少一部分circRNAs可以作为蛋白质翻译的模板产生小分子多肽和蛋白。越来越多的研究表明circRNA分子在人类疾病中起着重要的调控作用,人们已经发现异常表达的circRNA分子与多种癌症的进展和预后都有着密切的关系。然而,目前鲜有研究详细地报道circRNA分子在ICC疾病的发生、发展过程中的作用和机制。鉴于此,本研究基于基因芯片测序技术寻找在ICC中发生显着性上调的circRNA分子,并通过一系列分子生物学实验技术探索circRNA分子在ICC发生、发展中的作用。方法1.病人的临床资料和组织样本本研究回归性收集了从2016年3月至2017年8月在上海东方肝胆外科医院接受肝脏切除手术的67例ICC患者的临床病理资料,同时也获取这67例患者术中的新鲜冰冻癌组织及其对应的邻近正常肝脏组织。2.寻找ICC中显着性高表达的环状RNA分子随机选取上述标本中的7对组织按照Arraystar公司的Human circRNA Array（v2版本）指南对癌与癌旁组织之间的circRNAs进行差异表达分析,并最终筛选出在ICC肿瘤中显着性高表达的目标分子,即circACTN4。3.探索circACTN4的表达水平与ICC患者预后的关系通过受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）确定剩余60个ICC患者中circACTN4表达量的最佳临界值,并把这些患者分为circACTN4高和低表达两组。生存曲线分析采用Kaplan-Meier（KM）法和对数秩（log-rank）检验。Cox风险比例回归模型用于探索影响患者预后的危险因素。4.功能实验验证circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验以及内皮小管形成实验来测定circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响。通过向雄性BALB/c裸鼠（4-6周龄）皮下注射FRH0201细胞建立皮下成瘤模型,还通过向6周大的雄性BALB/c裸鼠的鼠尾静脉注射FRH0201细胞建立小鼠的肝内胆管癌肺转移模型,借此判断circACTN4在体内对胆管癌细胞增殖和转移能力的影响。5.CircACTN4过表达后进行测序寻找ICC中发生显着性变化的基因通过过表达质粒实现RBE细胞中circACTN4的高表达,然后通过过表达基因测序获得癌细胞中发生显着性差异表达的基因谱,随后通过GO和KEGG分析进一步缩小范围,寻找目标基因。最后通过q RT-PCR,Western blot实验以及Ch IRP（Chromatin isolation by RNA purification）实验等进一步探索上述显着性变化的目标基因与circACTN4的关系。6.CircACTN4与RBP互作在circACTN4的下拉实验（Pull down）中,我们将肝内胆管癌细胞裂解物与提前合成的生物素标记探针共同孵育,然后通过与链霉亲和素磁珠结合沉淀上述细胞裂解物中的相应蛋白。随后,我们对沉淀下来的蛋白质分别进行液相色谱-质谱（Liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS）/（Mass spectrometer,MS）质谱分析,以及后续的免疫共沉淀实验、RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验、RNA的凝胶迁移或电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）等并最终筛选出目标RBP分子。7.寻找CircACTN4与RBP共同作用的下游基因通过Ch IP-seq技术寻找目标RBP结合的下游靶基因谱,然后将上述circACTN4过表达测序结果与Ch IP-seq测序的结果取交集获得CircACTN4与RBP共同作用的下游基因。8.CircACTN4充当mi RNA的分子海绵为了寻找能与circACTN4结合的mi RNA分子,我们通过使用Circular RNA interactome数据库（https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）,Starbase数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）和Circbase数据库（http://circbase.org/）进行预测。随后经过RT-PCR,Western blot,RIP和荧光素酶报告基因实验,我们最终确定与circACTN4结合的mi RNA分子。结果1.根据circRNA基因芯片测序的结果,我们共获得202个在ICC癌组织中显着性上调（Fold change≥2.0,P value≤0.05）的circRNA分子。我们选取log2（Fold change）值最大的前7个circRNA分子,接着通过细胞的功能验证以及数据库的比对,最终确定hsa＿circ＿0050898作为我们的目标RNA分子,因为hsa＿circ＿0050898来源于其母基因ACTN4,因此我们命名它为circACTN4。2.ICC患者中,circACTN4的高表达是影响ICC患者预后的独立危险因素,KM曲线分析结果显示ICC患者中高表达的circACTN4与更差的总体生存（Overall survival,OS）和更高的术后肿瘤复发率均显着性相关。3.体外功能实验,如平板克隆实验、Transwell实验和小管形成实验的结果表明ICC细胞中circACTN4的高表达能够显着性增强肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭的能力。体内动物实验模型结果也发现敲降circACTN4的表达能够显着性地缩小皮下肿瘤的体积及小鼠肺组织转移癌灶的数目。4.CircACTN4的三次过表达测序结果发现在RBE细胞中共计103个基因出现显着性差异表达,这些基因的GO分析发现在分子功能中参与“转录因子活性、结合（Transcription factor activity,protein binding）”的基因数目和比例较高;另外,KEGG分析发现Hippo通路和Wnt通路相关的部分基因在circACTN4过表达后都出现明显的变化。我们对其中的FZD7基因十分感兴趣,并通过PCR和Western blot实验证实FZD7确实在circACTN4过表达后发生显着性上调。随后的Ch IRP实验证明circACTN4能够富集在FZD7上游启动子区域,说明circACTN4与FZD7的起始转录密切相关。5.下拉实验结果发现19种蛋白能够与circACTN4发生特异性结合,随后的蛋白质互作分析（Protein-protein interaction,PPI）发现YBX1因其高度中心性并且与其他基因直接互作而成为我们关注的焦点。随后的一系列细胞功能及组织样本验证最终确认circACTN4能够与YBX1蛋白互作。6.通过Ch IP-seq实验,我们发现YBX1可结合在上游启动子区域的靶基因数目为631个。随后,我们将Ch IP-seq实验结果和上述过表达测序的103个基因取交集最终只得到FZD7和LRP1。接着,通过Ch IP-q PCR实验再次确认在ICC细胞中,YBX1的下游靶基因是FZD7,因为YBX1可以在FZD7上游启动子区域被富集,且这一区域与circACTN4的结果一致。最终,通过一系列的实验我们证实circACTN4通过招募YBX1共同作用于下游的FZD7基因并促进其转录。7.CircACTN4过表达测序结果已经提示Hippo通路中YAP1基因在ICC中发生显着性上调。因此,我们想探索circACTN4作为分子海绵调控相关mi RNA分子及其相应的下游YAP1基因的可能性。于是我们进一步通过Starbase和Circbase数据库预测得到12个既能与circACTN4又能与YAP1相互作用的候选mi RNA分子。经过TCGA数据库和功能验证实验的筛选,我们最终发现只有mi R-424-5p可以同时和circACTN4以及YAP1发生结合。荧光素酶报告基因和RIP实验结果也证实circACTN4在ICC中可以通过吸附mi R-424-5p上调YAP1基因的表达。结论CircACTN4在ICC中显着性高表达并且与患者术后长期预后差密切相关。体内、外功能实验结果表明circACTN4能够促进癌细胞的增殖、转移和侵袭。机制研究发现circACTN4通过招募YBX1共同启动FZD7的转录,进而促进ICC的进展和恶化,另外,circACTN4还可以充当mi R-424-5p的分子海绵上调YAP1的表达,进而促进肿瘤的发展。我们的结果提示circACTN4可以作为ICC的一个潜在的预后指标和治疗靶点。
李素芬[2]（2021）在《肝细胞性肝癌（HCC）中线粒体转录延伸因子（TEFM）的表达及临床意义》文中进行了进一步梳理背景与目的:肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的原发性肝癌,是全球第六大常见的癌症,也是癌症相关死亡的第二大主要原因。肝癌可以通过手术切除、肝移植、肝定向疗法和全身疗法进行治疗,但肝癌的3年生存率仅为12.7%,中位生存期为9个月。因此,深入研究HCC的发病机制,明确参与HCC发生发展过程的癌基因或抑癌基因,对HCC的诊断和治疗具有重要意义。线粒体转录延伸因子（mitochondrial transcription elongation factor,TEFM）基因又被命名为C17orf42,定位于人的17q11.2,含有4个外显子,m RNA全长为1357 bp,编码一个由360个氨基酸残基组成的蛋白质。Agaronyan K等在Science上首次报道,TEFM是调控线粒体基因组转录与复制相互转换的关键分子开关。研究证实,TEFM具有调控mt DNA转录延伸和抗转录终止的功能,并且参与线粒体RNA的转录后加工,与线粒体能量产生及线粒体疾病的发生密切相关。随着对TEFM的深入研究发现,TEFM基因缺失或表达异常可能导致胰腺癌、I型神经纤维瘤和脑胶质瘤等恶性肿瘤的发生,但TEFM蛋白在HCC组织中的表达及与HCC临床病理学特征的相关性目前尚未见研究报道。本课题将为阐明TEFM在HCC发生和发展中所发挥的作用奠定理论基础,也为HCC早期临床诊断及潜在的分子治疗靶标提供了线索。方法:利用TCGA、Oncomine、UALCAN、GEPIA和c Bioprotal数据库对TEFM m RNA表达水平与HCC患者的病理特征及预后相关性进行分析。通过TIMER平台分析TEFM在HCC中的表达与肿瘤免疫浸润性细胞的关系。收集了70例临床病例的组织芯片,利用免疫组织化学技术检测TEFM蛋白在HCC组织和癌旁组织的表达水平。通过Western blot检测TEFM蛋白在C57小鼠中的组织表达谱,检测人正常肝细胞（THLE-2）和6种HCC细胞中TEFM蛋白的表达差异,以及TEFM蛋白在Hep G2细胞不同血清浓度、不同血清饥饿时间与血清恢复时期的表达。结果:1.公共肿瘤数据库分析发现,TEFM在HCC中呈现高表达,HCC患者TEFM m RNA表达量与性别、AFP及血管侵袭显着相关（P<0.05）。在HCC患者的总体生存率（overall survival,OS）中,TEFM高表达组生存时间相比于TEFM低表达组生存时间显着缩短（P<0.05）。患者年龄、血管侵袭、TEFM表达是影响HCC患者预后的独立因素（P<0.05）。此外,在线粒体转录调控基因中,TFAM、TFB1M、MTERF1、MTERF2、MTERF4和NRF1基因表达水平与TEFM基因表达水平呈正相关（P<0.05）。在HCC标记物基因中,TP53、RASSF1、CDKN2A、EZH2和MKI67基因表达水平与TEFM基因表达水平呈正相关（P<0.05）。TEFM的表达与HCC中的CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞成正相关（P<0.05）。2.组织芯片技术分析发现,TEFM蛋白在HCC组织中表达显着高于其对应的癌旁组织。对组织芯片中TEFM相对表达水平与HCC患者相关病理参数相关性分析。结果发现,TEFM蛋白相对表达量与HCC患者的AFP含量具有显着相关性（P<0.001）。利用Kaplan-Meier预后模型对HCC患者病理参数和TEFM相对表达水平与HCC患者的预后进行分析。结果发现,TEFM相对表达水平与HCC患者OS和DFS均无显着相关性。3.Western blot检测结果发现,TEFM蛋白在C57小鼠脑、心、肝、卵巢和骨骼肌的表达水平相对较高。与体外培养的人类正常肝细胞（THLE-2）相比,TEFM蛋白的表达量在6种人类HCC细胞系（SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、Hep G2、QGY-7701和SK-Hep1）中均显着上调（P<0.05）。TEFM蛋白的表达量在BEL-7402细胞中最低,在Hep3B细胞中最高。随着血清浓度的逐渐降低,TEFM蛋白表达含量逐渐减少。随着血清饥饿时间的延长,TEFM蛋白表达含量也逐渐减少。此外,血清恢复时间0 h至12 h,TEFM蛋白表达量逐渐增加,血清再刺激24 h后,TEFM蛋白表达量开始减少。结论:1.肿瘤数据库分析显示,TEFM表达在HCC中增高,并且TEFM的高转录水平与患者的性别、血清AFP水平和血管浸润密切相关。基因表达相关分析表明HCC中TEFM的m RNA表达水平与线粒体转录调控基因（TFAM、TFB1M、MTERF1、MTERF2、MTERF4和NRF1）和HCC标志物基因（TP53、RASSF1、CDKN2A、EZH2和MKI67）的表达水平显着相关。此外,TEFM与HCC中肿瘤免疫浸润性细胞（CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）有明显相关性。2.实验结果表明,在HCC组织和正常肝组织中,TEFM蛋白主要定位于细胞质,TEFM蛋白相对表达量与HCC患者的AFP含量具有显着相关性。TEFM的功能验证实验表明,TEFM蛋白在C57小鼠体内的表达具有组织特异性,在脑、心、肝、骨骼肌、卵巢等线粒体含量丰富且代谢旺盛的组织中高表达,在脾、肾和肠组织中表达相对较低。此外,相较于正常肝细胞,TEFM蛋白在HCC细胞中表达增高,血清饥饿处理后TEFM蛋白质含量降低。
韩聪[3]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中认为猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
