一、对流免疫电泳检测犬细小病毒免疫复合物中抗体的研究（论文文献综述）
胡瑞鸿[1]（2020）在《抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估》文中提出小鹅瘟（Gosling plague,GP）又称为鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病,是危害养鹅业的主要传染病。近年来,根据遗传进化分析,小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的毒力有增强趋势,给该病的防治带来更大的挑战。目前GP的特异性防治主要依赖接种卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）进行被动免疫,对GP强毒感染具有明显的防治效果。由于IgY具有价格低廉、防治效果好等优点,已被广大养鹅户接受和采用。但目前使用的IgY多为粗制抗体,缺乏统一的生产、检验标准,琼扩抗体效价高低不等,故研制一种纯度及效价高,防治效果好,有统一生产标准的GPV IgY势在必行。本研究从黑龙江省某地饲养的雏鹅群中,采集疑似GP病死鹅的病料,进行GPV的分离鉴定,利用分离获得的GPV研制抗GP的IgY,并对其质量进行评价,具体研究内容和方法如下:（1）GPV的分离鉴定用氯仿提取法从疑似GP病死鹅的肝、脾组织中分离病毒,接种3日龄雏鹅和12日龄鹅胚进行病毒分离;分离的病毒经特异性检验（琼脂扩散试验（AGP）和鹅胚中和试验）、超微结构观察、毒力测定、理化特性（热敏感试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、胰蛋白酶敏感试验、耐酸性试验）检验、纯净性试验、核酸检测、VP3基因序列鉴定及基因进化树分析,进行综合鉴定。（2）GPV IgY的研制将分离鉴定获得的GPV（命名为H株）,经鹅胚逐级传代至F10,F10代进行1000倍稀释,接种12日龄鹅胚,收获鹅胚液作为GPV灭活疫苗抗原,抗原无菌检验和毒力检测合格后,进行浓缩及灭活,通过接种12日龄鹅胚进行灭活检验;灭活检验合格后进行GPV灭活疫苗的配制及乳化,获得GPV灭活疫苗,对其进行物理性状、无菌检验及安全性检验;将检验合格的GPV灭活疫苗按经典免疫程序免疫产蛋鸡,当高免鸡蛋卵黄液的GPV IgY琼扩抗体效价≥1:64时,对其进行除脂、提取和灭活,制备出抗H株GPV IgY。（3）抗H株GPV IgY的质量评价通过监测GPV IgY的琼扩抗体效价对GPV IgY的理化特性（温度、酸碱度、胃蛋白酶的作用时间、冻融次数）进行评价;通过GPV IgY单次单剂量、重复单剂量和单次大剂量皮下注射3日龄雏鹅及小白鼠的安全性试验,观察雏鹅和小白鼠的健康状况,局部及全身反应情况对GPV IgY的安全性进行评价;通过不同琼扩抗体效价和不同剂量的GPV IgY对GPV强毒攻毒24 h雏鹅的治疗试验、对GPV感染不同时长和不同日龄雏鹅的治疗试验,依据雏鹅治愈率,对GPV IgY治疗效果进行评价;用不同琼扩抗体效价和不同免疫剂量的GPV IgY对雏鹅皮下接种,24 h后用GPV强毒攻毒,依据雏鹅保护率进行预防效果评价;同类产品免疫3日龄雏鹅,依据雏鹅保护率与治愈率,评价GPV IgY与同类产品的差异。通过物理性状、无菌检验、支原体检验、GPV IgY琼扩抗体效价监测及对雏鹅攻毒保护率监测,确定GPV IgY的储存温度和时间。试验结果表明:（1）GPV的分离鉴定结果分离的病毒接种雏鹅,呈现与GP一致的临床症状和病理剖检变化;接种鹅胚,可在鹅胚中增殖,且为非血凝性感染病毒;AGP显示,从雏鹅和鹅胚分离的病毒液与GP阳性血清之间出现沉淀线;鹅胚中和试验证明,病毒液能被GP阳性血清中和,中和后的病毒液接种鹅胚不引起死亡;电镜下观察,H株病毒粒子具有典型的细小病毒特征;H株鹅胚和雏鹅传代培养F6～F10代,毒价最高且稳定,病毒的ELD50和LD50分别大于10-5.0/0.2 m L和10-4.0/0.2m L;以分离到的H毒株分别接种3日龄、10日龄、20日龄雏鹅,其致病性随雏鹅日龄增大而减弱;分离的病毒在56℃3 h保持其感染性,能够抵抗乙醚、氯仿、胰蛋白酶和酸性条件（p H3.0）的作用;分离的病毒液细菌、支原体和外源病毒检查均为阴性,证明H株病毒纯净;PCR核酸检测病毒约在500 bp处出现特异性DNA条带,DNA大小与GPV相符;上述结果表明,分离的病毒符合GP生物学特性,该病毒为GPV（命名为H株）。以PCR扩增出的VP3基因,与参考毒株的VP3基因序列对比,核苷酸的同源性在95.9%～99.1%之间,氨基酸同源性为97.9%～99.6%之间;基因进化树分析表明,H株与在黑龙江省分离的SP、ZZ、ZD、DQ、JX等毒株亲缘关系较与GD（广东）、YG（扬州）等毒株近。（2）GPV IgY的制备结果GPV H株灭活疫苗抗原无菌检验呈阴性、鹅胚液ELD50为10-5.22/0.2 m L、灭活检验鹅胚全部健活。GPV灭活疫苗的物理性状、无菌检验、安全检验均合格。用该GPV灭活疫苗免疫产蛋鸡,收集AGP≥1:64高免鸡蛋的卵黄液。高免卵黄液经酸化水1:8稀释、p H5.2、4℃作用15 h、1900 g离心20 min条件下除脂;酸化水-1.5%辛酸-33%硫酸铵提取;终浓度0.05%甲醛溶液经20～25℃灭活24 h,对GPV IgY的琼扩抗体效价、蛋白浓度及蛋白纯度均无显着影响,确定上述除脂、提取和灭活条件为最佳工艺。（3）GPV IgY的质量评价结果上述制备的抗H株GPV IgY在60℃以下作用2 h,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比不降低,当温度达到70℃以上,琼扩抗体效价显着降低,当温度达到75℃作用30 min时,琼扩抗体效价呈阴性;p H范围在4.0～11.0时,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比差异不显着,p H值为3.0和12.0时,GPV IgY琼扩抗体效价显着低于对照组;当胃蛋白酶作用6 h,琼扩抗体效价无变化,作用8 h以上显着降低;GPV IgY经5次反复冻融,琼扩抗体效价与对照比无显着差异;GPV IgY免疫雏鹅和小白鼠均未出现任何注射局部和全身不良反应,精神状态良好,采食正常;GPV IgY对雏鹅治疗效果表明,琼扩抗体效价越高、注射剂量越大,雏鹅治愈率越高;病毒感染雏鹅的时间越长、雏鹅日龄越大,雏鹅治愈率越低;GPV IgY对雏鹅预防效果表明,同一注射剂量,琼扩抗体效价越高,雏鹅保护率越高,同一琼扩抗体效价,注射剂量增加,雏鹅保护率增高;GPV IgY免疫雏鹅后12 h～10 d,对雏鹅保护率高达88.00%以上,可有效抵抗病毒感染。差异对比试验表明,研制的GPV IgY的雏鹅保护率与治愈率均高于同类产品。（4）GPV IgY的储存条件2～8℃储存24个月,GPV IgY的物理性状、纯净性、琼扩抗体效价稳定,对雏鹅感染GPV的保护率达88.00%以上。（5）GPV IgY推荐使用剂量和方法对已感染GPV的雏鹅,选择GPV IgY琼扩抗体效价为1:16以上,1.0 m L/只;对未感染雏鹅进行紧急预防免疫,0.5 m L/只,皮下注射,对GPV感染的治愈率和保护率均达80.00%。
吴国桃[2]（2019）在《阿留申病毒VP2基因蛋白与标准病毒抗原CIEP法检测的比较分析》文中研究表明水貂阿留申病病毒（Aleutian mink disease virus,AMDV）引起的水貂浆细胞增多症对动物毛皮产业的发展构成威胁。中和抗AMDV抗体能够导致持续感染,但是不能抵抗AMDV强毒攻击。迄今为止,尚未制定预防或治愈这种疾病的具体方法。为了消除水貂的浆细胞增多症,抗体检测技术筛选AMDV阳性水貂已被广泛应用。本实验旨在摆脱繁琐的提纯工艺和昂贵的成本制备出重组蛋白抗原,为AMD的检测和AMD胶体金试纸的制备提供依据。本研究选用于凯硕士论文所建立的蛋白抗原制备方法,真核表达AMDV-G株的VP2全基因蛋白。纯化后,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示其分子量为76kDa;Western印迹显示具有反应原性。通过基因工程抗原和AMDV抗原CIEP法与PCR法三种方法进行对比试验,符合率结果分别是92.6%,94%,87.5%。在以上基础上对尚志市两个水貂养殖场临床4037份血清分别使用真核表达抗原和病毒抗原进行CIEP检测,结果显示符合率为93.85%,表明本实验制备的基因工程抗原可以作为临床对流免疫电泳法检测水貂阿留申病的检测抗原。
