一、HPO结构与受体结合功能关系的初步研究（论文文献综述）
陈璐[1]（2021）在《PLA2R胞外结构域与PAHs体外相互作用研究》文中研究说明特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy,IMN）是一种自身免疫性疾病。IMN诊断的最主要分子标志物是抗M型磷脂酶A2受体（PLA2R）的自身抗体（anti-PLA2R）,存在于超过80%IMN患者体内,在健康人体内不存在。anti-PLA2R结合肾小球足细胞表面的PLA2R,形成原位免疫复合物,攻击肾小球足细胞,导致肾小球滤过屏障破坏,最终导致IMN。已有研究发现IMN发病率同大气中PM2.5浓度显着相关,一直以来研究人员致力阐明人体自身免疫系统在IMN发病机制中的角色,并未建立环境污染同IMN发病机制之间的关联。多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs）作为PM2.5的重要有机组成成分,对肾脏具有毒性效应,PAHs易于在肾脏中尤其是足细胞基底膜部位累积,因此PLA2R是PAHs的潜在毒性靶分子。为了探究PAHs同PLA2R的相互作用,本论文构建人源PLA2R胞外结构域CTLD1的原核表达体系,筛选并表征了同CTLD1蛋白相互作用的PAHs,同时成功结晶了 CTLD1。本论文工作为揭示和认知PM2.5尤其是PAHs诱导INM发病提供了重要的科学依据。论文通过将人源PLA2R（Ncbi:NM007366.5）基因经密码子优化后连接到pET40b载体上;将带有目的基因的重组质粒转化至表达宿主Shuffle T7并低温诱导,获得可溶性蛋白DsbC-8His-CTLD1;通过镍柱亲和层析与凝胶过滤层析得到纯度95%的DsbC-8His-CTLD1融合蛋白;使用人源肠激酶hEK-6His切除DsbC融合标签进一步纯化后得到CTLD1,纯度95%以上;MALDI-TOF MS测得CTLD1实际分子量为17199 Da,与理论值相符。同时构建pET28a-CTLD1-6His原核表达载体经过同样诱导条件获得可溶CTLD1-6His;经色谱纯化、质谱表征,得到了纯度95%以上的CTLD1-6His。利用圆二色谱（CD）分析CTLD1以及CTLD1-6His,两者CD谱图一致,说明在没有DsbC（促二硫键异构酶）存在条件下,CTLD1仍能够以天然构象在大肠杆菌中可溶表达。对CTLD1进行变温圆二色分析,确定Tm为52℃。利用等温滴定量热实验筛选了与CTLD1存在相互作用的共10种PAHs:其中,苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、芘能够结合CTLD1,结合能力由强到弱依次为:苯并[a]蒽>苯并[a]芘>苯并[b]荧蒽>芘。进一步利用圆二色分析共孵育CTLD1与PAHs溶液发现:苯并[a]蒽、苯并[a]芘、芘与CTLD1的结合影响了CTLD1二级结构。最后,为解析CLTD1的X射线晶体结构,筛选并确定了 CLTD1晶体培养条件为:CLTD1蛋白浓度11 mg/mL,25℃0.075MNa2HPO4,0.075 M K2HPO4,0.075 M MES pH=6.5。综上,论文研究实现了 PLA2R部分胞外结构域在原核体系下的高效表达,通过等温滴定量热技术筛选并表征了与CTLD1蛋白相互作用的PAHs,同时获得CTLD1蛋白质晶体。
陈启煊[2]（2021）在《基于磷酸镁水合过程的电化学及其分析应用》文中研究指明磷酸镁是一类重要的生物材料,在生物医学领域中具有广泛应用。磷酸镁的水合作用对其形成和应用具有重要意义,而水分子（H2O）在镁离子(Mg2+)和磷酸根离子的影响下可能具有的电化学氧化活性及应用尚未有研究。本文对磷酸镁形成过程及其水合过程中的电化学行为进行了探索,并基于其结合H2O的电化学氧化特性构建了对磷酸根离子的检测平台。主要研究结果如下:（1）在pH 7.4的条件下,母液中初始镁源越多越有利于MgHPO4·3H2O的形成;磷源含量越多越利于Mg3（PO4）2·5H2O和Mg3（PO4）2·8H2O相的形成。母液在pH 7.4的条件下可以形成MgHPO4·3H2O,再经由缓慢向Mg3（PO4）2·5H2O转变;pH的升高可加快该相转变过程;并观察到了在磷酸镁相转变过程中周围磷酸根离子的结构在不断地发生变化,直至磷酸镁形成稳定的相。（2）将MgHPO4·3H2O组装在MWCNT/Nafion修饰的玻碳电极上,即制得的MgPs/MWCNT/Nafion电极。MgHPO4·3H2O在溶液中生成的结合H2O在磷酸根夺质子的作用下形成结合的氢氧根（OH-）,结合的OH-在电刺激下出现一明显的电化学氧化峰。