何延华[4]（2020）在《非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索》文中认为牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD-MD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染引起的一种重要的牛传染性疾病,其隐秘性、长时间一过性感染以及持续感染动物形成的病毒存储库使得BVD-MD在全球牛群中肆虐,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。NCP（noncytopathic）BVDV感染能够引起牛免疫力下降,继发其它病原微生物感染,其主要原因是NCP BVDV感染不能很好地诱导细胞产生固有免疫应答。Ⅰ型干扰素（type I interferon,IFN-Ⅰ）通路是固有免疫的主要组成部分,在机体控制并清除病原体的过程中扮演关键角色。目前,BVDV免疫抑制及持续感染的分子机制仍然不清楚,为了进一步明确NCP BVDV的致病机理,了解病毒与宿主之间的相互作用关系,本论文对NCP BVDV抑制IFN-Ⅰ产生的分子机制进行探索性研究。目的:（1）通过转录组测序技术获得NCP BVDV感染宿主细胞的m RNA文库,以生物信息学为平台分析NCP BVDV诱导的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）富集的通路和参与的细胞过程,为理解病毒与宿主之间的相互作用奠定基础（2）构建牛IFN-β（Bo IFN-β）启动子荧光素酶报告系统分析了NCP BVDV及其非结构蛋白对干扰素表达的影响,鉴定NCP BVDV抑制宿主干扰素生成的靶标。同时,为今后研究病毒抑制Bo IFN-β的作用机理提供便利工具。（3）对NCP BVDV诱导宿主细胞上调表达的牛SIKE1（Bo SIKE1）基因进行功能研究,确定Bo SIKE1与BVDV增殖的关系,为阐明SIKE1在固有免疫应答中作用机制提供依据。方法:（1）首先,利用牛外周血单核细胞分离液分离了牛外周血单核细胞,经流式细胞仪检测单核细胞表面抗原CD14的表达水平,然后用NCP BVDV感染牛单核细胞,在感染不同时期收集样本。在Illumina Hiseq 2500测序平台测序,测序结果利用生物信息学方法分析DEGs,随后对DEGs进行GO和KEGG聚类分析,筛选IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs进行荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）验证。（2）其次,利用分子生物学技术克隆牛的IFN-β启动子功能元件序列,构建荧光素酶报告系统,利用荧光素酶报告基因分析方法检测NCP BVDV及其非结构蛋白对poly（I:C）诱导的IFN-β、NF-κB和IRSE的荧光素酶活性,采用蛋白免疫印迹法检测IFN-Ⅰ通路相关分子IRF7、IRF7磷酸化和RIG-I蛋白的表达情况,验证NCP BVDV及非结构蛋白对抑制宿主IFN-Ⅰ产生的影响。（3）最后,克隆及表达Bo SIKE1基因,制备相应的多克隆抗体,通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹法验证过表达和干扰Bo SIKE1对BVDV增殖的影响。采用LC-MS/MS和Co-IP等方法筛选Bo SIKE1的互作蛋白。结果:（1）NCP BVDV感染牛单核细胞后,细胞免疫荧光检测显示成功构建了NCP BVDV体外原代细胞感染模型;对转录组测序分析,在感染2 h后,筛选出DEGs 9959个,其中4968个DEGs上调;在感染24 h后,筛选出DEGs 7977个,其中4184个DEGs表达上调;进一步分析免疫应答途径相关DEGs,对感染2 h与24 h的DEGs进行比较,感染2 h与免疫反应或抗病毒活性相关的DEGs明显高于24 h;利用KEGG聚类分析筛选95个Ⅰ型干扰素信号通路相关的DEGs,利用q RT-PCR证实了筛选的干扰素信号通路、干扰素刺激基因（Interferon（IFN）-stimulated genes,ISGs）和参与固有免疫应答的基因（IRF7、DDX3X、TLR13、DDX 58、MVAS、TLR9、TRAF6、IRF1、IFIT1、STAT1、ISG20、TRIM25、Mx1、NLRX1、CYLD、SIKE1和ZAP70）的差异表达水平与转录组测序结果基本一致。（2）克隆Bo IFN-β的启动子功能元件序列,成功的构建Bo IFN-β基因启动子荧光素酶报告系统;利用抗性基因筛选获得Bo IFNβ3-Luc-MDBK细胞系,用NCP BVDV感染Bo IFNβ3-Luc–MDBK细胞发现NCP BVDV毒株感染可明显抑制poly（I:C）诱导的IFN-β3的转录活性,同时也抑制了下游抗病毒基因的表达;基因合成NCP BVDV的7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)基因并连接慢病毒载体,酶切鉴定和测序表明重组慢病毒载体构建成功,并且包装的慢病毒感染MDBK后能够表达目的基因;通过荧光素酶报告系统检测NCP BVDV及7个非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu IRSE和Bo IFN-β的荧光素酶活性,结果表明,NCP BVDV能够抑制IFN-β的转录表达,其中非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-β的转录表达有显着的抑制作用;在HEK293T细胞中过表达NS4B蛋白,可以显着抑制IRF7的表达以及磷酸化水平,对RIG-I的表达没有抑制作用。（3）克隆到Bo SIKE1基因的ORF为642 bp,同源性分析发现,Bo SIKE与羊、猪、人和鼠的氨基酸相似度分别为99%、96.1.0%、94.2%和91.1%;构建原核重组表达质粒p ET22b-Bo SIKE1,转化大肠杆菌并表达了约为25 k Da的目的条带,通过诱导条件优化Bo SIKE1融合蛋白均以包涵体形式表达,纯化Bo SIKE1蛋白并成功制备了兔多克隆抗体,抗体ELISA效价检测抗体滴度达到1:128000以上;通过过表达和干扰验证了Bo SIKE对BVDV增殖的影响,Bo SIKE1过表达后引起BVDV复制增强,干扰Bo SIKE1的表达会引起BVDV复制降低,Bo SIKE具有抑制抗病毒免疫的作用。LC-MS/MS和Co-IP数据显示Bo SIKE1与微管蛋白TUBA1D之间存在直接相互作用。推测SIKE可能介导固有免疫所需的细胞骨架重排,是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。结论:（1）成功构建NCP BVDV感染牛原代免疫细胞模型并获得不同感染时间转录组差异表达谱,筛选了95个IFN-Ⅰ信号通路相关的DEGs。（2）通过干扰素启动子荧光素酶报告系统检测发现,NCP BVDV非结构蛋白Npro和NS4B对IFN-Ⅰ的产生具体抑制作用。（3）Bo SIKE1能够影响NCP BVDV的增殖,Bo SIKE1与TUBA1D之间存在直接相互作用,推测Bo SIKE1蛋白可能是联系细胞骨架结构与固有免疫信号通路的桥梁。
周建卫[5]（2020）在《猪圆环病毒的入核机制研究》文中研究说明猪圆环病毒（PCV）是猪圆环病毒病（PCVAD）的主要病原,是目前发现能在哺乳动物体内复制的最小DNA病毒,主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）。已有的研究分析了 PCV2的吸附、入侵、基因组的复制和转录调控等过程,但其胞内运输和入核机制尚不明确,病毒能否成功将遗传物质（环状DNA）运输至细胞核周并最终入核决定它能否进行有效复制。病毒与宿主间的相互作用是机体致病机理和免疫防御之间的一场旷日持久的拉锯战,其最终结局或是激活宿主的免疫防御系统以消灭病毒,抑或是劫持宿主的免疫防御机制以促进病毒的传播。因此,全面系统地了解宿主和病毒蛋白之间的相互作用以及病毒如何通过与宿主间的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions,PPIs）劫持宿主细胞的生物学过程,可为探究病毒的复制与致病机制和开发新的抗病毒药物提供有效的信息和线索。本研究首先发现PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性,有利于PCV2病毒粒子的核靶向运输过程,且通过与HDAC6蛋白相互作用抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能,并最终促进圆环病毒的复制过程。其次从免疫共沉淀串联质谱方法入手,发现核仁磷蛋白NPM1能与PCV2Cap蛋白相互作用,且证明PCV2病毒以完整衣壳蛋白的形式经微管运输至细胞核周时,Cap蛋白能促使NPM1蛋白发生核穿梭,导致其由核仁易位至核质和胞质处,并通过与Cap蛋白直接结合介导病毒粒子的入核,从而促进猪圆环病毒的复制。最后,NPM1蛋白还能通过与PCV3 Cap蛋白NLS结合促进PCV3 Cap蛋白的核仁定位,NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用。1、PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程本实验室前期结果表明在PCV2病毒感染早期衣壳蛋白能通过募集胞浆动力蛋白的IC1亚基进行核靶向运输过程。为了分析其他宿主蛋白是否能通过影响微管的功能发挥参与调控PCV2的胞内运输过程以及PCV2能否调节微管蛋白的乙酰化修饰从而影响微管稳定性,我们通过PCV2感染和Cap蛋白表达处理PK-15细胞并分析乙酰化α-tubulin的表达水平,结果发现α-tubulin的乙酰化修饰水平大大提高;而通过HDAC6去乙酰化酶特异性抑制剂-Tubacin药物处理PK-15细胞后可以增强α-tubulin的乙酰化修饰水平并能促进PCV2的复制过程,该结果暗示了 PCV2衣壳蛋白可能具有维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并提高微管的稳定性的功能。另外,我们还发现PCV2 Cap蛋白能与HDAC6蛋白共定位和直接相互作用,且Cap蛋白的N端区域（42-100aa）介导与HDAC6蛋白全长相互作用。PCV2 Cap蛋白能在体外和细胞内抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性。HDAC6蛋白能通过诱导α-tubulin发生去乙酰化修饰抑制PCV2病毒的复制从而发挥抗病毒作用,反过来PCV2也能通过Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性发挥拮抗HDAC6的抗病毒功能。综上所述,PCV2 Cap蛋白能通过与HDAC6相互作用抑制HDAC6蛋白的去乙酰化酶活性,维持α-tubulin的乙酰化修饰水平并最终促进猪圆环病毒2型的复制过程。2、PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱PCV2 Cap蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白,可以作为研究圆环病毒与宿主蛋白间相互作用的模型,以便更好地了解病毒的复制周期。本研究将免疫共沉淀（Co-IP）与液相质谱（LC-MS）技术相结合,在PCV2感染PK-15细胞中鉴定到222个与Cap蛋白潜在互作的宿主蛋白,并绘制出一张蛋白质-蛋白质相互作用网络图。GO注释和KEGG通路分析结果表明,与PCV2 Cap蛋白互作的宿主蛋白可能参与了蛋白质结合、DNA转录和复制、物质和能量代谢、先天性免疫应答、MAPK信号通路和剪接体信号通路激活等不同的生物学过程。Co-IP和 GST pull-down 实验证明 PCV2Cap 蛋白能与 hnRNPC、NPM1、DDX21、IC1等蛋白直接相互作用。PCV2Cap蛋白互作宿主蛋白可能会形成新的转录/复制复合体（replication-transcriptioncomplex,RTC）,在 PCV2 的复制和致病过程中起着极其重要的调控作用。3、NPM1蛋白调控PCV2病毒入核的机制研究病毒粒子的入核是PCV2复制的必要条件。然而,核仁穿梭蛋白在PCV2入核过程中的作用机制仍不清楚。本研究首次在PCV2Cap蛋白中鉴定到一个先前未知的、新的核仁定位信号（NoLS）,并发现PCV2能利用宿主的NPM1蛋白促进病毒的复制。激光共聚焦显微镜结果显示,在PCV2感染过程中,NPM1蛋白能从核仁易位至核质和胞质处。Co-IP和GST pull-down实验结果表明,PCV2 Cap蛋白能与NPM1蛋白直接相互作用。互作功能域的精细定位结果显示,PCV2 Cap蛋白NLS-A（1MTYPRRRYRRRRHRPRSHLG20）的精氨酸富集区（ARM）与NPM1-OligoD结构域的Ser48是介导二者相互作用的关键性氨基酸位点。病毒拯救结果表明,PCV2 Cap蛋白NLS-A中ARM的9个精氨酸（Arg）都突变为丙氨酸（Ala）将导致病毒的复制能力降低。NPM1蛋白的敲降和Ser48突变为Glu48都能抑制PCV2的复制。此外,激光共聚焦显微镜结果表明PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM是核仁定位信号（NoLS）。综上所述,PCV2Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,能够通过与NPM1蛋白直接结合促进PCV2病毒的入核。4、NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究NPM1蛋白对非组装的PCV3 Cap蛋白入核的作用机制尚不清楚。本研究首次鉴定到PCV3Cap蛋白新的核仁定位信号（NoLS）,它能利用NPM1蛋白促进自身的核仁定位。激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3Cap蛋白能与NPM1共定位于核仁。Co-IP和GST pull-down实验结果显示,PCV3 Cap蛋白能与NPM1蛋白相互作用。互作结构域的精细定位结果表明,来自陆地的、水生的和禽类的（包括猪、金丝雀、犬、水貂、蜻蜓、鸽、鸭、蝙蝠、鹅和鹦鹉）圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用,表明该互作在进化上极为保守;另外,NPM1-OligoD结构域中Ser48是介导与PCV3 Cap蛋白相互作用的关键性氨基酸位点。NPM1蛋白敲降后将抑制PCV3 Cap蛋白的核仁定位。此外,激光共聚焦显微镜结果表明,PCV3 Cap蛋白的NLS是核仁定位信号（NoLS）,且NPM1蛋白中Ser48的电荷性质决定与PCV3 Cap蛋白的相互作用。综上所述,PCV3 Cap蛋白是一个核仁定位蛋白,NPM1蛋白中Ser48的电荷性质对其亚细胞定位以及与PCV3 Cap蛋白的相互作用至关重要。上述数据旨在阐明猪圆环病毒复制过程中借助HDAC6和NPM1蛋白实现胞内运输和入核的策略以及“核穿梭”机制,有助于进一步解析猪圆环病毒复制的分子机制以及鉴定潜在的抗病毒药物靶点。
江振洲,袁子航,孙丽新,吴启鹏,柴媛媛,李思佳,向婷,喻琼娜,朱英,张陆勇[6]（2020）在《中国药物作用靶点研究进展（Ⅰ）》文中提出通过检索近2年中国学者在国内外杂志上发表的关于心脑血管疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、神经退行性疾病、精神障碍性疾病、感染性疾病、代谢类疾病等重大疾病治疗靶点的相关论文,分类综述这些重大疾病药物作用靶点研究的新进展,为新药研发及新治疗靶点的寻找提供参考和思路。