李全[3]（2017）在《犬瘟热病毒、犬细小病毒及狂犬病毒三联多表位重组蛋白的构建及其免疫效果研究》文中认为犬瘟热（Canine distemper）、犬细小病毒病（Canine parvovirus enteritis）和狂犬病（Rabies）是三种主要的在全球范围内传播的犬科、猫科动物疫病。目前针对三种疫病唯一有效的防控办法就是疫苗免疫接种,但目前在临床中使用的常规疫苗存在诸多不足之处。多表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制备的一种新型疫苗,因其安全性好、保护力强和应答类型可调控等特点,近年来备受关注。本研究的主要目的是构建CDV、CPV和RV的主要保护性抗原多表位重组蛋白,利用原核表达技术进行表达,并对其免疫原性进行研究。同时,也对新型免疫佐剂聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）的免疫增强效果进行了研究,为研制犬类CDV、CPV和RV病毒多表位重组疫苗奠定了基础。本研究通过对已报道的多个有价值的CDV、CPV和RV的T细胞和B细胞表位进行分析和评价,最终选择了 13个不同的表位用于构建多表位重组蛋白。包括CDV的2个B细胞表位,2个Th细胞表位及1个CTL细胞表位;CPV的2个B细胞表位及1个Th细胞表位;RV的2个B细胞表位,1个模拟空间B细胞表位,2个Th细胞表位及1个CTL细胞表位。各候选表位按照一定规则排列后通过连接子GGGGS或KK连接以保持各表位的独立构象。对这些重组蛋白序列的亲水性、抗原性、折叠性、表面可及性、二级结构和三级结构等进行预测分析,最终优选出6个不易形成二级结构、不易组成新表位的重组蛋白序列rP1、rP2、rP3、rP4、rP5和rP6。编码这6个蛋白的基因序列经密码子优化后进行全基因合成,再克隆至原核表达载体上,其中rP1、rP2和rP3克隆到pET-28a（+）,rP4、rP5和rP6克隆到pET-30a（+）上。SDS-PAGE检测结果表明,上述重组质粒转化的BL-21（DE3）经IPTG诱导后均以包涵体的形式表达。Western blotting试验结果证明,经镍柱纯化及蛋白复性操作,成功获得了 6个含有His标签的高纯度重组蛋白。6个重组蛋白和三个灭活病毒经弗氏佐剂乳化后免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,三免后14天采血制备鼠源多抗血清。ELISA和Western blotting试验结果显示,6个蛋白能够与各自免疫后的抗血清发生反应;同时也能和上述三种灭活病毒发生反应,证明这6个重组蛋白均具有较好的免疫原性。同时,ELISA和Western blotting结果还显示,3个灭活病毒免疫小鼠制备得到的抗血清也能与6个蛋白分别反应,即灭活病毒刺激机体产生的抗体能够与6个重组蛋白反应,这表明重组蛋白中的B表位也能够产生相应的抗体。抗体中和试验、血凝抑制（Hemagglutinationinhibition,HI）试验和快速免疫荧光灶抑制试验（Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT）证明6个重组蛋白均能同时诱发小鼠产生针对CDV、CPV和RV的中和抗体。然而与CDV、CPV灭活病毒及RV的商业化疫苗组相比,6个重组蛋白产生的中和抗体的效价较低,具有明显的统计学差异。比较6个重组蛋白在小鼠中诱导产生中和抗体的效价,结果显示相对于其他4个蛋白,rP1和rP4能够产生更高效价的中和抗体,但rP1和rP4组之间无显着差异。为了研究不同佐剂对重组蛋白免疫增强效果的差异,本研究以rP4为免疫原分别与PEI佐剂、PEI + CpG佐剂、CpG佐剂、弗氏佐剂及铝佐剂配伍,免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,以不加佐剂组为对照。在3免后第2、4、6和8周采血制备鼠源多抗血清。ELISA检测不同时期抗血清中特异性抗体的滴度,结果表明五种佐剂均能增强rP4诱导小鼠产生特异性抗体的能力与不使用佐剂组相比差异极显着。免疫增强效果为:弗氏佐剂>PEI + CpG>PEI>铝佐剂>CpG。各佐剂组特异性抗体均持续8周不消减,而不加佐剂组在第8周时降低。ELISA分别检测不同组3免后第2周抗血清中IgG1和IgG2a抗体亚型并计算其比值。通过比值分析可知,弗氏佐剂倾向于协助rP4诱导产生细胞免疫,铝佐剂倾向于协助rP4诱导产生体液免疫,而PEI倾向于诱导rP4产生平衡的体液免疫与细胞免疫,与CpG联用时,PEI协助rP4诱导的免疫反应向细胞免疫倾斜。综上所述,本课题首次成功构建、表达和纯化出了 6个含有CDV、CPV和RV病毒B细胞表位和T细胞表位的重组表位蛋白,这6个蛋白均具有良好的免疫原性,可同时诱导小鼠产生针对三种病毒的中和抗体。同时本研究还证明,PEI+CpG作为多表位重组蛋白的佐剂具有很强的免疫增强作用。上述研究结果为CDV、CPV和RV病毒多表位重组疫苗的研究奠定了坚实基础。
王元智[4]（2017）在《水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用》文中认为水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease,AD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus,ADV）感染引起的一种以浆细胞弥漫性增生和持续性病毒血症为特征的慢性传染性疾病。ADV属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）、阿留申病毒属（Amdovirus）。ADV主要侵害水貂的免疫系统,不仅可导致幼貂大量死亡,还将严重影响成年貂的繁殖力与毛皮质量,给养殖户造成巨大的经济损失,是危害世界水貂养殖业健康发展的重要疫病之一。目前该病既无有效的疫苗,也无特异性的治疗药物,主要防控手段是通过检疫淘汰策略净化种群。因此,建立一种敏感、特异、稳定并且适用于基层样品大规模筛查的诊断方法势在必行。本研究从发病水貂的肝脏组织内分离到一株高致病性ADV,将其命名为ADV-HRB,并完成了该毒株全基因组序列的测定,为ADV的深入研究奠定基础。通过原核表达系统表达了ADV重组VP2蛋白,以此蛋白作为免疫原制备抗ADV的单克隆抗体（Monoclonal antibody,MAb）和兔源多克隆抗体（Polyclonal antibody,PAb）,建立了检测ADV抗原的双抗体夹心ELISA（Double-antibody sandwich ELIS,DAS-ELISA）方法,为基层样品的大规模筛查提供技术支持。具体研究结果如下:1.ADV的分离与鉴定用PCR方法对黑龙江省内的部分水貂养殖场进行抽检,将阳性貂的部分组织加入PBS后研磨,组织研磨液上清除菌后接入CRFK细胞,盲传5代,PCR方法可在每代培养物中检测到病毒,负染后在电镜下可观察到病毒粒子,分离毒株感染BALB/c小鼠后,可在心、肝、脾、肺、肾、肠组织及血清中检测到病毒存在。结果证明分离获得的毒株为ADV强毒株,将其命名为ADV-HRB。2.ADV分离株全序列测定设计多对引物,对ADV-HRB分离株的全基因组进行扩增、克隆、测序与分析,得到了完整的基因组序列,全长4810 bp。通过与国内外分离株的同源比对发现与ADV-BJ株的相似性最高,为探究ADV体外复制与致病性的研究提供了基础。3.ADV重组VP2蛋白的原核表达根据GenBank上已经公布的ADV全序列（JN040434.1）,合成VP2高免疫活性区基因并连接pET-30a（+）载体,重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了融合表达的ADV-VP2包涵体蛋白。将带有His标签的VP2蛋白通过镍柱进行纯化后,采用缓慢透析法复性,Western Blot分析结果表明该蛋白可与ADV阳性血清产生良好的免疫反应。4.ADV单克隆抗体与兔源多克隆抗体的制备利用经过纯化、复性的VP2重组蛋白免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔。取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选获得了1株IgG亚型的单抗1G5。单抗与兔多抗血清采用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化后,间接ELISA方法检测其效价均在105以上,间接免疫荧光试验（IFA）证明两种抗体和ADV具有良好的免疫反应。5.ADV抗原表位的鉴定将VP2蛋白截短表达为6段,采用Western Blot的方法确定单抗抗原表位的大致范围,再利用合成肽的方法对抗原表位进行精确定位。初步确定单抗1G5识别的线性表位区域为460EEEGWPAASGTHFED474。6.ADV双抗体夹心ELISA检测方法的建立与初步应用以纯化的MAb作为包被抗体,PAb作为检测抗体,棋盘滴定法确定最佳工作浓度分别为10μg/mL和8μg/mL,通过对反应条件的一系列优化,最终建立了ADV的DAS-ELISA检测方法。该方法与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、水貂肠炎病毒均无交叉反应,敏感度2μg/mL,批间、批内变异系数小于10%。利用该方法和PCR方法平行检测102份临床样品,符合率达96.875%。说明该方法具有敏感、特异、稳定、简便等优点,适用于基层进行大规模病原检测。