在加入自由的Mg2+离子后,促进了更多的结合H2O和结合OH-的生成,从而可以实现了在0.1μM至10μM范围内对磷酸根离子的直接电化学检测,磷酸根离子的浓度正比于氧化峰的电流值高度。此外,基于MgPs/MWCNT/Nafion电极在对磷酸根的检测过程中,不受其他阴离子的影响,表现了良好的选择性。（3）在MWCNT/Nafion修饰的玻碳电极上原位组装了富镁状态的磷酸镁即MgPs/MWCNT/Nafion。使用拉曼光谱、红外光谱、X射线衍射和能量色散X射线光谱仪对其结构进行表征。考察了其在磷酸、碳酸、硼酸以及醋酸等多种缓冲液中的电化学行为。选取pH 7.4磷酸缓冲溶液为模型,发现了该修饰电极位于0.7和1.0 V vs Ag/Ag Cl处的氧化峰强度随着磷酸镁中Mg2+含量增加而增强。通过红外光谱与XPS能谱的数据分析,证实了这与形成的MgPs结合H2O的含量有关,从而揭示了结合H2O的电化学氧化过程即结合H2O在磷酸根促进下经由结合OH-转变至结合OOH,进而释放出氧气。这一发现为水的电化学氧化机制提供了直接的实验证据,也为水的电化学氧化提供了来源丰富的无机材料。
林净[3]（2021）在《隔药灸对肾阳虚证多囊卵巢综合征患者的疗效及血清IGF-1水平影响的临床观察》文中认为目的:通过临床研究观察隔药灸对肾阳虚证多囊卵巢综合征患者的临床疗效,及其对患者血清LH、FSH、以及LH/FSH比值、血清IGF-1水平的影响,并初步探讨隔药灸调节IGF-1的作用机制如何影响IGF-1水平的机理。方法:将符合纳入标准的80例患者,采用随机对照的方法等分为试验组和对照组,40例为一组,试验组选用隔药灸法,选穴为神阙、关元、子宫（双）,对照组选穴为:神阙、关元、子宫（双）,采用温灸器灸法治疗,两组的治疗疗程均为3个月。分别观察并记录两组患者在治疗前后的肾阳虚症候改善情况、血清IGF-1水平、LH、FSH以及LH/FSH比值等。并将所得数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。结果:1.两组患者的肾阳虚症候方面:两组在治疗后症候积分较治疗前均有所降低（P<0.05）,且试验组降低相对于对照组更明显,两组治疗后的数据比较差异具有统计学意义（P<0.05）,可见隔药灸与温灸器灸均能改善患者的肾阳虚症候,而且隔药灸优于温灸器灸。2.血清IGF-1水平方面:试验组和对照组治疗后的血清IGF-1水平均较前下降（P<0.05）,试验组的下降幅度更为明显,两组治疗后经过组间比较,结果经分析具有统计学意义（P<0.05）。综合数据分析表明两组均可降低患者的血清IGF-1水平,且试验组较对照组更为显着。3.LH、FSH及LH/FSH水平方面:两组经治疗后均较前改善（P<0.05）,试验组在治疗后LH的降低幅度、FSH升高幅度较对照组更为显着,组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）,可说明试验组在改善患者性激素水平方面优于对照组。4.总体疗效方面:试验组治疗后的总有效率为86.84%,对照组的总有效率为71.05%,两组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）,综合数据分析表明隔药灸在改善肾阳虚证多囊卵巢综合征患者的症候方面明显优于温灸器灸组。结论:1.隔药灸治疗肾阳虚证多囊卵巢综合征患者具有较为显着的疗效,可以较好地改善患者的临床症状,同时可以改善患者LH、FSH以及LH/FSH比值,并能明显地降低患者血清IGF-1水平。2.通过本临床研究,可以得出隔药灸是一种通过改善卵巢局部调节因子及性激素水平而改善患者肾阳虚症状的一种有效的治疗方法。
钟姝凝[4]（2021）在《β-葡萄糖苷酶对人参皂苷生物转化及其相互作用机制研究》文中研究指明人参作为传统中药的瑰宝,其医疗及保健功效显着,在药物和新资源食品开发中得到广泛应用。作为产生药效的物质基础,人参皂苷是人参的主要活性成分,其中含量占多数的称为主要人参皂苷,如人参皂苷Rb1,当其脱去部分/全部糖基后所得产物,称为稀有人参皂苷,具有更强的活性与更佳的生物利用度。β-葡萄糖苷酶具有催化烷基糖苷、芳基糖苷等分子糖链末端非还原性β-D-葡萄糖苷键水解的作用,可将糖基化的主要人参皂苷生物转化为稀有人参皂苷。发掘新型β-葡萄糖苷酶资源并对其相关性质及功能进行分析,阐明β-葡萄糖苷酶在催化反应过程中与底物人参皂苷的结合与相互作用模式,探究稀有人参皂苷作为细胞核受体调节剂的构-效关系,对理解β-葡萄糖苷酶作用于非典型底物人参皂苷Rb1的作用机制,以及拓展稀有人参皂苷的生理活性有重要意义。