陈松彪[7]（2020）在《宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究》文中提出猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍性疾病重要病原,能够引起初孕母猪流产、产死胎、畸胎和木乃伊胎等,给养猪业造成了巨大的经济损失。PPV基因组主要包括2个开放性阅读框（Open Reading Frame,ORF）ORF1和ORF2,ORF1主要编码非结构蛋白NS1和NS2,它们的功能是参与病毒复制及致细胞病变。NS2具有与NS1相同的N末端,且NS2-m RNA是由NS1-m RNA（pre-m RNA,NS2-m RNA的前体m RNA）经可变剪接之后产生。宿主蛋白Syncrip是核不均一核糖核蛋白（Heterogenous nuclear ribonucleo proteins,hn RNPs）家族成员之一,与宿主细胞m RNA的转录、外显子剪接以及剪接位点的选择等过程相关,此外还参与了某些肝炎病毒的复制。ORF2主要编码结构蛋白VP1和VP2,VP2是PPV最主要的衣壳蛋白,占衣壳成分的80%左右,在病毒感染过程中VP2参与了病毒基因组的入核和成熟病毒粒子的组装。宿主蛋白MCM3是解旋酶MCM家族成员之一,在宿主DNA复制过程中能够使双链DNA发生解旋从而促进宿主细胞DNA的复制。然而,在PPV复制过程中宿主蛋白Syncrip和MCM3有何作用及其作用机制,迄今尚未见报道。本论文首先构建编码NS1和NS2共有基因序列的大肠杆菌表达载体,制备能同时识别出NS1和NS2的多克隆抗体。通过无缝克隆技术（In-Fusion）构建稳定携带遗传标记的PPV全长感染性克隆株。然后,利用蛋白-蛋白免疫共沉淀（Co-IP）以及RNA-蛋白免疫共沉淀（RNA-pulldown）串联质谱技术分别筛选出NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3。最后,研究宿主互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步探索PPV致病机制奠定理论基础。研究取得以下结果。1.PCR扩增出编码NS1和NS2共有的ns基因,将扩增出的ns基因克隆入原核表达载体p ET-32a,PCR、酶切和测序鉴定结果显示,p ET-32a-NS原核表达载体构建成功。将p ET-32a-NS转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行诱导表达,SDS-PAGE和western blotting结果显示,重组质粒在大肠杆菌中成功表达出大小为35 k Da左右的NS重组蛋白,并且该重组蛋白在上清和包涵体中均有表达。对重组菌可溶性表达的最佳条件进行优化,结果显示,重组菌在37℃,0.8 m M诱导剂诱导6 h时的可溶性表达量最高。在最佳条件下大量诱导表达重组蛋白,通过His镍柱纯化出NS重组蛋白。将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗NS蛋白血清抗体,ELISA检测抗体效价为1:12800,western blotting检测结果显示,该抗体能够特异性识别原核表达NS重组蛋白以及真核细胞表达的NS1和NS2。2.人工合成基因组两端的特殊回文序列F1和F2,构建含F1和F2序列的质粒p KQLL（F1+F2）。以提取的PPV DN A为模板,分别扩增F3和F4片段,与线性化处理的质粒p KQLL（F1+F2）进行无缝克隆（In-fusion）连接,构建携带遗传标记的PPV全长感染性克隆质粒p Y-PPV,将p Y-PPV质粒转染PK-15细胞,连续盲传进行病毒拯救。提取被感染细胞的DNA进行病毒核酸PCR检测呈阳性,在电镜下观察到了病毒粒子,western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测到病毒蛋白的表达,并且连续盲传至15代仍然能检测到病毒所携带的遗传标记。以上结果表明,成功拯救出稳定携带遗传标记的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。将Y-PPV和亲本毒株PPV按照相同MOI接种PK-15细胞,通过测定感染后不同时间点病毒DNA拷贝数和TCID50,检测Y-PPV和亲本毒株PPV的复制能力。同时通过AO-EB染色、流式细胞术及caspase活性检测Y-PPV和PPV诱导细胞凋亡的特性。结果显示,Y-PPV的复制能力与亲本毒株相比无显着差异（p>0.05）,同时具备与亲本毒株相似的诱导细胞凋亡特性。进一步将Y-PPV和PPV分别感染初孕母猪,ELISA检测到Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中PPV抗体水平变化趋势一致且各时间点的PPV抗体水平无明显差异（p>0.05）,放射免疫检测结果显示,Y-PPV和PPV感染组初孕母猪血清中的孕酮水平变化趋势一致且各时间点的孕酮水平无明显差异（p>0.05）。通过Real-time PCR检测到Y-PPV和PPV感染的同一组织中病毒载量无明显差异（p>0.05）。病理组织学检查结果显示,Y-PPV和PPV感染均能够使子宫和卵巢组织出现明显病理学损伤。3.筛选鉴定NS1-m RNA的关键宿主互作蛋白。体外合成生物素标记NS1-m RNA,将其与PK-15细胞核抽提物共孵育,以链霉亲和素磁珠筛选共沉淀蛋白并进行质谱分析,筛选出与NS1-m RNA互作的关键宿主蛋白Syncrip。将生物素标记NS1-m RNA和PK-15细胞核抽提物共孵育,RNA-pulldown检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。用Syncrip抗体和PPV感染的PK-15细胞核抽提物共孵育进行蛋白质-RNA免疫共沉淀,结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在互作。在PPV感染PK-15细胞后进行原位杂交,通过激光共聚焦检测结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在共定位。将生物素标记NS1-m RNA和纯化后原核表达的Syncrip进行体外互作试验,凝胶迁移结果显示,NS1-m RNA和Syncrip存在直接互作。4.明确Syncrip在PPV感染过程中的作用及机制。利用syncrip的si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50。结果显示,干扰syncrip的表达能够降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了syncrip敲除细胞株,检测结果显示,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异（p>0.05）。PPV感染syncrip敲除细胞后发现,syncrip的缺失能够显着降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）,并且也能够显着降低NS2的蛋白表达水平和m RNA水平（p<0.05）。同时在Y-PPV平台上构建ns2缺失型毒株,细胞试验结果显示,ns2缺失能够显着降低PPV感染过程中的病毒DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。利用Real-time PCR和western blotting检测到PPV在组织中的复制水平与Syncrip表达水平呈正相关。在体外共转染ns1和syncrip,western blotting和Real-time PCR结果显示,过表达Syncrip能够显着降低NS1的蛋白表达和m RNA表达水平（p<0.05）。在体外共转染ns1上ns2的3’末端的剪接位点突变的Flag-NS1（p C-Mut）和Syncrip,western blotting结果显示,过表达Syncrip对NS1的蛋白表达无明显影响（p>0.05）。5.筛选鉴定VP2的关键宿主互作蛋白。收集PPV感染PK-15细胞后的细胞蛋白,以PPV衣壳蛋白3C9抗体进行免疫共沉淀和质谱分析,筛选出VP2的关键宿主互作蛋白MCM3。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3共转至HEK293T细胞,Co-IP发现VP2和MCM3存在互作。将p CI-His-VP2和p CI-Flag-MCM3质粒共转染或病毒感染PK-15细胞后进行免疫荧光染色分析,在激光共聚焦显微镜下观察到外源性及内源性的VP2和MCM3存在明显共定位现象。进一步在大肠杆菌中分别表达p ET-32a-VP2和p GEX-4T-MCM3蛋白并进行纯化,通过GST-pulldown及His-pulldown均能够检测到VP2和MCM3的互作,并且二者的互作不依赖于PPV感染或其它分子的参与。6.明确VP2及MCM3在PPV复制过程中的作用与机制。用vp2基因si RNA处理PK-15细胞后,测定PPV感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数和TCID50,结果显示,干扰vp2的表达能够显着降低PPV感染后的DNA拷贝数和TCID50（p<0.05）。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了mcm3敲除细胞株,检测发现,该细胞株的细胞活力和野生型PK-15细胞相比无明显差异（p>0.05）。细胞感染试验结果显示,mcm3的缺失能够显着降低PPV感染后的DN A拷贝数和TCID50（p<0.05）。通过Co-IP鉴定出VP2的115 aa231 aa是和MCM3互作的关键结构域。进一步通过原位杂交方法在激光共聚焦显微镜下观察到,在PPV感染后NS1、VP2、MCM3以及病毒基因组DNA存在互作。然后通过DNA-pulldown检测到VP2、NS1和病毒基因组DNA存在直接互作关系,而MCM3不能直接和病毒基因组DNA发生互作。通过Co-IP和激光共聚焦检测到NS1不能参与招募MCM3到病毒基因组DNA,而VP2能够直接招募MCM3到病毒基因组DNA。进一步的DNA-pulldown检测到基因组DNA的300nt356 nt是DNA与VP2互作的关键基序区域,突变该互作基序能够完全阻止PPV的复制。本研究制备了特异性强、且能够同时识别PPV非结构蛋白NS1和NS2的多克隆抗体。成功获得了一株具有遗传稳定性、能够与亲本毒株感染相区分,并且保留了和亲本毒株相似生物学特性的PPV感染性克隆株,命名为Y-PPV株。分别筛选到NS1-m RNA和VP2关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3,明确了NS1-m RNA和VP2与关键宿主互作蛋白Syncrip和MCM3的直接互作关系。发现了NS2和Syncrip能够参与PPV的复制过程,敲除syncrip显着降低PPV的复制以及NS2的表达,ns2的缺失同样会显着降低PPV的复制能力。Syncrip的过表达会显着降低NS1的表达,并且该作用位点位于ns1基因上ns2的3’末端的剪接位点。发现了VP2及其互作蛋白MCM3均参与了PPV的复制,PPV感染过程中通过VP2和病毒基因组DNA直接互作招募MCM3至病毒基因组的DNA促进PPV的复制,获得了VP2的115 aa231 aa是与MCM3发生互作的关键结构域。发现了病毒基因组300 nt356 nt是病毒基因组DNA和VP2发挥互作的关键基序,并且该关键基序对PPV复制是必需的。上述研究结果阐明了NS1-m RNA和VP2及其互作蛋白Syncrip和MCM3在PPV复制过程中的作用及机制,为进一步深入探讨PPV致病机制提供理论依据。
史世锋[8]（2019）在《耐药细胞外泌体中miR193对食管癌细胞耐药作用及其机制》文中研究指明引言食管癌是全球第八大常见肿瘤,也是世界癌症相关死亡的最常见原因之一。统计结果显示,我国食管癌患者占全球患者总数的一半以上,男性和女性死亡率都居于全球首位,食管癌的治疗方案包括手术、化疗、放疗等。中晚期食管癌耐药性的产生是阻碍治疗效果的重要因素之一。肿瘤耐药的机制包括:（1）药物外排,减少肿瘤细胞内药物的浓度。（2）细胞凋亡阻滞。（3）DNA损伤修复应答。在肿瘤细胞中,耐药性的产生可能由一种或几种机制共同发挥作用,不同肿瘤细胞中的作用机制不同。外泌体是具有脂质双分子膜的纳米级囊泡,存在于所有体液中。肿瘤细胞分泌的外泌体参与多种细胞功能和生理病理事件。外泌体内容物包括mRNA、miRNA、蛋白质等,这些内容物都具有生物活性,能够在靶细胞中执行功能反应,而外泌体内容物miRNA与食管癌化疗耐药性的作用及其相关机制,目前尚不清楚。本实验通过食管癌细胞株TE1构建食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP,并研究食管癌耐药细胞株TE1/DDP分泌的外泌体对敏感细胞株TE1顺铂敏感性的影响。通过对外泌体中的miRNA和处理细胞转录组进行高通量测序,利用生物信息学软件进行miRNA和mRNA关联分析,寻找与顺铂化疗耐药相关的miRNA,研究该miRNA对食管癌细胞生物学功能（增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等）的影响,预测相关靶基因,分析其参与食管癌顺铂化疗耐药的机制。第一部分 顺铂耐药细胞外泌体对敏感细胞顺铂耐受性的影响目的构建食管癌顺铂耐药细胞株,研究食管癌顺铂耐药细胞株外泌体对顺铂敏感细胞株的影响。方法1.利用最低耐受浓度的顺铂处理食管癌顺铂敏感细胞株TE1,直至该细胞株对顺铂耐药,命名为TE1/DDP细胞株。2.利用CCK-8试剂盒和流式细胞术检测TE1/DDP细胞株在最低顺铂耐受浓度压力下的细胞活力和凋亡情况。3.利用超速离心法提取外泌体,透射电镜观察和Western blot检测鉴定提取的外泌体。4.通过CCK-8检测耐药细胞株外泌体干预敏感细胞后对顺铂耐受能力的影响。结果1.CCK-8试剂盒和流式细胞术检测结果显示,在IC50浓度（0.7 μg/mL）顺铂压力下,与TE1细胞株相比,TE1/DDP细胞株的活力显着升高（P<0.001）,细胞凋亡显着降低,说明成功构建食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP。2.在透射电镜下,可以看到食管癌外泌体呈典型的圆形或椭圆形杯状结构,大小为50-200 nm。Western blot检测结果显示,TE1/DDP细胞和TE1细胞外泌体均可以检测到CD63蛋白。3.CCK-8结果显示在添加TE1/DDP的外泌体（浓度:5.32×109/mL）后TE1细胞对顺铂的耐受性显着增加（P<0.05）小结成功构建了食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP,其外泌体能够使敏感细胞TE1增加对顺铂的抵抗。第二部分影响敏感细胞耐药的外泌体miRNA及靶基因筛选目的通过高通量测序技术,对食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP和顺铂敏感细胞株TE1中外泌体中的miRNA和耐药外泌体干预后细胞转录组进行测序,寻找与食管癌细胞顺铂耐药相关的miRNA和mRNA,研究其与食管癌患者生存率的关系。方法1.利用超速离心法提取外泌体,总RNA提取试剂盒提取外泌体中的总RNA,构建RNA测序文库进行高通量测序;提取细胞总RNA构建转录组文库,进行转录组测序;2.从测序数据中选取表达量显着差异的miRNAs进行荧光定量PCR验证;3.生物信息学软件关联分析miRNAs和mRNAs,预测与食管癌细胞顺铂化疗耐药的miRNAs。结果1.两组外泌体共有3182个miRNAs共靶标到69540个基因;其中在TE1组中973个miRNAs共靶标到67631个基因,在TE1-DDP组中561个miRNAs共靶标到65885个基因。