刘东旭[5]（2016）在《水貂阿留申病毒的分离鉴定和五种核酸疫苗的构建及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理水貂阿留申病（Aleutian disease,AD）,是由水貂阿留申病毒（Aleutian disease virus,ADV）引起的水貂免疫系统紊乱,同时并发自身免疫系统混乱的一种慢性、传染性病毒疾病,又称为浆细胞增多症。水貂阿留申病因其独特的致病机理和免疫机理,造成水貂阿留申病的免疫预防成为世界性的难题,至今尚未研制出有效的疫苗,给水貂养殖业造成巨大的经济损失。为此,本研究在对我国水貂阿留申病毒流行株分离鉴定的基础上,对分离毒株进行全基因组测序分析;筛选候选毒株,对其关键位点进行定点突变,构建全基因突变核酸疫苗;在实验室前期工作的基础上,构建ADV NS1全长基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全长基因和ADV VP2截短基因四种核酸疫苗;将构建的五种核酸疫苗免疫小鼠和本动物水貂,系统的监测所构建核酸疫苗的免疫原性,并分析ADV NS1全长基因核酸疫苗与ADV VP2全长基因核酸疫苗相互作用免疫效果。本论文将为破解水貂阿留申病尚无有效防制疫苗的难题,做出有益的探索。对采自我国疑似阿留申病而死的水貂内脏进行病毒分离,通过PCR鉴定及动物回归实验,确定共获得5株水貂阿留申病毒分离株,分别命名为ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3;应用免疫过氧化物酶单层细胞实验对所分离的ADV进行检测及TCID50测定。结果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的TCID50分别为105.7 TCID50/ml、105.0 TCID50/ml、104.6 TCID50/ml、105.2TCID50/ml和104.1 TCID50/ml;根据Genbank上公布的不同ADV毒株基因序列,设计并合成12对引物,对所分离的病毒进行全基因扩增和测序。结果表明:ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-JL3、ADV-QD2和ADV-QD3的基因组全长分别为4476bp、4538bp、4572bp、4569bp和4566bp;将分离毒株与ADV参考毒株以及细小病毒亚科各属代表种的全基因序列进行核苷酸序列分析及同源性比较。结果表明:ADV-QD3株与ADV-SL3株同源性最低,为92.8%。ADV-JL3株与ADV-U株同源性最高,为96.8%。对病毒分离鉴定和动物回归实验的结果进行综合分析,选取毒力较强的ADV-DL125株为候选毒株;应用重叠延伸PCR技术,定点突变ADV-DL125株VP2基因352、395和534位点的氨基酸,构建全基因突变核酸疫苗pcDNA3.1-ADV;同时,构建ADV NS1全长基因、ADV NS1截短基因、ADV VP2全长基因和ADV VP2截短基因四种核酸疫苗;通过间接免疫荧光及Western-blot实验,验证本实验所构建的五种核酸疫苗具有良好的反应原性;将构建的五种核酸疫苗免疫小鼠,通过检测小鼠体液免疫水平和细胞免疫水平的变化,表明构建的五种核酸疫苗能够刺激机体产生显着体液免疫反应,同时能够增强机体的细胞免疫应答水平。将构建的五种核酸疫苗及pcDNA3.1-NS1与pcDNA3.1-VP2核酸疫苗相互作用免疫水貂,并在ADV攻毒后,每隔14天监测水貂血清中γ球蛋白含量及外周血淋巴细胞中CD8+细胞含量。结果表明:与PBS空白对照组相比,构建的核酸疫苗pcDNA3.1-ADV及pcDNA3.1-VP2+NS1免疫后的水貂,能够引起机体产生ADV抗体,且外周血淋巴细胞中CD8+细胞含量较低。在ADV感染机体后,该两组血清中γ球蛋白及抗原抗体复合物的含量相较于其他各个实验组最低,表现出了良好的疫苗潜质。
贾赟[6]（2016）在《水貂阿留申病毒（ADV）VP2蛋白体外表达与检测技术应用研究》文中提出水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease,AD）是具有自主复制能力的水貂阿留申病病毒（Aleutian Mink Disease virus,ADV）引起水貂的一种消耗性、慢性传染病。病毒主要侵害水貂免疫系统,导致机体免疫系统紊乱并继发多器官衰竭,主要特征是终身呈病毒血症、肾小球肾炎、动脉炎、肝炎、易引发细菌感染等临床表现。该病几乎存在于世界上所有野生、人工养殖的水貂种群,抗体阳性率为20%30%。严重影响水貂种群的国际贸易和经济性状,对世界水貂养殖业造成了极大的经济损失。本研究从辽宁地区发病水貂养殖场成功分离鉴定了ADV地方强毒株ADV-LN株,对其完成VP2全长基因的扩增和序列分析;并以ADV-LN株为实验材料在国内首次完成了对其VP2蛋白的毕赤酵母表达,利用ADV VP2重组蛋白作为检测抗原,建立了间接ELISA方法检测ADV抗体;成功建立了Taq Man-MGB荧光定量PCR、LAMP、PCR-DHPLC三种检测方法并应用于临床检测;获得的毕赤酵母表达蛋白和系列检测技术的建立为该病的检疫、防治、控制奠定了重要基础。具体研究内容分为如下6个部分:1、水貂阿留申病毒ADV-LN强毒株的分离鉴定及其VP2基因的进化分析:对辽宁地区水貂养殖场用CIEP方法进行筛选淘汰AD阳性水貂时,剖检采集阳性水貂临床组织样品（肝、脾、肾、淋巴结等）,通过制备组织冷冻切片电镜观察,无菌研磨处理病变组织,经接种猫肾细胞（CRFK）,不产生CPE,盲传6代后通过PCR鉴定证明获得ADV,经动物回归试验,实验接种组第38天,出现染病死亡1只,剩余水貂在第50天后,均出现拒食、神经症状、抽搐、步履蹒跚、喜卧不喜动等AD感染典型症状,证明分离到的ADV株为强毒株,命名为ADV-LN株。其后设计引物扩增了ADV-LN株的全长VP2基因,连接p MD18-T载体构建成功克隆质粒p MD18-T-VP2,测序后经过对VP2基因序列分析后证实ADV-LN株和国内外强毒株（ADV-Utah1和ADV-BEIJING株）亲缘关系近,和弱毒株（ADV-G）亲缘关系远。2、ADV VP2蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达及免疫源性鉴定:通过对ADV LN株VP2基因进行了毕赤酵母偏好密码子优化后全基因合成,通过系列分子生物学技术,成攻构建阳性重组菌株X-33/p PICZαA-VP2-opt,使ADV VP2基因成功在毕赤酵母系统中分泌表达,表达量达到总蛋白含量的78%,属于高效表达;SDS-PAGE证实,表达的VP2蛋白比理论上的73KD偏大,约有90KD,但应用ADV阳性血清对重组蛋白进行Western-blot、间接ELISA试验进行免疫原性鉴定后证实,VP2重组蛋白能够和ADV阳性血清有效结合,免疫原性良好。进而对VP2蛋白基因进行氨基酸位点分析发现,其内含有7个N-糖基化位点,推测重组VP2外源蛋白比理论分子量大的原因是氨基酸翻译后被N-糖基化修饰后的结果,通过对VP2重组蛋白进行去糖链试验,显示去糖链后的VP2蛋白条带接近理论分子量73 k D也证明了这点。获得具有真核表达修饰后的VP2重组蛋白意义重大,为ADV基因工程疫苗的研制奠定了基础。3、基于VP2重组蛋白建立检测ADV抗体的间接ELISA方法:基于具有良好免疫原性的ADV-VP2酵母表达重组蛋白,成功建立了检测ADV抗体的间接ELISA方法,通过优化系列ELISA反应条件（血清稀释液和血清稀释度、抗原包被浓度、抗原包被条件、封闭液种类和封闭时间、、血清作用时间、酶标二抗作用时间、底物显色时间）,建立了ELISA的最佳反应程序,并通过特异性、敏感性和重复性试验证明本试验建立ELISA方法的可行性,应用本试验建立ELISA方法和CIEP同时检测285份血清样品,两者符合率为95.7%,证明该ELISA方法可特异、灵敏的检测ADV抗体。4、水貂阿留申病毒（ADV）Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用:参照Gen Bank上已发表的ADV-G毒株序列,基于设计的特异性引物和探针,成功建立了一种用于检测ADV的Taq Man-MGB荧光定量PCR方法,具有特异性强,敏感性高,可快速定量的特点,该方法对ADV的检测限是10拷贝/μL,和普通PCR比较灵敏性提高了100倍。应用本研究建立的Taq Man-MGB荧光定量PCR方法检测了40份临床样品,阳性率分别为52.5%（21/40）,较普通PCR的45%（18/40）提高了7.5%的检出率。本方法的研制为ADV的快速诊断提供了重要储备检测方法。5、水貂阿留申病毒（ADV）环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立和初步应用:参照Gen Bank上已发表的ADV毒株VP2基因序列,针对VP2基因保守区域设计了3对LAMP技术扩增引物,通过对系列实验条件（反应时间、反应温度）进行优化,建立了检测ADV的LAMP检测方法。应用建立的LAMP检测方法,进行了特异性试验和灵敏性试验,在特异性试验中,与CPV、PPV、CEV、CDV等病毒都无交叉反应;进行灵敏性试验时,LAMP的检测限为10拷贝/μL,与荧光定量PCR的检测限相当,比PCR高10倍。在对126份水貂临床样品检测时,LAMP、定量PCR方法阳性检出率为48.4%（61/126）,高于普通PCR方法的44.4%（61/126）。该LAMP检测技术为AD的临床诊断与流行病学调查的又提供了一种现场检验方法。6、水貂阿留申病毒（ADV）PCR-DHPLC检测方法的建立及初步应用:参照Gen Bank上已发表的ADV VP2基因序列,设计一对特异性引物,经过对DHPLC各种反应条件的优化,成功建立了一种针对ADV检测的PCR-DHPLC诊断方法,最低检测限为10拷贝/反应,和荧光定量PCR方法的检测限相当,比PCR电泳法高10倍。应用本研究建立的ADV PCR-DHPLC方法检测126份临床样品,检出率为48.4%,高于普通PCR电泳法的检出率,PCR-DHPLC方法检测ADV的成功研制为以后对该病的检测提供了简便、高通量的检测技术储备。