本文主要研究内容包括如下几个方面。（1）以GH1家族中Paenibacillus polymyxa来源的β-葡萄糖苷酶（Gen Bank:M60211.1）,对密码子优化使其更易原核表达。随后对该基因序列bgl B进行基于PCR法的全基因合成,连接pET-28a（+）载体以构建重组质粒pET-28a（+）-bgl B,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,于30℃,220 rpm条件下,经IPTG诱导在菌体细胞破碎后的上清液中获得表达产物,即原核表达的重组β-葡萄糖苷酶。利用Ni-NTA层析法对粗酶液进行纯化,鉴定重组β-葡萄糖苷酶蛋白质单体的分子量为52 k Da,蛋白质浓度为0.479 mg/m L,纯度大于95%。采用多种生物信息学软件及在线工具,分析目标β-葡萄糖苷酶的理化性质,该酶无跨膜结构域,无信号肽,整体呈亲水性,分析了蛋白质二级结构组成,三级结构模型合理,蛋白质结构中共含有4个磷酸化位点,发现9个开放阅读框中ORF2序列含有糖苷水解酶家族GH1的特征序列,亚细胞定位于细胞质。对β-葡萄糖苷酶的编码氨基酸序列,进行多序列比对分析及进化关系分析,可知糖苷酶之间的同源性存在差异,其催化功能的活性中心依然保持高度相似性。总的来说,通过全基因合成及原核表达纯化,获得序列及结构信息明确的β-葡萄糖苷酶,结合生物信息学分析,有助于理解该酶的进化关系、相关性质及功能。（2）利用多种光谱实验方法及分子模拟,探究β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1相互作用模式,对纯酶、β-葡萄糖苷酶-人参皂苷Rb1复合物进行表征。荧光光谱分析了在不同温度条件下,随着人参皂苷Rb1浓度的增加,β-葡萄糖苷酶的自发荧光减弱,其中的固有荧光氨基酸残基所处微环境发生变化。在280 nm波长处,峰值出现轻微蓝移,说明β-葡萄糖苷酶在基态更加稳定,获得Stern-Volmer方程（y=0.00754x+1.0984,R2=0.9941）,猝灭常数KSV为8.37×103L/mol,速率常数Kq为8.37×1011L/mol×s,KSV随温度升高而增大,说明该过程属于静态猝灭。同步荧光光谱分析了当△λ=15及60 nm时,由不同氨基酸残基引起荧光强度的变化情况,并与三维荧光光谱共同佐证了一致的结论。紫外-可见吸收光谱分析了Rb1浓度升高后,酶中Trp疏水基团被更多的包裹,酶-Rb1之间形成一个新的共轭体系,二者之间发生非辐射能量转移,并增加新的π-π*跃迁。圆二色光谱分析了Rb1的加入与结合,使酶的二级结构发生变化。LSPR分析了当β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1形成稳定的1:1复合物时,平衡解离常数（KD）为5.24×10-4(±2.35×10-5)mol/L,ka为29.7(±6.62×102/mol×L-1×s),Kd为1.56×10-2(±2.17×10-5)/s。FTIR分析了β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1复合物的结构变化。动态光散射分析了Rb1的加入使β-葡萄糖苷酶的流体力学半径与酶溶液的Zeta电位发生的变化。分子对接分析了人参皂苷Rb1与β-葡萄糖苷酶的结合构象（-8.9 kcal/mol）、结合位点、氢键作用及热点氨基酸残基。将β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1复合物提交100 ns分子动力学模拟,可知该体系整体波动较小,总结合自由能为-50.86kcal/mol,说明二者具有较好的结合。（3）在对重组β-葡萄糖苷酶的酶学性质探究,及酶对人参皂苷Rb1的生物转化分析中,测定了粗酶液经Ni-NTA柱纯化后,酶的比活力提高了15倍,得率为51.0%,水解p NPG比活力达到12.4 U/mg。重组β-葡萄糖苷酶的Km和Vmax值分别为0.743 mmol/L和3.14×104μmol/min/mg。Kcat/Km为3.813×103/s/mmol/L,说明对典型底物p NPG具有更高特异性及催化效率,并探究了该酶的底物特异性及催化环境对重组β-葡萄糖苷酶的影响,结果说明该酶在pH范围3.0至9.5内具有活性,最高活力在pH 6.5;温度范围20℃至70℃内都有活性,于40℃具有最高活力。