2.差异表达统计分析结果显示,TE1组和TE1/DDP组的差异miRNAs共有493个,其中189个属于上调miRNAs,304个属于下调的miRNAs。3.TE1组和TE1/DDP组的差异基因共有5155个,其中3446个基因上调,1709个基因下调。4.生物信息学软件对mRNAs和miRNAs进行关联分析结果显示,ESR1基因和TP53基因位于关联分析网络的核心位点,且均与TFAP2C基因相关。5.荧光定量PCR检测结果显示,miRNAs在食管癌中的表达与测序数据中的表达量结果相一致。6.生存曲线分析结果显示,TFAP2C高表达的食管癌患者整体生存率高于TFAP2C低表达的患者;miR193高表达的食管癌患者整体生存率低于miR193低表达的患者。小结TFAP2C基因与食管癌化疗耐药相关,miR193和TFAP2C与食管癌患者的生存率相关。第三部分miR193参与食管癌顺铂化疗耐药的机制研究目的检测TFAP2C和miR193在不同食管癌细胞株中的表达,检测不同食管癌细胞中耐药相关基因的表达,验证TFAP2C和miR193的结合情况,构建TFAP2C过表达和miR193过表达食管癌细胞株;研究TFAP2C和miR193表达量变化对食管癌细胞增殖、侵袭能力、克隆形成能力和凋亡的影响。方法1.利用荧光定量PCR技术和Western blot技术检测TFAP2C和miR193在不同食管癌细胞和外泌体中的表达;2.利用双萤光素酶报告基因检测TFAP2C和miR193的靶向结合;3.利用慢病毒载体构建TFAP2C过表达和miR193过表达食管癌细胞株;4.利用EdU细胞增殖实验、流式细胞术、克隆形成实验、Transwell实验,研究TFAP2C和miR193表达量变化对食管癌细胞增殖、细胞周期、侵袭能力、克隆形成能力和凋亡的影响。5.采用Western blot检测与细胞周期及凋亡相关蛋白的表达水平;6.通过ChIP实验检测TFAP2C与P21基因启动子相互结合;结果1.荧光定量PCR检测结果显示,miR193在TE1细胞株外泌体中的相对表达水平显着低于在TE1/DDP细胞株外泌体中的相对表达水平,P<0.001;miR193在TE1细胞中的相对表达水平显着低于在TE1/DDP细胞中的表达水平（P<0.001）,而加入TE1/DDP细胞株外泌体的TE1细胞（TE1/E）中miR193的相对表达水平显着高于TE1细胞,P<0.01。2.TE1/DDP细胞株中TFAP2C的相对表达水平显着低于TE1细胞株中的相对表达水平（P<0.001）,而加入TE1/DDP细胞株外泌体的TE1细胞中TFAP2C的相对表达水平显着低于TE1细胞（P<0.01）。3.双萤光素酶报告基因检测结果显示,miR193与TFAP2C基因3’-UTR区相结合,提示TFAP2C是miR193的靶基因。4.细胞周期检测结果显示,TE1/DDP细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例小于TE1细胞株,而TE1/DDP细胞株外泌体可以部分解除顺铂对食管癌细胞周期的阻滞作用;miR193过表达细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例小于miR193过表达对照组,TFAP2C过表达细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例大于TFAP2C过表达对照组。5.TE1/DDP细胞株中TFAP2C、TP53和P21基因的相对表达水平较低,EGFR和Cyclin D1基因的相对表达水平较高;而TE1/DDP细胞株外泌体可以改变这些基因在TE1细胞株中的相对表达水平。6.EdU增殖检测结果显示,在顺铂压力下,TE1/DDP细胞株增殖的细胞数显着大于TE1细胞株（P<0.01）;TFAP2C过表达细胞株增殖的细胞数显着小于TFAP2C过表达对照组（P<0.01）;miR193过表达细胞株增殖的细胞数显着高于miR193过表达对照组（P<0.01）。7.克隆形成实验结果显示,与TE1细胞株形成的克隆数相比,TE1/DDP细胞株的克隆形成数显着增多（P<0.01）;与TFAP2C过表达对照组相比,TFAP2C过表达组细胞株的克隆形成数显着降低（P<0.05）;与miR193过表达对照组相比,miR193过表达组细胞株的克隆形成数显着增多（P<0.01）。8.细胞凋亡实验结果显示,与TFAP2C过表达对照组细胞相比,TFAP2C过表达组细胞的凋亡率显着升高;与miR193过表达对照组细胞相比,miR193过表达组细胞的凋亡率显着降低;顺铂压力下miR193过表达组细胞的凋亡率显着高于正常条件下的miR193过表达组细胞。9.细胞侵袭实验结果表明,TFAP2C与miR193表达量变化对食管癌细胞侵袭能力没有显着性影响。10.ChIP实验得到的DNA中扩增获得了 P21启动子区的序列,由此可见TFAP2C能够与P21结合促进细胞周期的阻滞。小结1.TFAP2C基因是miR193调控的靶基因。2.TFAP2C过表达可以显着抑制食管癌细胞增殖、细胞周期和细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡。3.TFAP2C能够与P21结合促进细胞周期的阻滞。miR193能够通过TFAP2C调节P21解除细胞周期阻滞。第四部分裸鼠荷瘤验证miR193促进食管癌细胞耐药目的在裸鼠体内移植瘤验证miR193对食管癌肿瘤细胞生长及顺铂敏感性的影响。方法1.将食管癌细胞悬液注射到裸鼠两侧腋下组织,每天观察接种肿瘤的结节生长情况,检测移植瘤在接种后1周、2周、3周、4周时的生长情况;2.所有实验动物均两侧植瘤。首先根据左侧植瘤细胞差异分为三组,右侧统一接种TE1细胞,左侧分别接种TE1、TE1/DDP、TE1/miR193。待两侧可触到明显结节后每组动物随机分为两个亚组进行顺铂干预,并以生理盐水为对照处理。3.生长4周后,颈椎脱臼法处死裸鼠,分离肿瘤实体,并进行拍照、称重、测量体积,做好记录,绘制肿瘤生长曲线。结果1.裸鼠荷瘤实验结果显示,TE1细胞株形成的肿瘤在顺铂压力下的肿瘤体积显着小于对照条件下的肿瘤体积（P<0.05）。2.TE1/DDP细胞株在顺铂压力下形成的肿瘤体积大小与正常对照组相比显着增大（P<0.05）。3.miR193过表达TE1细胞株在顺铂压力下形成的肿瘤体积大小显着小于正常对照组（P<0.05）。4.顺铂干预下,TE1/DDP细胞株形成的肿瘤大小显着大于TE1细胞株形成的肿瘤,miR193过表达TE1细胞株形成的肿瘤大小显着大于TE1细胞株形成的肿瘤。小结顺铂可以抑制食管癌肿瘤的生长,miR193过表达能够促进食管癌肿瘤的生长,增加其对顺铂的抵抗。结论1.食管癌耐药细胞外泌体能够增强顺铂敏感细胞TE1对顺铂的抵抗。2.TFAP2C基因是miR193调控的靶基因。3.TE1/DDP细胞株外泌体可以解除顺铂对食管癌的细胞周期阻滞作用。其机制是miR193的靶基因TFAP2C是P21的转录调节因子。顺铂可以抑制食管癌肿瘤的生长,miR193过表达能够促进食管癌肿瘤的生长,增加其对顺铂的抵抗。
张伟[9]（2019）在《DNAJA3和RNF5抑制口蹄疫病毒复制的机制》文中提出口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的主要感染牛、羊和猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,严重危害世界畜牧业、社会政治和经济逾百年的动物传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列为法定必报疫病,被我国列为一类动物疫病。FMDV结构蛋白VP1最易暴露在病毒衣壳表面,含有主要抗原决定簇和受体结合位点RGD,在病毒诱导抗体应答、吸附和侵入过程中发挥重要作用,然而,关于VP1与宿主蛋白相互作用及其调控FMDV复制的机制仍不清楚。因此,本课题筛选出与FMDV VP1互作的宿主蛋白DNAJA3和E3泛素连接酶RNF5,并阐明了抑制FMDV复制的背后机制,内容如下:（1）DNAJA3抑制FMDV复制的机制研究通过酵母双杂交技术鉴定出了与VP1结合的宿主蛋白DNAJA3,免疫共沉淀（CO-IP）和共聚焦试验证实了DNAJA3与VP1的内源性相互作用。质粒截短试验和丙氨酸扫描试验结果表明DNAJA3的J结构域[氨基酸（aa）1–168]和VP1的赖氨酸208（K208）位点对DNAJA3与VP1相互作用至关重要。过表达DNAJA3显着抑制FMDV的复制,而沉默DNAJA3对FMDV的复制产生相反的作用。构建出K208A突变重组病毒,在病毒水平上进一步证实了VP1的K208位点对DNAJA3引起的病毒滴度降低是至关重要的。进一步机制研究揭示,DNAJA3通过与LC3相互作用促进溶酶体途径的激活,诱导VP1发生溶酶体降解。同时,VP1通过抑制IRF3的磷酸化、二聚化和核转移抑制IFN-β信号通路。DNAJA3的过表达显着减弱VP1介导的对IFN-β信号通路的抑制作用,而这种抑制作用在DNAJA3基因敲除细胞中显着增强。与DNAJA3正常细胞相比,Poly（I:C）诱导的IRF3磷酸化在DNAJA3敲除细胞中也较低。（2）E3泛素连接酶RNF5抑制FMDV复制的机制研究本研究发现FMDV感染在体内外均可上调E3泛素连接酶RNF5,过表达试验和SiRNA干扰试验结果表明RNF5抑制FMDV的复制,并且RNF5抑制FMDV复制依赖其具有E3泛素连接酶活性的第42位半胱氨酸。进一步机制研究表明,RNF5通过蛋白酶体途径特异性的降解VP1。免疫共沉淀试验结果表明RNF5通过直接与FMDV VP1相互作用,介导其多聚泛素化降解,此外,RNF5不仅能降解FMDV VP1,对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）、塞内卡病毒（Seneca Valley Virus,SVA）和肠道病毒71（Enterovirus 71,EV71）的VP1也同样具有降解作用,而且该降解过程依赖于RNF5的E3连接酶活性。总之,本研究揭示了宿主蛋白DNAJA3在宿主抗病毒反应中的新功能,通过诱导溶酶体途径降解VP1,并削弱VP1对IFN-β信号通路的抑制作用;并揭示了E3泛素连接酶RNF5通过泛素化降解VP1,从而抑制FMDV复制的分子机制,同时,RNF5对一些微RNA病毒科病毒具有广谱抗病毒作用,为设计高效疫苗候选株（或抗原）提供了理论依据。
王墨涵[10]（2019）在《DDX18负调控IFN-β产生的机制研究》文中研究说明转录因子IRF3（Interferon regulation factor 3）在I型干扰素（Interferon,IFN）产生途径中发挥非常重要的作用,模式识别受体TLRs（Toll-like receptors）和RLRs（RIG-I-like receptors）介导的I型干扰素产生都通过激活IRF3,使IRF3入核并结合到I型干扰素启动子上的转录因子结合位点,诱导I型干扰素产生。干扰素产生途径是被精细调控的,宿主体内存在多种分子调控I型干扰素产生。以前,关于宿主因子或病原编码蛋白如何调控IRF3的激活已经有大量的报道,但大部分研究都集中在对细胞质中IRF3激活的调控,对于细胞核中的分子如何调控IRF3,尤其是负调控IRF3的研究报道很少。为了探讨细胞核中的分子调控IRF3的机制,本课题从筛选与IRF3相互作用的细胞核蛋白着手,证实DEAD-box RNA解旋酶家族成员DDX18与IRF3存在相互作用并负调控IRF3介导的IFN-β启动子激活,在此基础上,对DDX18如何负调控IRF3诱导IFN-β产生的机制进行了深入研究。主要研究内容与结果如下:1.细胞核内IRF3的互作组学研究为了鉴定细胞核内与IRF3相互作用的蛋白,将IRF3真核表达质粒和对应的空载体质粒分别转染HEK-293T细胞,提取细胞核蛋白,用针对IRF3蛋白的抗体做免疫共沉淀并进行质谱分析。共筛选到包括DDX18（DEAD-box helicase 18）、NCOA5（nuclear receptor coactivator 5）、AHNAK（AHNAK nucleoprotein）等多个与IRF3存在潜在相互作用的细胞蛋白。考虑到DEAD-box RNA解旋酶家族蛋白广泛参与RNA代谢和天然免疫调控,而且目前尚未有DDX18调控干扰素产生的研究报道,本课题选择DDX18进行下一步研究。2.DDX18与IRF3互作的验证为了验证IRF3与DDX18之间的互作,将DDX18与IRF3真核表达质粒共转染HEK-293T细胞。免疫共沉淀结果证实DDX18与IRF3存在相互作用。为了分析DDX18与IRF3相互作用的具体区域,分别构建了DDX18的N端、C端以及解旋酶核心区域的截短突变体。将IRF3与DDX18截短体的真核表达质粒分别共转染HEK-293T细胞。免疫共沉淀检测发现IRF3与DDX18的解旋酶核心区域存在相互作用。3.DDX18负调控IFN-β的产生DDX18与IRF3存在互作,而IRF3又是调控IFN-β产生的关键转录因子,因此推测DDX18可能具有调控IFN-β的作用。将不同剂量的DDX18真核表达质粒与p RL-TK、IFN-β-Luc共转染HEK-293T细胞,然后用仙台病毒（Sendai virus,Se V）刺激或再转染IRF3的真核表达质粒。结果表明:DDX18蛋白抑制了Se V以及超表达IRF3诱导的IFN-β启动子激活,且呈剂量依赖性。同时,用si RNA干扰内源性DDX18表达,发现干扰DDX18表达能够显着上调Se V以及超表达IRF3诱导的IFN-β启动子激活。为了进一步证实内源性DDX18有负调控IFN-β的功能,利用CRISPR-Cas9技术构建了DDX18敲除细胞系,通过比较野生型与敲除细胞系在Se V以及超表达IRF3的刺激下IFN-β启动子活性,证实敲除DDX18能够显着上调IFN-β启动子激活。4.DDX18负调控IFN-β并不依赖于其解旋酶和ATP酶活性通过比对DEAD-box家族成员的保守基序,分别构建了DDX18的ATP酶活突变体DDX18-K229A和解旋酶活突变体DDX18-S364L。将野生型DDX18与DDX18-K229A、DDX18-S364L的真核表达质粒分别转染HEK-293T细胞,结果表明DDX18的两种酶活突变体仍然抑制Se V以及超表达IRF3诱导的IFN-β启动子激活,并且抑制效果与野生型DDX18相当。进一步在DDX18敲除细胞系超表达野生型DDX18或突变体DDX18-K229A、DDX18-S364L,发现无论是DDX18的野生型还是突变体均可回复IFN-β启动子激活的水平。上述结果表明,DDX18负调控IFN-β不依赖于其解旋酶活性和ATP酶活性。5.DDX18阻碍IRF3与IFN-β启动子结合为了进一步研究DDX18抑制IFN-β产生的具体机制,将DDX18与RLRs信号通路中的关键分子RIG-I、MDA5、IPS-1、TBK1、IKKε、IRF3共表达,发现DDX18可以显着抑制上述分子诱导的IFN-β启动子激活,而且DDX18还可以抑制IRF3显性突变体IRF3-5D介导的IFN-β启动子激活,证实DDX18发挥抑制作用的靶点确实位于细胞核内。考虑到DDX18与细胞核内的IRF3存在相互作用,推测DDX18通过与IRF3相互作用,抑制IRF3与IFN-β启动子结合。为了证实这一推测,采用染色质免疫共沉淀方法分析了DDX18超表达对IRF3与IFN-β启动子结合的影响。结果发现,DDX18及其解旋酶突变体均可阻碍IRF3与IFN-β启动子结合,但DDX18并不能直接结合IFN-β启动子。