韩铠怿[7]（2016）在《水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用》文中指出近年来,受市场需求的刺激,水貂养殖业迅猛发展。山东也成为了我国水貂的养殖大省。但是,随着水貂养殖规模的不断扩大,一些疫病也成为了制约水貂养殖业发展的重要因素。水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease,AD）,作为毛皮动物三大疫病之一（阿留申病、病毒性肠炎、犬瘟热）（李艳伍等.,2009）,会造成水貂的毛皮质量的下降,对养殖业造成巨大经济损失。但是,目前,还没有专门的药物或者疫苗来防治此病,只能通过检疫淘汰病貂达到对貂群的净化。因此,研究水貂阿留申病毒（Aleutian mink disease virus,ADV）在山东地区的分子生物学特点,建立一种特异性的检测方法具有重要意义。在2014-2015年间,本实验室对检测到的患水貂阿留申病的水貂脏器进行研磨,将研磨液接种到猫肾细胞（CRFK）中分离培养。当细胞出现稳定的病变后,提取细胞DNA进行PCR检测,结果呈现阿留申阳性。将扩增的序列进行测序,与参考序列ADV-G比对后,核苷酸同源性达到92.6%。但是,随着病毒传代次数的增加,细胞病变逐渐消失,PCR检测呈现阴性。说明该病毒不能在猫肾细胞中稳定传代。同时,我们对从山东省诸城某水貂养殖场采集的134份水貂实质器官进行检测,发现有37株呈现水貂阿留申病阳性,阳性率达到27.6%。对37株水貂阿留申病毒进行VP2基因的扩增并进行序列测定。用生物软件分析后发现,37株测序株间VP2基因核苷酸相似性为88%-99.8%,与GenBank中参考序列的相似性为88.0%-100%。并且,我们观察到:山东地区水貂阿留申病毒VP2基因存在大量的突变位点。将测序株与参考株经进化树分析后,分成5个分支（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）。VP2基因进化树显示89%的国内毒株处在进化树的第Ⅰ和第Ⅴ分支,而这两个分支不包含国外毒株。其中,有78.4%的毒株处在第Ⅰ分支。余下的11%的国内毒株则与其他国外毒株有较近的亲缘关系。这说明我国水貂阿留申病毒已经有别于国外毒株,形成了自己的独立进化支。由于大多数分离到的毒株处于第Ⅰ分支,我们暂且认为可能山东地区的毒株在向第Ⅰ分支进化的趋势。这对找出本地区流行的水貂阿留申病毒的标准毒株,以便进行对该病的检测提供科学依据。为了进一步研究分离到的37株病毒VP2基因的分子特征,用DNASTAR软件分别推导出各基因片段的氨基酸序列,并与参考毒株进行比较分析。结果发现:测序株间氨基酸的相似性为89.2%-99.7%,与参考序列间的相似性87.7%-100%。纵观VP2的整个氨基酸序列中,突变较多,有超过100多个氨基酸的突变。突变较集中的区域有三个,其中包括免疫反应区VP2:429-524。有14个突变位点只存在于中国毒株。其中,位点204:V-I、305:K-T、308:T-S、419:L-I、436:I-M的突变,突变毒株超过10个。419:L-I、436:N-D两个突变存在于VP2:428-446区域,而该区域可能影响水貂阿留申病毒的宿主范围的选择（McKenna et al.,1999）。对于其它几个频率较高的突变,我们目前还没有确切的研究来表明它突变的意义。其次,本实验室针对VP2序列的高免疫反应区（430-525）进行原核表达,并建立了间接ELISA检测方法。将扩增出的序列与pET-32a原核表达载体连接,在大肠杆菌BL21中进行表达。当诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L,在37℃诱导4h的表达量最高。表达蛋白经Western blot检测后具有良好的反应原性。将纯化蛋白包被酶标板,通过优化条件,建立了间接ELISA检测方法。用建立好的方法对84份送检的血清样本进行检测,检出率为26.2%。
张卓[8]（2015）在《水貂阿留申病毒分离鉴定及其致病性研究和诊断方法的建立》文中研究指明水貂阿留申病（Aleutian Disease,AD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease virus,AMDV）引起的水貂慢性进行性疾病。水貂感染AMDV后主要症状为:采食下降、被毛粗乱、母貂空怀、流产或死胎,公貂出现生殖能力下降,少数出现急性死亡。该病与水貂病毒性肠炎、水貂犬瘟热并称为影响水貂健康的三大疫病,AD给养貂业造成了严重的经济损失,目前,在世界范围内的水貂养殖地区均可见AD的发生。多年来世界各地养殖水貂国家的科研机构一直努力开展疫苗研发工作,但因各种原因,始终未见成效。由于一直没有有效的预防手段,使得AD得以迅速蔓延,当前控制该病的最有效方法为:定期检疫、淘汰阳性水貂、逐步净化种群、建立无疫病养殖场。研究表明,我国貂群的AD血清学阳性率高达80%,因而有针对性的分离、鉴定我国流行毒株,研究病毒基因组进化规律以及病毒的致病特性,建立健全适合的检测方法,将有利于我国开展AD的诊断、防治、净化。本研究主要包括以下4个部分:（1）AMDV的分离鉴定及基因组进化分析采集黑龙江某水貂场经对流免疫电泳（counter immune electrophoresis,CIEP）检测为AD阳性,且临诊症状明显的水貂肝脏、脾脏。组织通过研磨处理后接种猫肾细胞（CRFK）以进行AMDV的分离。利用病毒形态学及分子生物学手段确认自发病动物体内成功分离到一株AMDV,命名为AMDV-HLJ。提取病毒基因组,PCR方法扩增相应片段,经过拼接,获得了部分NS1基因序列以及全部的VP2基因序列。遗传进化分析表明,AMDV-HLJ可能与国内分离株LN1/LN2株由相同的祖先病毒进化而来。通过对VP2蛋白中和性抗原结构域的研究发现,AMDV-HLJ株在两个中和性抗原优势区的5个位点存在氨基酸突变,但这些突变并未影响病毒的抗原性及致病性。（2）病毒分离株致病性分析将分离的病毒AMDV-HLJ感染健康水貂,通过临诊症状、剖检的眼观病变、脏器的病理学损伤以及病毒基因组的原位杂交等试验手段研究AMDV-HLJ株对水貂的致病机制。结果表明,AMDV-HLJ可导致水貂的严重发病,甚至死亡。病毒感染水貂后,其呈现多器官损伤;在组织病理学层面,病毒感染水貂的神经系统、呼吸系统、免疫系统、消化系统、泌尿系统和生殖系统相应器官均可出现典型的病毒感染病变,该结果进一步表明,AMDV的感染可能会诱发细菌的继发感染;组织原位杂交实验表明,AMDV不仅仅存在于单核-巨噬细胞系统中,在睾丸生精细胞、II型肺泡上皮细胞、小脑浦肯野细胞内均可检测到病毒核酸,上述结果均表明,AMDV可在感染机体的多种器官内的不同细胞复制,其可能利用多种致病机制损伤被其感染的宿主。（3）水貂阿留申病CIEP检测方法的建立CIEP作为一种简便易行的AD血清学检测方法,一直以来以其准确、高效、成本低等优势作为AD抗体检测通用手段。但我国AD的CIEP检测一直以来严重依赖进口抗原,国产抗原也是源于进口毒株,其与本地流行毒株抗原性差距较大。本实验利用AMDV-HLJ分离株进行CIEP抗原制备,优化制备流程,在不影响特异性和敏感性的前提下提高产出量。研究表明,基于分离毒株制备的CIEP抗原具有良好的特异性和敏感性,可应用于日常的实验室或者现地AMDV抗体检测。（4）可视化环介导等温扩增（LAMP）检测AMDV方法的建立在日常生产中,分子水平的AMDV检测与血清学检测手段互为补充。本研究成功建立了简单、高效、敏感、经济的AMDV LAMP检测方法。研究表明,利用设计的6条引物能够有效扩增AMDV基因组,LAMP反应在65°C 45min条件下达到扩增产物的最大量值;敏感性试验表明,LAMP方法比传统的PCR方法敏感100倍,且检测结果可直接用肉眼观察、判定,而不需要其他特殊的仪器装置。利用该方法对现地样品的检测表明其适用于日常AMDV的分子检测。目前国内对于AD及AMDV的研究相对较少,本研究以国内流行毒株为研究切入点,分别从病毒进化、致病机制及诊断方法三个层面探讨中国AMDV分离株的生物学特性,为我国的AD防控起到积极作用。