探究了金属离子及化学试剂对酶活力的影响,结果显示一价金属Na+、K+、Li+,二价金属Ba2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对重组β-葡萄糖苷酶的活力影响轻微;三价金属Al3+及重金属Pb2+、Ag+的加入使酶活力受到较大程度的抑制;醇类及DMSO对该酶活力影响较小,而SDS及EDTA可以抑制80%以上的酶活。对酶学性质的了解,为后续对酶的开发应用奠定基础。建立了能够同时测定Rb1、Rd、F2、CK等人参皂苷的超高效液相色谱方法与三重四极杆线性离子阱串联质谱法,对人参皂苷的成分及结构组成进行判别。对于酶转化人参皂苷的反应过程,以单体标准品人参皂苷Rb1为底物,在最优条件下（pH 6.5;温度40℃;Rb1浓度1 mg/m L）,酶活力10 U的重组β-葡萄糖苷酶可以转化底物人参皂苷Rb1,水解C-3位葡萄糖基及C-20位的β-D-吡喃葡萄糖基,转化路径为Rb1→Rd→F2→CK。催化反应72 h时,人参皂苷CK的产率为41.85%,人参皂苷的F2产率为20.57%,人参皂苷Rb1的总转化率为95.70%。（4）以人参皂苷的主要代谢产物及作为结构基础的四种人参皂苷,20（S,R）-原人参二醇[PPD（S,R）]和20（S,R）-原人参三醇[PPT（S,R）]作为研究对象,探究人参皂苷作为雌激素受体调节剂的构-效关系。重组质粒p GEX-4t-1-ERα-LBD转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,利用GST亲和层析柱纯化,获得目标蛋白ERα-LBD,经SDS-PAGE分析其为62.8 k Da的可溶性蛋白质,即对应含有hERα配体结合域的GST融合蛋白。荧光偏振体外结合与竞争实验中,受试人参皂苷均表现出与hERα-LBD的剂量依赖性结合,Kd值在1260.64μmol/L-1716.19μmol/L之间,结合强度大小顺序为PPD（S）>PPD（R）>PPT（S）>PPT（R）。双荧光素酶报告基因实验中,构建pc DNA3.1（t）-hERα质粒,将ERα的反应原件ERE装载于质粒ERE-luc上,并以p RL-TK质粒作为内参,以荧光信号比值（Fluc/Rluc）作为经标准化后的ERα转录活性。双荧光素酶报告基因结果显示,hERα被PPD（S,R）和PPT（S,R）以剂量依赖的方式激活,能够上调由ERα介导的基因转录,最大增加4倍。人参皂苷在微摩尔浓度下可以激活ERα转录,表现出比E2（纳摩尔浓度）弱的效力。利用分子对接技术分析了人参皂苷-hERα-LBD复合物中受体-配体之间的相互作用及结合模式。分子对接结果与实验测定IC50值具有良好的相关性（R2=0.94）,表明分子动力学模拟可用于预测新型生物活性化合物对靶受体的结合效力。
刘鹏[5]（2021）在《含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究》文中指出由口腔颌面部肿瘤、创伤、先天性疾病以及炎症导致的骨组织缺损是口腔诊疗中的常见问题,同时也是口腔医生修复骨缺损时所面临的难题之一。颌骨缺损严重影响咀嚼、吞咽、语言等重要生理功能,骨缺损治疗效果不佳或骨缺损修复失败都会直接影响患者的生活质量。口腔种植修复是目前牙列缺失和牙列缺损的主要治疗方式。充足的骨量是保证种植成功的关键之一,但在复杂的咬合关系及不同的口腔环境影响下,牙齿缺失患者往往伴有不同程度的缺牙区牙槽骨萎缩,易引发种植失败的问题。自体骨虽被临床认为是骨移植的“金标准”,但第二术区的开辟造成的创伤较为严重,来源限制,无法随意塑形,且自体骨移植后会发生一定的并发症。异体骨也受限于原料需求和排异反应等造成价格昂贵,并且存在修复风险。“骨组织工程”概念的提出即是针对以上问题,提出的以种子细胞、细胞因子、支架为媒介代替传统的骨移植的治疗方法。利用骨修复材料与种子细胞及细胞因子的相互配合,实现骨缺损的高水平修复是针对较大骨缺损量的骨缺损治疗的必由之路。近年来随着细胞工程和基因编辑技术的发展,组织工程中种子细胞和细胞因子的研究取得了很大进展,骨组织工程里可选用的支架体系种类繁多,但其各自存在的无法避免的问题使得其应用仍然非常受限。例如,金属支架的生物惰性、力学不匹配、高分子材料降解速率可控性差、引发排异反应、传统陶瓷支架的脆性、较差的骨传导性等问题。寻找合适的材料体系,设计并制备出符合不同成骨需求的个性化支架,是骨组织工程在口腔颌骨修复从理念走向临床应用的关键。羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是骨骼和牙齿组织中天然存在的无机矿物成份,由HA制备成的支架一直被骨组织工程修复领域所推崇。