二、丙型肝炎病毒核蛋白与转录调节因子NFAT1C和YY1的结合位点分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒核蛋白与转录调节因子NFAT1C和YY1的结合位点分析（论文提纲范文）
（1）环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、CircACTN4在ICC组织中显着性高表达 |
| 二、CircACTN4 的表达与临床预后的关系 |
| 三、CircACTN4 对胆管癌细胞表型的影响 |
| 四、CircACTN4 调控FZD7 的表达 |
| 五、CircACTN4与YBX1 相互作用 |
| 六、CircACTN4 招募YBX1 共同激活FZD7 的转录 |
| 七、CircACTN4 充当miR-424-5p的分子海绵 |
| 八、CircACTN4 参与Wnt和 Hippo信号通路的调节 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 环状RNA分子的研究进展及其与疾病的联系 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）肝细胞性肝癌（HCC）中线粒体转录延伸因子（TEFM）的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 1 线粒体与肝细胞性肝癌(HCC)发生和发展的关系 |
| 2 线粒体复制调控机制 |
| 2.1 mtDNA的结构 |
| 2.2 mtDNA复制因子 |
| 2.3 mtDNA复制方式 |
| 3 线粒体转录调控机制 |
| 4 线粒体转录延伸因子的研究进展 |
| 4.1 人TEFM蛋白的结构 |
| 4.2 TEFM调控mtDNA的转录延伸和抗转录终止 |
| 4.3 TEFM调控mtDNA的转录延伸 |
| 4.4 TEFM抗转录终止作用 |
| 4.5 人线粒体转录延伸复合体 |
| 4.6 TEFM参与线粒体RNA的加工 |
| 4.7 TEFM与线粒体能量产生及线粒体疾病的发生密切相关 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第一章 基于肿瘤公共数据库分析TEFM在 HCC中的表达及预后意义 |
| 1.1 资料与方法 |
| 1.1.1 利用Oncomine芯片数据库分析TEFM在 HCC组织与正常组织表达差异 |
| 1.1.2 利用UALCAN网站分析TEFM在 HCC组织与正常肝组织表达差异以及临床病理相关性 |
| 1.1.3 TCGA数据集下载 |
| 1.1.4 TCGA数据集筛选与HCC临床病理学参数资料相关研究 |
| 1.1.5 TEFM表达水平与HCC预后分析 |
| 1.1.6 利用c Bioprotal数据库分析TEFM与多个共表达基因在HCC中的相关性 |
| 1.1.7 TEFM在 HCC中的表达与肿瘤免疫浸润性细胞的关系 |
| 1.1.8 统计学分析 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 TEFM在 HCC中的表达结果 |
| 1.2.2 TEFM在正常肝组织与不同类型HCC组织中的表达差异 |
| 1.2.3 利用UALCAN网站分析TEFM在正常肝组织与HCC组织中的表达差异 |
| 1.2.4 TEFM 表达水平与 HCC 患者肿瘤分期和分级相关性 |
| 1.2.5 TEFM基因m RNA表达与HCC患者临床病理学参数相关性 |
| 1.2.6 TEFM基因m RNA表达与HCC患者预后的相关性 |
| 1.2.7 影响HCC患者预后的COX单因素多因素回归分析 |
| 1.2.8 TEFM基因与不同基因在HCC中的表达的相关性 |
| 1.2.9 TEFM在 HCC中的表达与肿瘤免疫浸润性细胞的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 组织芯片及免疫组织化学技术分析 TEFM 在 HCC中的表达及临床病理意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 HCC组织收集及患者临床资料 |
| 2.1.2 实验主要器材 |
| 2.1.3 实验主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 石蜡切片制作 |
| 2.2.2 HE染色与定位 |
| 2.2.3 组织芯片制作 |
| 2.2.4 组织芯片切片 |
| 2.2.5 免疫组化检测 |
| 2.2.6 石蜡切片免疫组化结果判读 |
| 2.2.7 细胞阳性率分析 |
| 2.2.8 组织芯片H-score评分 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 HCC组织中细胞阳性率和TEFM蛋白的相对表达量增高 |
| 2.3.2 不同 TNM 分期的 HCC 组织和对应癌旁组织中的 TEFM 相对表达量 |
| 2.3.3 不同分化程度的 HCC组织和对应癌旁组织中的 TEFM相对表达量 |
| 2.3.4 HCC组织中TEFM的相对表达水平与临床病理特征的关系 |
| 2.3.5 HCC组织中TEFM相对表达水平与患者预后无关联 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 TEFM蛋白在C57 小鼠的组织表达谱以及Hep G2 细胞周期进程的表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 C57 小鼠和细胞株 |
| 3.1.2 实验主要试剂 |
| 3.1.3 实验主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 Western blot检测TEFM蛋白质表达水平 |
| 3.2.3 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 TEFM蛋白在C57 小鼠不同组织中的相对表达量 |
| 3.3.2 TEFM蛋白在6 种人类HCC细胞中呈高表达 |
| 3.3.3 TEFM蛋白在不同血清浓度培养条件下的表达量 |
| 3.3.4 HepG2 在正常培养24 h及饥饿24 h、48 h、72 h的 TEFM蛋白的表达量 |
| 3.3.5 HepG2 细胞在饥饿48 h后血清恢复不同时间点的TEFM蛋白相对表达量 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 附录 A 组织芯片病例信息 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果 |
（3）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 牛病毒性腹泻病毒-黏膜病(BVDV-MD) |
| 2.1.1 BVDV流行病学 |
| 2.1.2 BVDV分子生物学特征 |
| 2.1.3 BVDV基因组及其编码蛋白 |
| 2.1.4 BVDV感染机制 |
| 2.1.5 BVDV持续性感染 |
| 2.1.6 BVDV免疫逃避 |
| 2.2 RNA-Seq技术筛选病毒相关宿主基因 |
| 2.2.1 RNA-Seq技术的发展 |
| 2.2.2 RNA-Seq技术的应用 |
| 2.2.3 单细胞测序技术(Sc RNA-Seq) |
| 2.3 抗病毒固有免疫 |
| 2.3.1 TLRs及其介导的信号通路 |
| 2.3.2 RLRs及其介导的信号通路 |
| 2.4 Ⅰ型干扰素(IFN-I) |
| 2.4.1 JAK-STAT通路 |
| 2.4.2 ISGs的抗病毒作用 |
| 2.5 病毒逃避Ⅰ型干扰素信号通路 |
| 2.5.1 病毒抑制Ⅰ型干扰素上游信号通路 |
| 2.5.2 病毒抑制Ⅰ型干扰素下游信号通路 |
| 2.6 IFN信号的复杂性和宿主趋向性 |
| 3 研究内容 |
| 3.1 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 3.2 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 3.3 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 NCP BVDV感染牛单核细胞模型的建立及转录组测序分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒分离株和实验动物 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 1.2.2 免疫荧光实验(IFA) |
| 1.2.3 NCP BVDV-LC病毒TCID50测定 |
| 1.2.4 BVDV感染牛外周血单核细胞 |
| 1.2.5 RNA提取 |
| 1.2.6 建库及测序 |
| 1.2.7 生物信息学分析 |
| 1.2.8 qRT-PCR验证差异表达基因 |
| 1.2.9 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 流式细胞术鉴定牛单核细胞 |
| 2.2 NCP BVDV感染牛外周血单核细胞免疫荧光检测 |
| 2.3 差异表达基因(DEGs)的筛选 |
| 2.4 GO聚类分析 |
| 2.5 KEGG分析 |
| 2.6 Ⅰ型干扰素信号通路相关DEGs分析 |
| 2.7 qRT-PCR验证部分DEGs |
| 3 讨论 |
| 3.1 牛外周血单核细胞的分离及鉴定 |
| 3.2 NCP BVDV感染牛单核细胞DEGs分析 |
| 4 小结 |
| 试验二 牛IFN-β启动子报告载体的构建及NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 牛Ⅰ型干扰素IFN-β启动子报告载体的构建和分析 |
| 1.2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核表达载体的构建及对干扰素启动子活性的影响 |
| 1.2.3 NCP BVDV对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.4 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒载体构建及对干扰素信号通路的影响 |
| 1.2.5 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛Ⅰ型干扰素IFNβ的启动子报告载体构建及活性分析 |
| 2.1.1 牛IFN-β启动子序列的克隆 |
| 2.1.2 BoIFN-β启动子报告载体的构建 |
| 2.1.3 BoIFNβ3-Luc-MDBK细胞的制备 |
| 2.1.4 BoIFNβ3-Luc MDBK细胞对BVDV复制的影响 |
| 2.1.5 ploy(I:C)对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.2 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建及对BoIFNβ3 启动子活性的影响 |
| 2.2.1 BoIRF7和Bo DDX58 真核载体构建 |
| 2.2.2 BoIRF7和Bo DDX58对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.3 NCP BVDV在 MDBK细胞对干扰素信号通路的影响 |
| 2.3.1 NCP BVDV在 MDBK细胞上对干扰素通路相关分子转录的影响 |
| 2.3.2 NCP BVDV感染对BoIFNβ3-Luc转录活性的影响 |
| 2.4 NCP BVDV非结构蛋白对干扰素信号通路的影响 |
| 2.4.1 NCP BVDV非结构蛋白真核表达载体构建 |
| 2.4.2 NCP BVDV非结构蛋白慢病毒的包装及感染MDBK细胞 |
| 2.4.3 NCP BVDV非结构蛋白对Hu IFN-β、Hu NF-κB、Hu-IRSE、BoIFN-β转录活性的影响 |
| 2.4.4 NCP BVDV非结构蛋白NS4B对 poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ通路蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 细胞转染效率 |
| 3.2 病毒抑制IFN-Ⅰ信号通路的机制 |
| 3.3 BVDV非结构蛋白对IFN-Ⅰ通路的影响 |
| 4 小结 |
| 试验三 牛SIKE1 蛋白对NCP BVDV复制的影响及互作蛋白筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试验动物、细胞和毒株 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 BoSIKE1 基因的克隆及表达载体构建 |
| 1.2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1.2.3 NCP BVDV病毒感染MDBK细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 1.2.4 BoSIKE1 过表达和干扰对NCP BVDV复制的影响 |
| 1.2.5 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 1.2.6 BoSIKE1 与互作蛋白的Co-IP实验 |
| 1.2.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BoSIKE1 基因的克隆及同源性分析 |
| 2.2 BoSIKE1 基因的原核表达及多克隆抗体制备 |
| 2.2.1 BoSIKE1 基因的原核表达 |
| 2.2.2 BoSIKE1 抗体的制备与鉴定 |
| 2.3 BVDV病毒感染宿主细胞后对BoSIKE1 表达的影响 |
| 2.4 BoSIKE1 过表达和干扰细胞的构建 |
| 2.5 BoSIKE1 过表达和干扰对BVDV复制的影响 |
| 2.6 LC-MS/MS蛋白质组分析 |
| 2.7 BoSIKE1与TUBA1D蛋白互作验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BoSIKE对 NCP BVDV复制的影响 |
| 3.2 BoSIKE1 互作蛋白的鉴定及分析 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）猪圆环病毒的入核机制研究（论文提纲范文）
| 本研究获得以下项目资助 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文创新点 |
| 研究意义 |
| 技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪圆环病毒的研究进展 |
| 1 猪圆环病毒的发现与分类学地位 |
| 2 猪圆环病毒的流行 |
| 3 猪圆环病毒的基因组结构 |
| 4 猪圆环病毒基因组的编码蛋白及其功能 |
| 4.1 Rep蛋白和Rep'蛋白 |
| 4.2 Cap蛋白 |