黄盼盼[9]（2015）在《水貂阿留申病检测抗原的制备及间接ELISA检测方法的建立》文中指出水貂阿留申病（Aleutian disease，AD）是由水貂阿留申病毒（Aleutian diseasevirus，ADV）引起的自身免疫性、传染性疾病，水貂感染ADV产生的抗体不但不能有效清除病毒，反而通过Fc受体介导的抗体依赖性增强作用（AntibodyDependent Enhancement, ADE）使病毒感染增强，导致水貂免疫系统功能紊乱。该病不仅导致貂群的繁殖能力下降，而且在一定程度上能引起水貂死亡，给养貂业带来了巨大的经济损失，也严重阻碍我国毛皮动物养殖业发展。目前尚无有效疫苗治疗该病，因此国内外主要通过抗体检测技术如对流免疫电泳（Counterimmune electrophoresis，CIEP）、酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）筛选并淘汰阳性水貂，从而控制和净化该病。本研究目的在于建立有效的水貂阿留申病间接ELISA检测方法。以水貂阿留申病美国株ADV-G结构蛋白VP2为主要参考，通过B细胞抗原表位预测和保守序列筛选，获得保守性高的优势B细胞抗原表位SD序列。通过大肠杆菌表达系统诱导表达，获得了可溶性SD蛋白，大小为20KDa。表达产物经镍柱纯化、超滤管浓缩后获得高纯度、高浓度的SD蛋白。Western Blot分析结果显示，SD蛋白具有良好的反应原性。将该蛋白作为CIEP检测抗原与商业CIEP抗原蛋白同时检测水貂血清，达到一致的检测结果。将获得的抗原SD蛋白和三氨丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane，APTES）共同包被建立间接ELISA检测方法。通过方阵滴定法，摸索抗原SD蛋白和APTES的包被浓度，并摸索了包被和封闭时间，以及一抗和二抗的稀释度，最终确定包被的抗原SD蛋白和APTES的浓度分别为10ug/mL和1%，一抗稀释度为1:100，二抗稀释度为1:3000，其中与传统间接ELISA比较，包被时间、封闭时间均缩短为30min。特异性试验表明建立的该方法的SD蛋白仅能被水貂阿留申病毒抗体识别，而与犬细小病毒、伪狂犬病毒、犬瘟热病毒、水貂肠炎病毒的阳性血清和水貂阿留申病阴性血清均无交叉反应；敏感性试验表明建立的该方法的敏感性高于CIEP；重复性试验表明批内重复性和批间重复性的变异系数分别为0.612%5.956%和0.135%7.614%，均小于10%；临床样品检测结果与CIEP检测结果的符合率为93.2%。通过以上实验得出结论：本实验中通过设计获得的全新的人工抗原SD蛋白具有良好的反应原性和作为检测抗原的能力。将SD蛋白作为包被抗原蛋白建立的间接ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、重复性好、高效快捷的特点，且与CIEP检测方法比较具有较高的符合率。本研究不仅为常用检测方法CIEP提供更合适的基因工程抗原蛋白，也为开发检测水貂阿留申病的ELISA试剂盒及全自动ELISA检测方法提供基础研究。
徐钰,刘剑郁,解林红,彭鹏[10]（2013）在《犬细小病毒诊断与防制研究进展》文中进行了进一步梳理犬细小病毒是严重危害野生动物驯养繁殖产业的重要病毒性传染病之一,具有感染高、发病急、病程短和死亡率高等特点,且随着病毒的不断变异,其宿主范围不断扩大,除感染狐狸、犬、狼等犬科动物外,还能感染猫、豹、熊、虎和果子狸等其它多种动物,对我国的野生动物保护、驯养繁殖和疫源疫病监测工作的影响越来越大。本文对犬细小病毒的诊断及其防制进行了概述,以期为野生动物感染犬细小病毒的防控提供科学依据。
二、对流免疫电泳检测犬细小病毒免疫复合物中抗体的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、对流免疫电泳检测犬细小病毒免疫复合物中抗体的研究（论文提纲范文）
（1）抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小鹅瘟病毒研究现状 |
| 1.1.1 小鹅瘟病毒及小鹅瘟病简介 |
| 1.1.2 小鹅瘟病毒的鉴定方法 |
| 1.2 小鹅瘟生物制剂研究进展 |
| 1.2.1 小鹅瘟病毒活疫苗 |
| 1.2.2 小鹅瘟病毒灭活疫苗 |
| 1.2.3 小鹅瘟病毒基因疫苗 |
| 1.2.4 小鹅瘟病毒重组活载体疫苗 |
| 1.2.5 小鹅瘟抗血清 |
| 1.2.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体 |
| 1.3 卵黄抗体的研究进展 |
| 1.3.1 卵黄抗体的结构特点 |
| 1.3.2 卵黄抗体的提取方法 |
| 1.3.3 卵黄抗体的灭活方法 |
| 1.3.4 卵黄抗体应用 |
| 1.3.5 卵黄抗体的优势与展望 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要材料和试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 研究技术路线图 |
| 2.3.2 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 2.3.3 小鹅瘟病毒的鉴定 |
| 2.3.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备及检验 |
| 2.3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体质量评价 |
| 2.3.7 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 2.4 试验数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 3.1.1 小鹅瘟病毒在雏鹅分离培养结果 |
| 3.1.2 小鹅瘟病毒在鹅胚分离培养结果 |
| 3.2 小鹅瘟病毒鉴定 |
| 3.2.1 小鹅瘟病毒特异性试验结果 |
| 3.2.2 小鹅瘟病毒粒子超微结构观察结果 |
| 3.2.3 小鹅瘟病毒毒力测定 |
| 3.2.4 小鹅瘟病毒理化特性 |
| 3.2.5 小鹅瘟病毒的纯净性试验结果 |
| 3.2.6 小鹅瘟病毒核酸检测结果 |
| 3.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因序列鉴定 |
| 3.3 小鹅瘟病毒灭活疫苗抗原的制备及成品检验 |
| 3.3.1 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗制备抗原用病毒的检验 |
| 3.3.2 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗检验 |
| 3.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 3.4.1 产蛋鸡选择结果 |
| 3.4.2 高免鸡蛋的琼扩抗体效价监测结果 |
| 3.4.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定 |
| 3.4.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的确定 |
| 3.4.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体外源性病毒灭活方法确定 |
| 3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 3.5.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体的理化特性 |
| 3.5.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体的安全性评价 |
| 3.5.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体对人工感染雏鹅的治疗效果评价 |
| 3.5.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体对雏鹅注射后攻毒的预防效果评价 |
| 3.5.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体与试验选用的同类产品差异试验 |
| 3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 3.6.1 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体物理性状的影响 |
| 3.6.2 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体纯净性的影响 |
| 3.6.3 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体琼扩抗体效价的影响 |
| 3.6.4 储存温度及时间对雏鹅攻毒预防效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鹅瘟病毒的分离鉴定及生物学特性分析 |