然而,实验室中常用的HA主要是Ca10（PO4）6（OH）2及其它形式的磷酸钙材料,这与骨组织中的HA结晶性差、存在多种离子的梯度取代、在不同骨位置的成份差异等的实际需求相差较大。在文献里已报道的应用中,未掺杂的纯HA存在脆性大、降解效果差、与新生骨组织存在界面等问题,仍然是限制其作为骨组织工程支架的瓶颈之一。如何设计并制备出具有与人体骨组织中的矿物相类似的仿生HA骨粉材料,并且根据不同部位的骨缺损需求,个性化订制骨修复材料,是推动骨组织工程在临床应用的关键。在骨骼和牙齿中的HA主要为存在金属离子梯度掺杂的碳酸根取代的HA,碳酸根的质量分数为3-8wt%,其中碳酸根主要取代磷酸根的晶体学位置,称为B-型羟基磷灰石。碳酸根取代可以使HA结晶度变差,结构更松散,从而有利于破骨和骨重建,其松散的结构更利于与胶原及其它蛋白的结合从而降低材料的脆性,使之具有更强的塑性。因此,开发出碳酸根取代的HA材料,实现碳酸根的浓度可控取代,对于从支架方面推动骨组织工程应用于口腔临床骨缺损治疗具有重要意义。稀土元素由于其特征的光谱性质,可作为生物材料的荧光标记物,尤其是其离子半径与Ca2+离子接近,有很多文献已将其应用于骨植入材料在体内演化情况的荧光标记。另外,也有文献报道低剂量的稀土离子掺杂不但可以调节HA的结晶度,而且还能通过缓释的稀土离子激活钙通道,从而促进间充质细胞向成骨细胞的分化。基于以上关于HA应用于骨组织工程支架的研究现状,我们提出以碳酸根的可控取代和稀土的可控掺杂为源头,制备出系列具有不通碳酸根和稀土离子含量的B-型羟基磷灰石仿生骨粉材料,采用3D打印的方式,将其制备成支架,在细胞和动物水平上评价其促成骨效果,为骨组织工程研究提供更接近于骨组织的可个性化订制的支架体系,从而推动解决口腔颌骨修复所面临的的复杂的成骨环境和特异性成骨需求的问题。本论文主要分为（1）材料设计与可控制备,（2）细胞水平评价小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化与关键蛋白表达,（3）动物水平评价新生骨组织形成、钙化及新骨在支架中的生长等三个部分,分别简述如下:（1）碳酸化及稀土掺杂的HA仿生骨粉的制备根据在生理环境下的钙离子、磷酸根离子、碳酸根离子的热力学平衡条件,利用Pourbaix计算并得到了B-型羟基磷灰石的矿化条件及调节参数,制备出了系列碳酸根取代的羟基磷灰石（carbonated hydroxyapatite,CHA）纳米材料,通过控制反应条件和初始碳酸根浓度,可调节产物HA中碳酸根的比例。在此基础上,将与Ca2+离子具有相近离子半径但是不同电荷的稀土离子掺杂进入HA及CHA晶格中,从而制备出系列稀土离子掺杂的HA及CHA材料。结构分析表明具有三角形构象的碳酸根阴离子在取代具有四面体构象的磷酸根离子时,以相对于c-轴呈30 o角的方式扭曲叠加在磷酸根四面体的一个较长P-O键参与的面上。随着碳酸化程度的增加,纳米棒的长径比从3.6降为2.9。稀土离子的种类可以影响B-型羟基磷灰石纳米棒的形貌,并且碳酸化并不会影响稀土在HA中的配位环境及发光性质。采用该方法得到的B-型羟基磷灰石材料与人体骨组织中的矿化成份接近,并且稀土元素可以均匀地掺杂在材料的晶格中,既可以利用其特征荧光光谱标记其在体内的变化过程,又可以作为潜在的成骨细胞分化促进剂来激活成骨过程,以实现更好的促成骨效果。（2）细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的HA材料的生物学性能选取HA、1mol%铕（europium,Eu）掺杂的HA（Eu-HA）、1mol%铽（terbium,Tb）掺杂的HA（Tb-HA）、碳酸根取代度为3.3wt%的羟基磷灰石（CHA）、1mol%Eu-掺杂的CHA（Eu-CHA）、1mol%Tb-掺杂的CHA（Tb-CHA）六组材料为代表,研究了它们对于MC3T3-E1细胞的形态、增殖及成骨分化的影响。采用三维打印机将以上材料打印成支架,通过系统的细胞增殖、分化及蛋白表达测试,评价其作为骨修复材料应用于骨组织工程的潜力。六组材料都是潜在的骨修复材料,其中Tb的掺入可促进MC3T3-E1细胞的黏附增殖,尤其是Tb-CHA,在ALP染色和定量、茜素红染色、成骨相关蛋白表达实验结果中,表现出了最佳的促成骨效果,明显优于Tb-HA、HA和CHA;Eu的掺入减缓了MC3T3-E1细胞的增殖、黏附及成骨分化。（3）稀土掺杂及碳酸根取代的HA支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究通过以上研究,我们发现在体外促进成骨细胞增殖、黏附和成骨分化方面,掺杂Tb的材料优于掺杂Eu的材料,CHA优于HA,故我们采用大鼠颅骨缺损模型,分别植入HA支架、Tb-HA支架、CHA支架和Tb-CHA支架材料,评价骨缺损的修复。