| 4.3 ORF3蛋白 |
| 4.4 ORF4蛋白 |
| 5 猪圆环病毒的起源 |
| 6 猪圆环病毒的跨种传播 |
| 7 猪圆环病毒的培养增殖和感染性克隆研究进展 |
| 第二章 HDAC6蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 HDAC6:它与其他HDACs有什么不同? |
| 2 HDAC6蛋白的结构特征 |
| 3 HDAC6蛋白的功能特异性 |
| 3.1 去乙酰化酶依赖性功能 |
| 3.2 泛素依赖性功能 |
| 4 HDAC6蛋白抑制病毒的感染(抗病毒) |
| 4.1 调节微管稳定性以抑制病毒感染 |
| 4.2 融合和入侵 |
| 4.3 核靶向运输 |
| 4.4 复制 |
| 4.5 组装和释放 |
| 4.6 调控抗病毒免疫应答 |
| 5 HDAC6蛋白促进病毒的感染(促病毒) |
| 5.1 HDAC6介导的聚集体途径有利于病毒的脱衣壳 |
| 5.2 促进病毒的致病过程 |
| 6 展望 |
| 第三章 病毒入核机制的研究进展 |
| 1 细胞的核转运过程概述 |
| 2 病毒入核与核膜 |
| 3 病毒破坏核膜或核纤层入核 |
| 4 囊膜病毒的入核 |
| 5 无囊膜病毒的入核 |
| 第四章 NPM1蛋白在病毒感染中作用机制的研究进展 |
| 1 核仁磷蛋白NPM1的结构特征和主要功能 |
| 2 在病毒感染过程中NPM1蛋白与不同病毒蛋白的相互作用 |
| 2.1 腺病毒(AdV) |
| 2.2 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) |
| 2.3 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) |
| 2.4 丙型肝炎病毒(HCV) |
| 2.5 乙型肝炎病毒(HBV) |
| 2.6 丁型肝炎病毒(HDV) |
| 2.7 其他病毒 |
| 3 NPM1蛋白抑制剂作为抗病毒治疗药物 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6酶活性促进病毒的胞内运输过程 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 HDAC6酶活性测定 |
| 2.12 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.13 原核表达 |
| 2.14 GST pull-down |
| 2.15 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.16 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.17 病毒滴度测定 |
| 2.18 细胞活力检测实验 |
| 2.19 HDAC6蛋白过表达细胞系的构建 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 Cap蛋白能促进PK-15细胞中α-tubulin的乙酰化修饰水平 |
| 3.2 微管蛋白乙酰化水平调节对PCV2感染增殖的影响 |
| 3.3 PCV2感染的PK-15细胞或质粒转染的293T细胞中Cap蛋白和HDAC6的亚细胞定位分析 |
| 3.4 PCV2 Cap蛋白与HDAC6的互作关系分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白的42-100位氨基酸介导与HDAC6蛋白的相互作用 |
| 3.6 HDAC6蛋白的HD1、HD2和ZnF结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白抑制HDAC6的去乙酰化酶活性 |
| 3.8 HDAC6蛋白抑制PCV2病毒的复制 |
| 4 讨论 |
| 第二章 PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白谱 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 抗体和试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 病毒接种 |
| 2.9 蛋白样品制备 |
| 2.10 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.11 原核表达 |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 银染 |
| 2.15 蛋白质相互作用网络的构建与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫共沉淀串联质谱方法鉴定PCV2感染细胞中的衣壳蛋白互作宿主蛋白 |
| 3.2 蛋白质相互作用网络图谱的绘制与分析 |
| 3.3 GO注释与分析 |
| 3.4 KEGG通路富集分析 |
| 3.5 验证PCV2 Cap蛋白与宿主蛋白的相互作用 |
| 4 讨论 |
| 第三章 核仁磷蛋白NPM1调控PCV2病毒入核的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 融合PCR及定点突变 |
| 2.7 质粒抽提 |
| 2.8 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.9 病毒接种 |
| 2.10 蛋白样品制备 |
| 2.11 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.12 GST pull-down |
| 2.13 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.14 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 2.15 病毒滴度测定 |
| 2.16 细胞活力检测实验 |
| 2.17 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.18 wt-和mA-PCV2突变体病毒拯救 |
| 2.19 胞浆/胞核组分抽提 |
| 2.20 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2感染PK-15细胞中NPM1蛋白水平的变化 |
| 3.2 NPM1的RNAi细胞系的建立 |
| 3.3 NPM1蛋白促进PCV2病毒的复制 |
| 3.4 PCV2感染或质粒转染的PK-15细胞中病毒蛋白Cap、Rep、ORF3、ORF4和NPM1蛋白的亚细胞定位分析 |
| 3.5 PCV2 Cap蛋白与NPM1的互作关系分析 |
| 3.6 PCV2 Cap蛋白的核定位信号(NLS)介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 PCV2 Cap蛋白NLS-A的精氨酸富集区(ARM)是与NPM1蛋白互作的关键氨基酸位点 |
| 3.8 PCV2 Cap蛋白的ARM是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1-OligoD结构域介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.10 NPM1蛋白的Ser48介导与PCV2 Cap蛋白的相互作用 |
| 3.11 NPM1蛋白Ser48的保守性和PCV2 Cap蛋白NLS-A与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.12 NPM1蛋白敲降细胞系中回补mNPM1不同突变体对PCV2复制的影响 |
| 3.13 NPM1蛋白促进PCV2病毒的入核 |
| 3.14 在PCV2感染晚期,NPM1蛋白从核仁易位至胞质 |
| 3.15 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的拯救 |
| 3.16 PCV2 Cap蛋白NLS-A的ARM对于PCV2的复制具有重要作用 |
| 3.17 wt-PCV2和mA-PCV2的Cap蛋白与NPM1在病毒感染细胞中的互作关系分析 |
| 3.18 wt-PCV2和mA-PCV2病毒的入核能力分析 |
| 3.19 NPM1蛋白与PCV2病毒衣壳蛋白结合促进PCV2病毒入核的分子模型 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NPM1蛋白促进PCV3 Cap蛋白核仁定位的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和细胞株 |
| 1.2 试剂、载体、抗体 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 感受态细胞制备 |
| 2.2 质粒转化 |
| 2.3 PCR产物回收 |
| 2.4 单酶切、双酶切、连接 |
| 2.5 载体构建 |
| 2.6 质粒抽提 |
| 2.7 细胞转染及激光共聚焦显微镜实验 |
| 2.8 蛋白样品制备 |
| 2.9 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 2.10 GST pull-down |
| 2.11 SDS-PAGE及Western blot |
| 2.12 有效shRNA的设计和RNAi细胞系的构建 |
| 2.13 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NPM1蛋白对于PCV3 Cap蛋白的核仁定位是必需的 |
| 3.2 PCV3 Cap蛋白与NPM1蛋白在转染细胞中的共定位分析 |
| 3.3 PCV3 Cap蛋白与NPM1在质粒转染细胞中的互作关系分析 |
| 3.4 质粒共转外源性表达蛋白的互作关系分析 |
| 3.5 体外表达纯化蛋白的互作关系分析 |
| 3.6 PCV3 Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的相互作用 |
| 3.7 不同种属的圆环病毒Cap蛋白NLS介导与NPM1蛋白的互作 |
| 3.8 PCV3 Cap蛋白的NLS同时也是核仁定位信号(NoLS) |
| 3.9 NPM1蛋白与PCV3 Cap蛋白互作关键氨基酸位点的鉴定 |
| 3.10 PCV3 Cap蛋白NLS(1-34aa)与NPM1-OligoD结构域的互作模型分析 |
| 3.11 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质决定NPM1/PCV3 Cap的相互作用 |
| 3.12 NPM1-OligoD结构域中Ser48的电荷性质影响NPM1蛋白的亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 本文所用引物列表 |
| 附录B 不同种属的圆环病毒Cap蛋白的NLS序列 |
| 附录C 全文缩略词 |
| 附录D 常用缓冲液及培养基配方 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（6）中国药物作用靶点研究进展（Ⅰ）（论文提纲范文）
| 1 心血管疾病作用靶点 |
| 1.1 高血压作用靶点 |
| 1.1.1 高血压治疗相关的miRNA靶点 |
| 1.1.1.1 miR-34b |
| 1.1.1.2 miR-34a |
| 1.1.1.3 miR-142-3p |
| 1.1.1.4 miR-16 |
| 1.1.2 高血压治疗相关的蛋白与基因靶点 |
| 1.1.2.1 Rho激酶 |
| 1.1.2.2 T-细胞盐皮质激素受体 |
| 1.1.2.3 补体成分3a受体和补体成分5a受体 |
| 1.2 心律失常作用靶点 |
| 1.2.1 心律失常治疗相关的miRNA靶点 |
| 1.2.1.1 miR-3144-5p |
| 1.2.1.2 miR-1231 |
| 1.2.2 心律失常治疗相关的蛋白与基因靶点 |
| 1.2.2.1 丝裂原活化激酶激酶-7 |
| 1.2.2.2 成纤维细胞生长因子13 |
| 1.3 心力衰竭作用靶点 |
| 1.3.1 心力衰竭治疗相关的miRNA靶点 |
| 1.3.2 心力衰竭治疗相关的LncRNA靶点 |
| 1.3.2.1 心肌细胞再生相关LncRNA |
| 1.3.2.2 内源性心脏再生相关调节因子 |
| 1.3.3 心力衰竭治疗相关的蛋白与基因靶点 |
| 1.3.3.1 去乙酰化酶-6 |
| 1.3.3.2 内膜转位酶50 |
| 1.3.3.3 转录激活因子3 |
| 1.3.3.4 ATP酶抑制因子1 |
| 1.3.3.5 EphrinB2 心脏纤维化是左心室重构常见的特征,最终会导致心力衰竭。 |
| 1.4 冠心病与心肌梗死作用靶点 |
| 1.4.1 冠心病与心肌梗死治疗相关的miRNA靶点 |
| 1.4.1.1 miR-20a |
| 1.4.1.2 miR-574-5p |
| 1.4.1.3 miR-21 |
| 1.4.2 冠心病与心肌梗死治疗相关的LncRNA靶点 |
| 1.4.2.1 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ型亚基δ转录本1相关LncRNA |
| 1.4.3 冠心病与心肌梗死治疗相关的蛋白与基因靶点 |
| 1.4.3.1 ADAMTS7 |
| 1.4.3.2 烟酰胺N-甲基转移酶 |
| 1.4.3.3 转化生长因子-β受体Ⅲ |
| 1.4.3.4 前列腺素E3受体 |
| 1.4.3.5 IL-37 |
| 1.4.3.6 Tim-1 + B细胞 |
| 1.4.3.7 热休克转录因子1 |
| 1.5 动脉粥样硬化作用靶点 |
| 1.5.1 动脉粥样硬化治疗相关的miRNA靶点 |
| 1.5.1.1 hsa-miR-148b |
| 1.5.1.2 miR-155 |
| 1.5.1.3 miR-17-5p |
| 1.5.1.4 miR-126 |
| 1.5.1.5 miR-9 |
| 1.5.1.6 miR-182 |
| 1.5.1.7 miR-210 |
| 1.5.1.8 miR-1185 |
| 1.5.1.9 miR-98 |
| 1.5.1.10 miR-338-3p |
| 1.5.1.11 miR-328 |
| 1.5.1.12 miR-377 |
| 1.5.2 动脉粥样硬化治疗相关的LncRNA靶点 |
| 1.5.3 动脉粥样硬化治疗相关的蛋白与基因靶点 |
| 1.5.3.1 腺苷酸激活蛋白激酶 |
| 1.5.3.2 胃饥饿素 |
| 1.5.3.3 Jmjd3 |
| 1.5.3.4 CD137 |
| 1.5.3.5 CD146 |
| 1.5.3.6 表皮生长因子受体 |
| 1.5.3.7血小板二磷酸腺苷受体亚基12 |
| 1.5.3.8 干扰素调节因子3 |
| 1.5.3.9 apelin-13 |
| 1.5.3.10 脂肪分化相关蛋白 |
| 1.5.3.11 囊性纤维化跨膜转运调节体 |
| 1.5.3.12 β-干扰素Toll/1L-1R结构域衔接蛋白 |