| 4.2 小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析 |
| 4.3 影响HA与HI效果的因素分析 |
| 4.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.5 鸡群的选择管理与高免蛋黄收集 |
| 4.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定及主要影响因素分析 |
| 4.7 最优小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法确定及分析 |
| 4.7.1 辛酸终浓度对小鹅瘟病毒卵黄抗体的影响 |
| 4.7.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的对比分析及验证 |
| 4.7.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价与蛋白浓度的相关性分析 |
| 4.8 小鹅瘟病毒卵黄抗体灭活条件的确定 |
| 4.9 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 4.9.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体安全性评价 |
| 4.9.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果评价 |
| 4.9.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的预防效果评价 |
| 4.9.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体试验选用的同类产品差异 |
| 4.10 储存条件的确定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
（2）阿留申病毒VP2基因蛋白与标准病毒抗原CIEP法检测的比较分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 水貂阿留申病概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 AMD流行病 |
| 1.3 AMD的临床表现及病理解剖变化 |
| 1.4 AMD的病理组织学变化 |
| 1.5 发病机理 |
| 1.6 AMD的防治 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 第二章 水貂阿留申病检测技术及诊断抗原研究概述 |
| 2.1 病原学诊断 |
| 2.2 血清学诊断 |
| 2.3 分子生物学诊断 |
| 2.4 水貂阿留申诊断抗原的研究 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第三章 阿留申病毒VP2 基因蛋白与标准病毒抗原CIEP法检测的比较分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）犬瘟热病毒、犬细小病毒及狂犬病毒三联多表位重组蛋白的构建及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 犬瘟热病毒概述 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒的基因组结构及基本特性 |
| 1.1.2 犬瘟热病毒流行病学 |
| 1.1.3 犬瘟热病毒疫苗研究 |
| 1.2 犬细小病毒概述 |
| 1.2.1 犬细小病毒的基因组结构及基本特性 |
| 1.2.2 犬细小病毒的流行病学 |
| 1.2.3 犬细小病毒疫苗研究 |
| 1.3 狂犬病毒概述 |
| 1.3.1 狂犬病毒的基因组结构及基本特性 |
| 1.3.2 狂犬病毒流行病学 |
| 1.3.3 狂犬病毒疫苗研究 |
| 1.4 重组表位疫苗研究进展 |
| 1.4.1 细胞抗原表位的研究 |
| 1.4.2 多表位疫苗的设计 |
| 1.4.3 多表位疫苗的应用 |
| 1.4.4 表位疫苗相关佐剂研究 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 质粒和菌株 |
| 2.1.4 实验试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 感受态细胞制备(CaCl_2法) |
| 2.3.2 克隆转化及质粒提取 |
| 2.3.3 常用PCR体系及条件 |
| 2.3.4 蛋白原核表达及纯化 |
| 2.3.5 SDS-PAGE电泳及Western blotting |
| 2.3.6 免疫小鼠 |
| 2.3.7 血清样品的制备 |
| 2.3.8 酶联免疫吸附反应(ELISA) |
| 2.3.9 细胞培养 |
| 2.3.10 病毒繁殖 |
| 2.3.11 血凝实验及血凝抑制试验 |
| 2.3.12 中和试验 |
| 2.3.13 快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT) |
| 2.3.14 数据统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 表位的筛选与合成 |
| 3.1.1 CDV、CPV及RV表位的筛选 |
| 3.1.2 CDV、CPV及RV表位的重组 |
| 3.1.3 重组表位蛋白的亲水性、抗原性、表面可及性、可折叠性分析 |
| 3.1.4 重组表位蛋白的二级结构预测 |
| 3.1.5 重组表位蛋白的三级结构预测 |
| 3.1.6 重组表位序列的基因合成 |
| 3.2 重组蛋白表达及纯化 |
| 3.2.1 重组蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 重组蛋白诱导表达 |
| 3.2.3 重组蛋白的纯化及复性 |
| 3.3 重组蛋白抗原性和免疫原性检测 |
| 3.3.1 重组蛋白抗原性的检测 |
| 3.3.2 Western blotting检测重组蛋白与抗病毒血清的特异性反应 |
| 3.3.3 ELISA检测重组蛋白产生的抗体与三种病毒的特异性反应 |
| 3.4 鼠源抗血清抗体特异性检测 |
| 3.4.1 鼠源抗血清中CDV中和抗体检测 |
| 3.4.2 鼠源抗血清中CPV血凝抑制(HI)效价检测 |
| 3.4.3 鼠源抗血清中RV中和抗体检测 |
| 3.5 PEI的佐剂效果研究 |
| 3.5.1 PEI增强多表位重组蛋白免疫反应的研究 |
| 3.5.2 PEI对体抗体分型的影响 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1 各载体图谱 |
| 附录2 各表位在蛋白上的序列 |
| 个人简历 |
（4）水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 水貂阿留申病毒概述 |
| 1.1.1 ADV的分类 |
| 1.1.2 形态结构与理化性质 |
| 1.1.3 ADV的致病机理 |
| 1.1.4 ADV的流行病学 |
| 1.1.5 ADV的防治 |
| 1.1.6 ADV的体外培养 |
| 1.2 ADV的分子生物学特性 |
| 1.2.1 基因组结构 |
| 1.2.2 基因的复制、转录与表达 |
| 1.2.3 基因组编码蛋白 |
| 1.3 AD诊断方法的研究进展 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 第二章 ADV的分离与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品处理 |
| 2.2.2 病毒DNA的提取 |
| 2.2.3 PCR方法检测ADV |
| 2.2.4 病毒分离培养 |
| 2.2.5 电镜观察 |
| 2.2.6 小鼠感染试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR检测结果 |
| 2.3.2 病毒分离与电镜观察结果 |
| 2.3.3 小鼠感染试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 ADV-HRB毒株全序列测定与分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 片段扩增 |
| 3.2.3 克隆测序 |
| 3.2.4 比对分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 片段扩增 |
| 3.3.2 比对分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 ADV重组VP2蛋白的原核表达与鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组表达菌构建 |