经影像学及HE染色分析结果可知,术后4周,各组对骨缺损的修复均不明显。术后8周,空白对照组缺损处仅表现为少量的新骨形成,HA组未见明显愈合,Tb-HA可见缺损部位实现了一部分修复,HE染色切片可见新生骨;与HA组相比,CHA组对骨缺损进行了一定程度的修复;Tb-CHA组显示出最强的成骨效果,且可降低局部炎症反应。综上所述,本论文从应用于骨组织工程修复骨缺损支架的源头出发,通过对HA材料矿化机制的深入分析,设计并制备出了系列与人体骨组织成份最为接近的CHA材料,并且将稀土离子选择性地标记在HA结构的Ca1晶体学位置;采用3D打印技术,将模型材料打印成支架,分别在细胞水平上和动物水平上,通过系列实验手段检测了材料对MC3T3-E1细胞的增殖、分化能力、蛋白表达水平和新骨生长情况的影响,发现了碳酸根取代和稀土Tb3+离子掺杂都可促进HA材料的骨缺损修复效果。本论文的研究将从源头上把以HA为主的骨组织工程支架材料引导为碳酸根取代的HA和异价金属离子掺杂HA,利用这种碳酸根和稀土离子调控的成骨性能差异,借助3D打印设备,根据不同位置的成骨需要个性化的设计支架,订制具有不同成骨需求的支架材料,从而为像口腔颌面部骨组织这种复杂的骨缺损疾病提供个性化的修复植入材料。
徐海洋[6]（2021）在《家蚕ENF肽结合蛋白识别配体ENF肽的结构基础和分子机制》文中研究说明昆虫在面对外界各种极端环境压力和病原体侵染的过程中,进化出了一套由体液免疫和细胞免疫组成的独特免疫系统,主要依赖血液中的抗菌肽和细胞因子发挥作用。昆虫ENF肽作为一种细胞因子,广泛存在于鳞翅目昆虫中,且已经被证明可以激活免疫反应,对机体进行自我保护。同时,昆虫体内还存在一类ENF肽结合蛋白,可以通过与ENF肽结合并抑制其活性,从而起到免疫负调控的作用。这种由ENF肽与ENF肽结合蛋白共同调控的免疫应答反应属于机体自我保护的一种反馈调节。但目前对于ENF肽参与的免疫反应的研究主要集中在其上游的激活通路中,而对于其下游的免疫解除过程却知之甚少。因此,阐明ENF肽结合蛋白在免疫反应中的作用机制,对理解昆虫基本的免疫调节过程,尤其是下游的免疫解除机制具有重要意义。本文以家蚕ENF肽结合蛋白（BmENF-BP）为研究对象,采用结构生物学手段来阐释ENF肽结合蛋白结合家蚕ENF肽（PP）的结构基础和分子机制,同时围绕ENF肽结合蛋白在ENF肽参与免疫反应中扮演的角色展开研究。获得的主要成果如下:1、家蚕ENF肽结合蛋白的三维结构解析我们采用原核表达及纯化获得高纯度的BmENF-BP蛋白,经过晶体筛选和优化获得了 BmENF-BP晶体,并通过X-射线衍射的方法收集到3A的数据,最终解析了 BmENF-BP的三维结构。BmENF-BP的整体结构可分为3个结构域:恶臭假单胞菌的同源区域（PPD）、全α螺旋结构域和全β折叠结构域。其中N端结构域由8个β折叠片和4个α螺旋组成,β折叠与α螺旋之间通过loop相连。N端结构域含有大量的loop区域,推测其可能是结合ENF肽的结合区域。而全α螺旋结构域和全β折叠结构域与家蚕经典30K蛋白BmLP7的全α螺旋结构域和全β折叠结构域高度相似,因此BmENF-BP可能具有与BmLP7相同的、结合某脂类物质的功能。为确定ENF肽结合蛋白的全α螺旋结构域和全β折叠结构域对其N端结构域折叠和功能的影响,我们单独表达了 BmENF-BP的N端结构域,并对其进行蛋白纯化与结晶、以及三维结构解析,最终得到了单独N端结构域的三维结构。将单独的N端结构与BmENF-BP中的N端结构域进行叠合比较和RMSD计算分析,我们发现二者高度相似,RMSD值为0.265A,表明N端结构域作为一个单独的结构域是十分稳定的。2、家蚕ENF肽结合蛋白与其配体PP的结合位点分析由于BmENF-BP蛋白及单独的PPD结构域蛋白分别与PP共结晶后均未获得复合物晶体。我们尝试将PP与BmENF-BP-N蛋白通过linker连接的方式进行融合表达,并获得了 PP-ENF-BP-N融合蛋白;使用晶体筛选、优化以及X-射线衍射等方法收集到复合体的衍射数据。解析该复合体结构时发现,N端结构可以成功搭建出来,而配体PP部分由于其电子云图完整度较低,只能确定大致位置即PP结合在NF-BP-N的N端。接着,我们基于该结合的大致区域对BmENF-BP和PP进行了分子对接模拟,获得了 BmENF-BP与PP的复合体模型。从结构模型上看,N端结构域N端的表面具有酸性沟槽,而PP肽有大片的碱性界面,这就为BmENF-BP与配体PP的结合提供适宜的环境。