| 1.5.3.13 信号转导淋巴细胞活化分子家族成员7 |
| 2 脑血管病作用靶点 |
| 2.1 脑血管病治疗相关的miRNA靶点 |
| 2.1.1 miR-195 |
| 2.1.2 miR-9-5p |
| 2.2 脑血管病治疗相关的蛋白与基因靶点 |
| 2.2.1 肺腺癌转移相关转录本1 |
| 2.2.2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 |
| 2.2.3 15-脂氧合酶/15-羟二十碳四烯酸 |
| 2.2.4 组蛋白去乙酰酶4 |
| 2.2.5 趋化因子受体5 |
| 2.2.6 sigma-1 受体 |
| 2.2.7 血管内皮生长因子 |
| 2.2.8 脑活素 |
| 2.2.9 血管生成素样4 |
| 2.2.10 钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ |
| 2.2.11 Netrin-1 |
| 2.2.12 TNF-α刺激基因/蛋白6 |
| 3 自身免疫性疾病作用靶点 |
| 3.1 类风湿性关节炎作用靶点 |
| 3.1.1 可溶性白细胞介素2受体 |
| 3.1.2 T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3 |
| 3.1.3 RIPK1-VDAC1途径 |
| 3.1.4 金属硫蛋白-1、Th17与Treg |
| 3.2 系统性红斑狼疮作用靶点 |
| 3.2.1 Toll样受体-4 |
| 3.2.2 B淋巴细胞刺激因子 |
| 3.2.3 肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3 |
| 3.2.4 血清颗粒蛋白前体和卵泡抑素样蛋白1 |
| 3.3 多发性硬化作用靶点 |
| 3.4 银屑病作用靶点 |
| 3.4.1 miR-194 |
| 3.4.2 Yes相关蛋白 |
| 3.4.3 角蛋白17 |
| 3.4.4 富含半胱氨酸蛋白61 |
| 3.5 原发性免疫性血小板减少症作用靶点 |
| 3.5.1 miR-15a |
| 3.5.2 Toll样受体-4 |
| 3.5.3 CXC趋化配体因子16 |
| 3.5.4 非经典和中间单核细胞亚群 |
（7）宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词及中英文对照 |
| 文献综述 |
| 第一章 宿主蛋白Syncrip和 MCM在病毒复制过程中作用及机制研究进展 |
| 1.1 Syncrip在宿主细胞m RNA可变剪接和病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 Syncrip在宿主细胞m RNA可变剪接过程中作用及机制 |
| 1.1.2 可变剪接在病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.3 Syncrip在病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.2 MCM在宿主细胞DNA复制和病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.2.1 MCM在宿主细胞DNA复制过程中作用及机制 |
| 1.2.2 MCM在病毒复制过程中作用及机制 |
| 第二章 细小病毒与宿主蛋白互作机制研究进展 |
| 2.1 细小病毒概述 |
| 2.2 细小病毒与宿主蛋白互作机制 |
| 2.2.1 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒粘附和侵入过程中作用 |
| 2.2.2 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用 |
| 2.2.3 细小病毒与宿主蛋白互作在病毒出核过程中作用 |
| 2.3 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪细小病毒非结构蛋白NS多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ns基因的生物信息学分析 |
| 3.2.2 重组质粒p ET-32a-NS构建和鉴定 |
| 3.2.3 NS重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 NS重组蛋白的诱导表达条件优化 |
| 3.2.5 NS重组蛋白的纯化 |
| 3.2.6 NS蛋白多克隆抗体制备 |
| 3.2.7 NS蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 3.2.8 NS蛋白多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 ns基因的生物信息学分析 |
| 3.3.2 重组质粒p ET-32a-NS的构建和鉴定 |
| 3.3.3 NS重组蛋白的诱导表达检测 |
| 3.3.4 NS重组蛋白表达条件的优化 |
| 3.3.5 NS重组蛋白的纯化 |
| 3.3.6 鼠抗NS血清抗体的效价测定 |
| 3.3.7 多克隆抗体的特异性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 稳定携带遗传标记的猪细小病毒全长感染性克隆构建及其生物学特性研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PPV的增殖及病毒滴度检测 |
| 4.2.2 p KQLL(F1+F2)质粒的构建 |
| 4.2.3 PPV全长感染性克隆质粒的构建 |
| 4.2.4 病毒拯救及鉴定 |
| 4.2.5 拯救病毒的遗传稳定性检测 |
| 4.2.6 拯救病毒的复制特性检测 |
| 4.2.7 拯救病毒诱导凋亡特性检测 |
| 4.2.8 动物试验验证 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PPV病毒滴度的测定 |
| 4.3.2 PPV全长感染性克隆质粒的构建和鉴定 |
| 4.3.3 拯救病毒的鉴定 |
| 4.3.4 拯救病毒的遗传稳定性鉴定 |
| 4.3.5 拯救病毒的复制特性 |
| 4.3.6 拯救病毒诱导凋亡特性的鉴定 |
| 4.3.7 动物试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 猪细小病毒NS1-m RNA关键宿主互作蛋白筛选及鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 NS1-m RNA的生物素化标记 |
| 5.2.2 NS1-m RNA关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 5.2.3 syncrip基因的克隆、真核表达以及原核表达载体的构建 |
| 5.2.4 RNA-pulldown检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.5 RIP检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.6 荧光原位杂交(Fish)检测NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.2.7 EMSA检测NS1-m RN A和 Syncrip的互作 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 NS1-m RNA关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 5.3.3 RNA-pulldown鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.4 RIP鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.5 荧光原位杂交(Fish)鉴定NS1-m RNA和 Syncrip的互作 |
| 5.3.6 EMSA鉴定NS1-m RN A和 Syncrip的互作 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 宿主蛋白Syncrip在猪细小病毒复制过程中作用及机制 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 6.1.2 实验动物 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 干扰syncrip基因的表达对PPV复制的影响 |
| 6.2.2 syncrip基因敲除细胞系的构建 |
| 6.2.3 syncrip基因敲除对PPV复制的影响 |
| 6.2.4 syncrip基因敲除对NS2 表达的影响 |
| 6.2.5 PPV ns2 缺失型感染性克隆的构建及ns2 缺失对PPV复制的影响 |
| 6.2.6 PPV对 Syncrip表达的调控 |
| 6.2.7 检测Syncrip过表达对NS1 表达的影响 |
| 6.2.8 ns2剪接位点突变载体的构建 |
| 6.2.9 检测Syncrip调控NS1-m RNA表达的方式 |
| 6.2.10 数据分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 干扰syncrip基因的表达显着抑制PPV的复制 |
| 6.3.2 syncrip基因敲除细胞系的构建 |
| 6.3.3 syncrip基因敲除显着抑制PPV的复制 |
| 6.3.4 syncrip基因敲除显着抑制NS2 的表达 |
| 6.3.5 PPVns2缺失型感染性克隆的鉴定 |
| 6.3.6 PPV的复制水平与Syncrip的表达水平呈正相关 |
| 6.3.7 Syncrip能够促进NS1 的剪切 |
| 6.3.8 ns2剪接位点突变载体的鉴定 |
| 6.3.9 Syncrip通过作用于ns1上ns2的3’末端调控ns2 剪接 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 猪细小病毒VP2关键宿主互作蛋白筛选及鉴定 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 主要仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 vp2基因的克隆、原核表达载体及真核表达载体的构建 |
| 7.2.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.2.3 mcm3基因的克隆、原核表达载体与真核表达载体的构建 |
| 7.2.4 免疫共沉淀(Co-IP)检测VP2和MCM3 的互作 |
| 7.2.5 间接免疫荧光检测VP2和MCM3的互作 |
| 7.2.6 GST-pulldown和 His-pulldown检测VP2和MCM3 的互作 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 VP2原核表达载体和真核表达载体的鉴定 |
| 7.3.2 VP2关键宿主互作蛋白的筛选 |
| 7.3.3 MCM3原核表达载体与真核表达载体的鉴定 |
| 7.3.4 Co-IP鉴定VP2和MCM3 互作 |
| 7.3.5 间接免疫荧光鉴定VP2和MCM3互作 |
| 7.3.6 GST-pulldown和 His-pulldown鉴定VP2和MCM3 的互作 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 VP2及其互作蛋白MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 细胞、菌株、毒株和质粒 |
| 8.1.2 主要试剂 |
| 8.1.3 主要仪器设备 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 干扰vp2基因表达对PPV复制的影响 |
| 8.2.2 mcm3基因敲除细胞系的构建 |
| 8.2.3 mcm3 基因敲除对PPV复制的影响 |
| 8.2.4 VP2截短体原核表达载体的构建 |
| 8.2.5 VP2和MCM3互作结构域的检测 |
| 8.2.6 NS1真核表达载体的构建 |
| 8.2.7 检测VP2/NS1/MCM3和PPV DNA互作 |
| 8.2.8 DNA-pulldown检测VP2、NS1、MCM3和PPV DNA的互作 |
| 8.2.9 NS1与MCM3互作的检测 |
| 8.2.10 VP2 与病毒DNA及 MCM3 之间互作的检测 |
| 8.2.11 VP2与PPV基因组DNA结合基序的检测 |
| 8.2.12 VP2结合基序突变型PPV的构建及对病毒复制的影响 |
| 8.2.13 数据分析 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 干扰vp2基因表达显着抑制PPV的复制 |
| 8.3.2 mcm3 基因敲除显着抑制PPV的复制 |
| 8.3.3 VP2截短体原核表达载体的鉴定 |
| 8.3.4 VP2的115 aa~231 aa是其与宿主蛋白MCM3 发生互作的关键结构域 |
| 8.3.5 NS1真核表达载体的鉴定 |
| 8.3.6 在PPV复制过程中VP2/NS1/MCM3 与病毒DNA存在互作 |
| 8.3.7 VP2和NS1在PPV复制过程中与病毒DNA存在直接互作 |
| 8.3.8 NS1 不参与招募MCM3 到病毒基因组DNA |
| 8.3.9 VP2 负责招募MCM3 到病毒基因组DNA |
| 8.3.10 VP2 结合于PPV基因组DNA的300 nt~356 nt基序 |
| 8.3.11 突变PPV基因组DN A的 VP2 结合基序完全阻止病毒DNA的复制. |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）耐药细胞外泌体中miR193对食管癌细胞耐药作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 顺铂耐药细胞外泌体对敏感细胞顺铂耐受性的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP的建立 |
| 3.3 CCK-8法检测细胞增殖和药物敏感性 |
| 3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.5 外泌体提取 |
| 3.6 外泌体鉴定 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TE1/DDP细胞活力检测 |
| 4.2 TE1/DDP细胞凋亡检测 |
| 4.3 外泌体鉴定 |
| 4.4 TE1/DDP外泌体对TE1的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 影响敏感细胞耐药的外泌体miRNA及靶基因筛选 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 食管癌顺铂耐药/敏感细胞株外泌体的提取 |