| 4.2.2 重组蛋白诱导表达 |
| 4.2.3 重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定 |
| 4.2.4 重组蛋白纯化 |
| 4.2.5 重组蛋白复性 |
| 4.2.6 重组蛋白Western Blot鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组蛋白表达 |
| 4.3.2 重组蛋白纯化 |
| 4.3.3 重组蛋白复性 |
| 4.3.4 重组蛋白Western Blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 ADV单克隆抗体与兔源多克隆抗体的制备 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 病毒、细胞与实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 动物免疫 |
| 5.2.2 细胞融合 |
| 5.2.3 杂交瘤细胞筛选 |
| 5.2.4 杂交瘤细胞亚型鉴定 |
| 5.2.5 IFA检测抗体 |
| 5.2.6 腹水制备与纯化 |
| 5.2.7 抗体效价的测定 |
| 5.2.8 抗原表位的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 单抗亚型 |
| 5.3.2 IFA检测抗体 |
| 5.3.3 腹水纯化 |
| 5.3.4 抗体效价 |
| 5.3.5 表位鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 ADV双抗体夹心ELSIA检测方法的建立 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 病毒与样品来源 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 抗体工作浓度的确定 |
| 6.2.2 反应条件的优化 |
| 6.2.3 判定标准的确定 |
| 6.2.4 特异性试验 |
| 6.2.5 敏感性试验 |
| 6.2.6 重复性试验 |
| 6.2.7 符合率试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 抗体最佳工作浓度 |
| 6.3.2 最佳反应条件 |
| 6.3.3 判定标准 |
| 6.3.4 特异性 |
| 6.3.5 敏感性 |
| 6.3.6 稳定性 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）水貂阿留申病毒的分离鉴定和五种核酸疫苗的构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 水貂阿留申病毒概述 |
| 1.1 水貂阿留申病毒分类地位 |
| 1.2 水貂阿留申病毒毒株间差异与致病性 |
| 1.3 水貂阿留申病毒宿主范围 |
| 1.4 水貂阿留申病毒形态学和理化性质 |
| 1.5 水貂阿留申病毒的培养特性 |
| 1.6 水貂阿留申病毒的分子生物学研究进展 |
| 第二章 水貂阿留申病概述 |
| 2.1 水貂阿留申病流行病学 |
| 2.2 水貂阿留申病临床症状和病理变化 |
| 2.3 水貂阿留申病的致病机理研究 |
| 2.4 水貂阿留申病免疫学研究 |
| 第三章 水貂阿留申病的诊断与防制 |
| 3.1 水貂阿留申病的诊断 |
| 3.2 水貂阿留申病的防制 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 ADV强毒株的分离与鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 ADV分离株的全基因序列测定与遗传特征分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ADV分离株全基因突变核酸疫苗的构建及鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 ADV分离株截短基因核酸疫苗的构建 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 ADV分离株五种核酸疫苗对小鼠免疫原性研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 ADV分离株五种核酸疫苗对水貂免疫原性研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 常用实验方法 |
| 2 试剂配制 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）水貂阿留申病毒（ADV）VP2蛋白体外表达与检测技术应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述水貂阿留申病及其检测方法研究进展 |
| 1 ADV病原学 |
| 1.1 ADV的分类地位 |
| 1.2 ADV的形态、结构及其理化特征 |
| 1.3 ADV病毒培养特性和毒株分类 |
| 1.4 ADV的分子生物学特性 |
| 2 AD流行病学 |
| 2.1 AD传染源和传播途径 |
| 2.2 AD传染宿主 |
| 3 AD的致病机制 |
| 4 AD临床症状及病理学变化 |
| 5 AD的实验室诊断 |
| 5.1 AD血清学诊断方法 |
| 5.2 AD抗原诊断方法 |
| 6 研究的目的和意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 ADV-LN株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 水貂阿留申病毒VP2蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达及反应原性鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 检测ADV抗体的重组VP2蛋白-ELISA方法的建立及应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 ADV TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 水貂阿留申病毒（ADV）LAMP检测方法的建立和初步应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 水貂阿留申病毒（ADV）PCR-DHPLC检测方法的建立及初步应用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 综述 |
| 1.1 ADV的生物学特性 |
| 1.1.1 ADV的分类地位 |
| 1.1.2 ADV的形态特征 |
| 1.1.3 ADV的理化特性 |
| 1.1.4 ADV的培养特性 |
| 1.2 ADV的分子生物学研究 |
| 1.2.1 ADV的基因组特点 |
| 1.2.2 ADV基因的复制和转录 |
| 1.2.3 ADV编码的蛋白 |
| 1.3 水貂阿留申病的研究 |
| 1.3.1 AD的流行病学 |
| 1.3.2 AD的发病机理 |
| 1.3.3 AD的临床症状 |
| 1.3.4 AD的病理变化 |
| 1.4 AD的诊断 |
| 1.4.1 病原学诊断 |
| 1.4.2 血清学诊断 |
| 1.4.3 分子生物学诊断 |
| 1.5 AD的综合防治 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 质粒与菌种 |
| 2.1.5 试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 水貂阿留申病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究 |
| 2.2.3 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 水貂阿留申病毒的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 PCR初步检测结果 |
| 3.1.2 ADV的分离结果 |
| 3.1.3 ADV分离的PCR鉴定结果 |
| 3.1.4 序列的核苷酸同源性比较 |
| 3.2 山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究结果 |
| 3.2.1 PCR扩增结果 |
| 3.2.2 酶切鉴定结果 |
| 3.2.3 同源性分析与系统发育分析结果 |
| 3.3 间接ELISA检测方法的建立结果 |
| 3.3.1 重组载体pMD18-T-VP2的PCR鉴定结果 |