我们还通过结合实验确定了 BmENF-BP只与PP-Reduced结合,因为还原肽的PP使得自身的碱性界面暴露,更容易与BmENF-BP结合。随后,我们对酸性沟槽中8个可能直接参与BmENF-BP与PP-Reduced结合的氨基酸进行定点突变以及结合能力分析,确定BmENF-BP蛋白的E19、E23、D25和D 27等4个氨基酸直接参与了 PP-Reduced的结合,E15、E16、E30、D31等4个氨基酸在PP-Reduced与BmENF-BP结合中起辅助作用。3、家蚕ENF肽结合蛋白在PP参与的家蚕免疫应答中扮演的角色对家蚕五龄第3天幼虫进行PP及病原菌注射的研究发现,两者均能够诱导BmENF-BP基因和下游抗菌肽基因的表达,这表明PP能够激活家蚕的体液免疫。定量结果显示,BmENF-BP基因的诱导表达出现在抗菌肽基因被诱导之后。这暗示了 BmENF-BP应该是在体液免疫激活之后发挥作用,可能与免疫的解除有关。另外,PP与受体（BmE细胞）的结合能力比PP与BmENF-BP弱,表明BmENF-BP可以将PP从受体上竞争性结合下来,从而终止免疫。BmENF-BP、BmE细胞和PP的共定位结果显示,BmE细胞膜上的受体只能与PP-Oxidized结合,而BmENF-BP只能与PP-Reduced结合。且只有当PP-Oxidized与BmE细胞膜受体结合后,BmENF-BP才能被共定位在BmE细胞膜上。这表明PP-Oxidized与细胞膜上受体结合后会发生构象变化,该变化可能模拟了 PP还原态的构象（或者直接变为还原态）,而后者会与BmENF-BP结合从使免疫终止。综合以上结果,我们对PP调控的体液免疫应答信号通路模型假设如下:氧化态的活性PP与细胞上的受体结合并激活体液免疫,同时PP因被受体结合发生构象变化,变得容易被BmENF-BP识别和结合。因为BmENF-BP通过竞争性结合的方式将PP从受体上竞争下来以解除持续的免疫刺激,从而使机体保持稳态。对于PP由氧化态到还原态的转变,我们有两种猜想:①受体使PP由氧化态转变成还原态;②外源刺激引发体液中PP从氧化态变成还原态。为验证以上结论及猜想,我们通过免疫共沉淀法联用质谱检测鉴定PP的受体蛋白,经过功能注释最终筛选出10种可能的靶标蛋白,为进一步的研究奠定基础。
串俊兰[7]（2020）在《FGD6蛋白DH和PH1结构域的结构和功能研究》文中进行了进一步梳理研究报道FGD6基因是老年黄斑变性和自闭症的易感基因,FGD6蛋白的生物学功能主要表现为促进Rho家族小GTP酶上鸟苷酸的交换。FGD6蛋白由一个N端结构域、DH（Dbl homology）、PH1（pleckstrin homology 1）、FYVE和PH2（pleckstrin homology 2）结构域组成,其中DH和PH1串联的结构域是FGD6蛋白发挥鸟苷酸交换活性的基本功能单元。目前还没有FGD6蛋白鸟苷酸交换活性特征的报道,并且FGD6蛋白的三维结构对其鸟苷酸交换活性影响的分子生物学机制有待阐明。本论文首先研究了FGD6蛋白体外的鸟苷酸交换活性、以及FGD6蛋白与CDC42蛋白相互作用的特征,然后通过X射线晶体学的方法解析了FGD6蛋白DH结构域的三维结构,并找出了影响FGD6蛋白鸟苷酸交换活性的关键性氨基酸残基,从而阐述FGD6蛋白鸟苷酸交换活性特征的结构生物学机制。本论文的主要研究结果总结如下:1、FGD6-DH结构域的表达和纯化。利用原核表达系统表达人源FGD6蛋白的DH结构域（第875-1059位氨基酸）,进一步通过亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化得到了大量、高纯度的FGD6-DH蛋白。2、FGD6-DH的鸟苷酸交换活性研究。将FGD6-DH蛋白与带荧光标记的mant GDP-CDC42和mant GDP-Rac1蛋白共同孵育检测FGD6-DH的鸟苷酸交换活性。结果发现,在2.5μM～100μM浓度范围内,没有检测到FGD6-DH蛋白对Rac1的鸟苷酸交换活性。只有当浓度增加至50μM～100μM时,FGD6-DH才对CDC42蛋白表现出微弱的鸟苷酸交换活性。3、FGD6-DH与CDC42蛋白的相互作用。利用等温滴定量热技术检测FGD6-DH与CDC42蛋白的相互作用,FGD6-DH和CDC42相互作用的解离平衡常数KD=1.625±0.265μM,属于中等强度的相互作用。FGD6-DH与CDC42结合反应中的焓变（△H）为-51.2±6.2 k J/mol,自由能变化（△G）为-32.1±0.4 k J/mol,表明结合反应能自发进行,并且主要是由焓变驱动的热力学反应。