| 3.3 外泌体RNA cDNA文库构建 |
| 3.4 高通量测序 |
| 3.5 外泌体miRNA荧光定量检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 测序结果统计 |
| 4.2 small RNA长度分布统计 |
| 4.3 序列比对基因组比较 |
| 4.4 序列比对内含子和外显子 |
| 4.5 miRNA热图分析 |
| 4.6 miRNA差异表达分析 |
| 4.7 miRNA靶基因富集分析 |
| 4.8 差异基因表达量丰度分析 |
| 4.9 样本相关性分析 |
| 4.10 外泌体差异表达miRNAs实验验证 |
| 4.11 mRNA和miRNA数据关联分析 |
| 4.12 差异miRNA及靶基因mRNA在食管癌患者中生存率分析 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三部分 miR193参与食管癌顺铂化疗耐药的机制 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.3 引物信息 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 TFAP2C和miR193在食管癌细胞株中的表达 |
| 3.3 双萤光素酶报告基因检测 |
| 3.4 过表达细胞株构建 |
| 3.5 EdU检测食管癌细胞增殖 |
| 3.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.7 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.8 细胞克隆形成实验 |
| 3.9 Transwell实验 |
| 3.10 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 3.11 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 miR193在食管癌细胞中的表达 |
| 4.2 TFAP2C在不同细胞中的表达 |
| 4.3 细胞周期检测 |
| 4.4 细胞周期及耐药相关基因表达情况 |
| 4.5 双萤光素酶报告基因检测 |
| 4.6 EdU检测细胞增殖 |
| 4.7 TFAP2C与miR193对细胞周期的影响 |
| 4.8 克隆形成实验结果 |
| 4.9 细胞凋亡实验结果 |
| 4.10 细胞侵袭实验结果 |
| 4.11 ChIP检测TFAP2C调节P21 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四部分 裸鼠荷瘤验证miR193促进食管癌细胞耐药 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体与肿瘤研究的进展 |
| 参考文献 |
（9）DNAJA3和RNF5抑制口蹄疫病毒复制的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫病毒 |
| 1.1.1 口蹄疫病毒的结构和功能 |
| 1.1.2 FMDV抑制天然免疫的研究进展 |
| 1.1.3 FMDV与宿主互作及其调控机制的研究进展 |
| 1.2 热休克蛋白 |
| 1.2.1 主要热休克蛋白家族及其在免疫调节中的作用 |
| 1.2.2 热休克蛋白在病毒方面的相关研究 |
| 1.3 E3泛素连接酶 |
| 1.3.1 E3泛素连接酶在RIG-I信号通路中的研究进展 |
| 1.3.2 E3泛素连接酶在抗病毒中的研究进展 |
| 1.3.3 E3泛素连接酶RNF5的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 DNAJA3与VP1 互作抑制FMDV复制的机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 试剂和抗体 |
| 2.1.3 质粒构建 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 细胞转染 |
| 2.1.7 酵母双杂交技术 |
| 2.1.8 免疫共沉淀试验(Co-IP) |
| 2.1.9 共聚焦试验 |
| 2.1.10 用CRISPR/Cas9 系统构建DNAJA3 基因敲除的PK-15 细胞系 |
| 2.1.11 Western blotting分析 |
| 2.1.12 RNA的提取和反转录 |
| 2.1.13 蛋白酶体、溶酶体和凋亡通路抑制剂试验 |
| 2.1.14 RNA干扰试验 |
| 2.1.15 双荧光报告试验 |
| 2.1.16 病毒滴度测定 |
| 2.1.17 细胞活力测定 |
| 2.1.18 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.1.19 统计学分析 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 酵母双杂交筛选与VP1相互作用的宿主蛋白 |
| 2.2.2 酵母共转化验证DNAJA3与FMDV VP1 的相互作用 |
| 2.2.3 免疫共沉淀试验验证DNAJA3与FMDV VP1 的相互作用 |
| 2.2.4 激光共聚焦试验验证DNAJA3与FMDV VP1 的相互作用 |
| 2.2.5 DNAJA3与FMDV VP1 相互作用的区段筛选 |
| 2.2.6 VP1与DNAJA3 互作位点的筛选 |
| 2.2.7 VP1与DNAJA3 的内源性互作 |
| 2.2.8 VP1与DNAJA3 互作的关键位点 |
| 2.2.9 过表达DNAJA3对FMDV复制的影响 |
| 2.2.10 筛选沉默DNAJA3 效率最好的干扰RNA |
| 2.2.11 下调DNAJA3对FMDV复制的影响 |
| 2.2.12 DNAJA3在BHK-21和PK-15 细胞上对FMDV复制的影响 |
| 2.2.13 构建DNAJA3敲除细胞系 |
| 2.2.14 DNAJA3-KO细胞对FMDV复制的影响 |
| 2.2.15 DNAJA3对VP1 蛋白的影响 |
| 2.2.16 DNAJA3对FMDV其他蛋白的降解情况 |
| 2.2.17 DNAJA3对VP1 半衰期的影响 |
| 2.2.18 DNAJA3 降解VP1 的通路 |
| 2.2.19 细胞活力的检测 |
| 2.2.20 DNAJA3 降解VP1 的关键区域 |
| 2.2.21 DNAJA3对细胞自噬的影响 |
| 2.2.22 DNAJA3影响溶酶体通路的机制 |
| 2.2.23 DNAJA3与LC3 互作区段 |
| 2.2.24 DNAJA3诱导自噬溶酶体通路的关键区域 |
| 2.2.25 VP1对IFN-β信号通路的影响 |
| 2.2.26 VP1对IFN-β信号通路影响的机制 |
| 2.2.27 VP1对IRF3磷酸化的影响 |
| 2.2.28 VP1对IRF3二聚体的影响 |
| 2.2.29 VP1对IRF3核转移的影响 |
| 2.2.30 过表达DNAJA3在VP1对IFN-β信号通路中的作用 |
| 2.2.31 敲除DNAJA3在VP1对IFN-β信号通路中的作用 |
| 2.2.32 DNAJA3和VP1对IFN-β及其下游ISGs基因表达的影响 |
| 2.2.33 内源性DNAJA3对VP1 抑制IRF3 磷酸化的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 RNF5 抑制FMDV复制的机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞与病毒 |
| 3.1.2 试剂和抗体 |
| 3.1.3 质粒构建 |
| 3.1.4 溶液的配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.1.6 细胞转染 |
| 3.1.7 免疫共沉淀试验(Co-IP) |
| 3.1.8 共聚焦试验 |
| 3.1.9 Western blotting分析 |
| 3.1.10 RNA的提取和反转录 |
| 3.1.11 RNA干扰试验 |
| 3.1.12 病毒滴度测定 |
| 3.1.13 细胞活力测定 |
| 3.1.14 统计学分析 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 FMDV感染对RNF5 的影响 |
| 3.2.2 过表达RNF5对FMDV复制的影响 |
| 3.2.3 检测SiRNF5的干扰效果 |
| 3.2.4 下调RNF5对FMDV复制的影响 |
| 3.2.5 RNF5 E3 连接酶活性对FMDV复制的影响 |
| 3.2.6 RNF5对FMDV蛋白的影响 |
| 3.2.7 RNF5对VP1的影响 |
| 3.2.8 RNF5对VP1半衰期的影响 |
| 3.2.9 FMDV感染细胞中RNF5对VP1 病毒蛋白的影响 |
| 3.2.10 RNF5降解VP1的通路研究 |
| 3.2.11 RNF5降解VP1的机制研究 |
| 3.2.12 VP1与RNF5互作区段研究 |
| 3.2.13 VP1与RNF5的亚细胞定位 |
| 3.2.14 RNF5与FMDV VP1 内源性共定位情况 |
| 3.2.15 RNF5对VP1蛋白泛素化影响 |
| 3.2.16 RNF5 对微RNA病毒科其他病毒VP1 蛋白的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）DDX18负调控IFN-β产生的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 RNA解旋酶概述 |
| 1.2 DEAD-box RNA解旋酶 |
| 1.2.1 DEAD-box RNA解旋酶家族的结构和功能 |
| 1.2.2 DEAD-box RNA解旋酶与病毒的关系 |
| 1.2.3 DEAD-box RNA解旋酶与天然免疫的关系 |
| 第2章 研究目的和意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、毒株与菌株 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 工具酶及主要化学试剂 |
| 3.1.4 Western Blot实验材料 |
| 3.1.5 培养基及其配制 |
| 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制 |
| 3.1.7 主要实验仪器及设备 |
| 3.1.8 分子生物学及序列分析软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞总RNA的提取 |
| 3.2.2 cDNA的合成以及目的片段扩增 |
| 3.2.3 限制性内切酶酶切反应 |
| 3.2.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 3.2.5 PCR产物或酶切产物的回收与纯化 |
| 3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应 |
| 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.8 连接产物的转化 |
| 3.2.9 重组质粒的制备与鉴定 |
| 3.2.10 真核表达质粒构建 |
| 3.2.11 质粒的转染(脂质体介导的瞬时转染法) |
| 3.2.12 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.2.13 荧光定量PCR |
| 3.2.14 Western Blot与 Co-IP |
| 3.2.15 细胞核和细胞质蛋白抽提 |
| 3.2.16 银染检测分析 |
| 3.2.17 染色质免疫共沉淀 |
| 3.2.18 siRNA干扰实验 |
| 3.2.19 基因敲除细胞系的构建 |
| 3.2.20 统计学方法 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 细胞核内IRF3 的互作组学研究 |
| 4.2 DDX18与IRF3 互作的验证 |
| 4.3 DDX18 负调控IFN-β的产生 |
| 4.3.1 超表达DDX18 抑制IFN-β启动子激活 |
| 4.3.2 siRNA 干扰 DDX18 的表达上调 IFN-β 启动子激活 |
| 4.3.3 敲除DDX18 上调IFN-β启动子激活 |
| 4.4 DDX18 负调控IFN-β并不依赖于其解旋酶及ATP酶活性 |
| 4.4.1 DEAD-box家族成员基序对比及DDX18 酶活突变体构建 |
| 4.4.2 DDX18 酶活突变体的结构预测 |
| 4.4.3 DDX18 酶活突变体负调控IFN-β启动子激活 |
| 4.5 DDX18 负调控IFN-β产生的机制 |
| 4.5.1 DDX18 负调控IFN-β产生的靶点鉴定 |
| 4.5.2 DDX18 阻碍IRF3与IFN-β启动子结合 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 IFN-β调控蛋白的初步探索 |
| 5.1.2 DDX18 负调控IFN-β的研究 |
| 5.1.3 DDX18 负调控IFN-β不依赖于其解旋酶和ATP酶活性 |
| 5.1.4 DDX18 阻碍IRF3与IFN-β启动子结合 |
| 5.1.5 DDX18 负调控IFN-β的生物学意义 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、丙型肝炎病毒核蛋白与转录调节因子NFAT1C和YY1的结合位点分析（论文参考文献）
- [1]环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究[D]. 陈秦俊杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]肝细胞性肝癌（HCC）中线粒体转录延伸因子（TEFM）的表达及临床意义[D]. 李素芬. 大理大学, 2021
- [3]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [4]非致细胞病变牛病毒性腹泻病毒抑制Ⅰ型干扰素产生的分子机制探索[D]. 何延华. 石河子大学, 2020
- [5]猪圆环病毒的入核机制研究[D]. 周建卫. 浙江大学, 2020
- [6]中国药物作用靶点研究进展（Ⅰ）[J]. 江振洲,袁子航,孙丽新,吴启鹏,柴媛媛,李思佳,向婷,喻琼娜,朱英,张陆勇. 药学进展, 2020(06)
- [7]宿主蛋白SYNCRIP和MCM3在猪细小病毒复制过程中作用及机制研究[D]. 陈松彪. 西北农林科技大学, 2020
- [8]耐药细胞外泌体中miR193对食管癌细胞耐药作用及其机制[D]. 史世锋. 郑州大学, 2019(02)
- [9]DNAJA3和RNF5抑制口蹄疫病毒复制的机制[D]. 张伟. 中国农业科学院, 2019
- [10]DDX18负调控IFN-β产生的机制研究[D]. 王墨涵. 华中农业大学, 2019(02)