| 3.3.2 重组载体pMD18-T-VP2的酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 重组表达载体pET-32a-VP2的PCR鉴定结果 |
| 3.3.4 重组表达载体pET-32a-VP2的酶切鉴定结果 |
| 3.3.5 重组质粒pET-32a-VP2的序列测定结果 |
| 3.3.6 表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.3.7 表达蛋白的Western blot检测结果 |
| 3.3.8 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.3.9 抗原包被浓度和一抗稀释度的确定 |
| 3.3.10 抗原包被条件的确定 |
| 3.3.11 封闭液的确定 |
| 3.3.12 封闭液作用时间的确定 |
| 3.3.13 二抗最佳稀释度的确定 |
| 3.3.14 底物最佳作用时间的确定 |
| 3.3.15 临界值的确定 |
| 3.3.16 特异性检测结果 |
| 3.3.17 敏感性检测结果 |
| 3.3.18 重复性检测结果 |
| 3.3.19 临床样本检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 水貂阿留申病毒的分离鉴定 |
| 4.2 山东地区水貂阿留申病毒分子生物学特性的研究 |
| 4.3 间接ELISA检测方法的建立 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）水貂阿留申病毒分离鉴定及其致病性研究和诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 背景 |
| 1.2.2 病原分类地位 |
| 1.2.3 AMDV的形态结构和理化特征 |
| 1.2.4 AMDV毒株及培养特性 |
| 1.2.5 AMDV分子生物学特征 |
| 1.3 AD的流行病学 |
| 1.3.1 AD的宿主 |
| 1.3.2 AD传播方式 |
| 1.4 AMDV的致病机制 |
| 1.5 AD临诊症状 |
| 1.6 AD病理变化 |
| 1.7 AD诊断方法 |
| 1.7.1 病原分离鉴定 |
| 1.7.2 血清学诊断方法 |
| 1.7.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.8 AD的防治 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 细胞、菌种及感染动物组织病料的采集 |
| 2.1.3 主要生物制剂和化学试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.1.5 使用溶液及其配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 AMDV的分离、鉴定及基因组进化分析 |
| 2.2.2 AMDV分离株致病性 |
| 2.2.3 水貂阿留申病对流免疫电泳检测方法的建立 |
| 2.2.4 利用环介导等温扩增技术（LAMP）检测AMDV方法的建立及应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 AMDV分离、鉴定及基因序列分析 |
| 3.1.1 现地AMDV感染水貂的临诊主要表现 |
| 3.1.2 CIEP鉴定结果 |
| 3.1.3 病毒分离培养 |
| 3.1.4 PCR鉴定 |
| 3.1.5 病毒基因组PCR扩增 |
| 3.1.6 基因测序及其拼接 |
| 3.1.7 部分NS1的基因组特征及进化规律 |
| 3.1.8 VP2基因及其编码的蛋白序列特征及进化规律 |
| 3.2 分离株AMDV-HLJ致病性 |
| 3.2.1 分离株TCID50测定 |
| 3.2.2 AMDV人工感染动物临诊主要症状 |
| 3.2.3 AMDV感染水貂大体病变 |
| 3.2.4 AMDV感染水貂主要组织病理变化 |
| 3.2.5 AMDV感染水貂组织抗原检测 |
| 3.2.6 AMDV实验感染水貂病毒的分离鉴定 |
| 3.3 AMDV对流免疫电泳检测方法的建立 |
| 3.3.1 抗原电镜检测结果 |
| 3.3.2 抗原工作浓度优化 |
| 3.3.3 抗原对比试验 |
| 3.3.4 抗原特异性检测 |
| 3.4 环介导等温扩增技术(LAMP)检测AMDV方法的建立及应用 |
| 3.4.1 LAMP引物的设计 |
| 3.4.2 利用设计引物扩增AMDV基因组 |
| 3.4.3 反应条件优化 |
| 3.4.4 LAMP检测结果的判定 |
| 3.4.5 应用建立的LAMP方法检测现地样品 |
| 4 讨论 |
| 4.1 AMDV分离鉴定及基因组序列分析 |
| 4.2 AMDV-HLJ分离株对水貂的致病性 |
| 4.3 水貂阿留申病对流免疫电泳检测方法建立 |
| 4.4 可视化LAMP检测AMDV方法的建立及其应用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）水貂阿留申病检测抗原的制备及间接ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 水貂 ADV 的病原特性 |
| 1.1 ADV 形态特征及理化性质 |
| 1.2 ADV 的分类 |
| 1.3 ADV 基因组结构 |
| 1.4 ADV 的蛋白质特点 |
| 2 AD 的研究现状 |
| 2.1 AD 流行病学 |
| 2.2 AD 临床症状及病理变化 |
| 2.3 AD 的发病机制 |
| 3 AD 的诊断 |
| 3.1 ADV 的分离与鉴定 |
| 3.2 分子生物学诊断方法 |
| 3.3 抗体检测技术 |
| 4 防控措施 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 水貂阿留申病检测抗原的原核表达及反应原性分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 抗原蛋白快速固定的高效间接ELISA检测方法的建立及应用 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）犬细小病毒诊断与防制研究进展（论文提纲范文）
| 1 诊断技术研究进展 |
| 1.1 动物试验 |
| 1.2 病毒分离 |
| 1.3 电镜检查 |
| 1.3.1 直接电镜 (EM) 检查 |
| 1.3.2 免疫电镜 (IME) 检查 |
| 1.4 血清学诊断技术 |
| 1.4.1 血凝 (HA) 试验 |
| 1.4.2 血凝抑制 (HI) 试验 |
| 1.4.3 琼脂扩散 |
| 1.4.4 对流免疫电泳 |
| 1.4.5 血清中和试验 |
| 1.4.6 免疫荧光试验和间接免疫荧光试验 |
| 1.4.7 酶免疫分析技术 |
| (1) 间接ELISA |
| (2) 抗原竞争ELISA |
| (3) 双抗体夹心ELISA (Das-ELISA) |
| (4) 斑点ELISA (Dot-ELISA) |
| 1.4.8 单克隆抗体 (McAb) 技术 |
| 1.5 分子生物学诊断技术 |
| 1.5.1 PCR方法 |
| 1.5.2 核酸探针技术 |
| 1.5.3 核酸杂交技术 |
| 1.5.4 环介导等温扩增技术 |
| 2 防制技术研究进展 |
| 2.1 常规疫苗 |
| 2.2 新型疫苗 |
| 3 小结与展望 |
| 3.1 诊断技术 |
| 3.2 防制技术 |
四、对流免疫电泳检测犬细小病毒免疫复合物中抗体的研究（论文参考文献）
- [1]抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估[D]. 胡瑞鸿. 东北农业大学, 2020(07)
- [2]阿留申病毒VP2基因蛋白与标准病毒抗原CIEP法检测的比较分析[D]. 吴国桃. 吉林农业大学, 2019(03)
- [3]犬瘟热病毒、犬细小病毒及狂犬病毒三联多表位重组蛋白的构建及其免疫效果研究[D]. 李全. 中国农业大学, 2017(08)
- [4]水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立与应用[D]. 王元智. 中国农业科学院, 2017(05)
- [5]水貂阿留申病毒的分离鉴定和五种核酸疫苗的构建及免疫原性研究[D]. 刘东旭. 吉林农业大学, 2016(02)
- [6]水貂阿留申病毒（ADV）VP2蛋白体外表达与检测技术应用研究[D]. 贾赟. 吉林农业大学, 2016(02)
- [7]水貂阿留申病病毒分子流行病学调查及间接ELISA检测方法的建立及初步应用[D]. 韩铠怿. 山东农业大学, 2016(03)
- [8]水貂阿留申病毒分离鉴定及其致病性研究和诊断方法的建立[D]. 张卓. 东北农业大学, 2015(04)
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