4、FGD6-DH的三维结构解析和结构分析。（1）首先利用X射线晶体学方法解析FGD6-DH的三维结构,其晶体空间群为P41,晶体最终修正分辨率达到1.5?,FGD6-DH结构域由6个α螺旋组成一个紧凑的α螺旋束。整个α螺旋束形成一个“躺椅”形状的空间结构,α螺旋4和α螺旋5之间的“U”字形loop组成了“躺椅”的“椅背”。（2）FGD6-DH的最后一个α6的螺旋发生弯折,其Ala1054-Asn1058彻底占据了CDC42蛋白的位置,破坏了α6螺旋与CDC42蛋白switch II结构域内的相互作用,使得整个FGD6的DH结构域与CDC42蛋白相互作用减弱。（3）FGD6-DH的“椅背”区域内FGD6-Leu1013是特异性识别CDC42蛋白的关键性残基,亮氨酸的侧链与CDC42-Phe56的苯环发生疏水相互作用,决定了FGD6对CDC42的选择性。（4）FGD6-Val889残基无法与CDC42蛋白的Asp38形成盐桥,导致FGD6-DH比其他鸟苷酸交换因子的DH结构域活性弱。（5）FGD6-Glu878残基可以与CDC42-Tyr32/Thr35/Val36形成广泛的氢键,是FGD6蛋白与CDC42蛋白switch I结构域发生相互作用的关键性残基,这个位置的谷氨酸突变为丙氨酸时,其鸟苷酸活性进一步减弱。5、PH1结构域对FGD6-DH鸟苷酸交换活性的影响。比较FGD6-DH+PH1与FGD6-DH的鸟苷酸交换活性发现,50μM和100μM的FGD6-DH+PH1与mant GDP-CDC42共同孵育1小时后,溶液的相对荧光强度降低程度比相同浓度FGD6-DH所致相对荧光强度降低程度更大,表明PH1结构域能增强FGD6的鸟苷酸交换活性。综上所述,本论文首次发现FGD6没有促进Rac1蛋白上鸟苷酸交换的活性,仅对CDC42蛋白有比较弱的鸟苷酸交换活性,并采用等温滴定量热法首次测定了FGD6蛋白与CDC42蛋白相互作用的热力学参数。本论文利用X射线晶体学的方法解析了FGD6-DH蛋白的三维结构,通过结构分析发现FGD6-DH的最后一个α6的螺旋发生的弯折,使得整个FGD6的DH结构域与CDC42蛋白相互作用减弱;FGD6-Val889残基无法与CDC42-Asp38形成盐桥,导致FGD6-DH比其他鸟苷酸交换因子的DH结构域鸟苷酸交换活性弱;FGD6-DH的“椅背”区域FGD6-Leu1013是特异性识别CDC42蛋白的关键性残基,FGD6-Leu1013较长的侧链无法容纳Rac1蛋白的色氨酸侧链,所以FGD6只能特异性地促进CDC42蛋白上的鸟苷酸交换,却不是Rac1的鸟苷酸交换因子。本论文首次系统地研究了FGD6蛋白的鸟苷酸交换活性,并从结构生物学的角度阐述了FGD6蛋白在体外表现出鸟苷酸交换活性较弱的分子生物学机制。本论文的研究结果加深了人们对FGD6生物学功能的认识,并将为研究FGD6基因的致病机制提供结构生物学基础。
尹雅倩[8]（2020）在《针刺对卵巢储备功能减退模型大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响》文中提出背景卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve,DOR）是指卵巢内卵母细胞数目的减少和（或）质量下降,可导致生育力下降,同时伴有抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone,AMH）水平降低、窦卵泡计数（antral follicle count,AFC）减少及促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）水平升高。随着社会发展,女性面临的生活压力和工作压力逐渐加重,DOR发病率逐年上升,由此导致的不孕严重影响女性生殖健康和生活质量,给其家庭带来沉重的精神及经济负担。FSH是下丘脑-垂体-卵巢（Hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO）轴的主要激素之一,可促进颗粒细胞的增殖分化,影响卵泡的发育、成熟及排卵,影响雌激素的合成。FSH与其特异性受体（FSHR）的结合是其发挥生物学效应的基础。FSH与FSHR结合,可进一步激活环磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate,cAMP）/蛋白激酶 A（Protein kinase A,PKA）信号转导通路下游信号分子的级联放大,从而影响颗粒细胞增殖分化和卵巢性激素的合成。P450芳香化酶（P450arom）是颗粒细胞中的限速酶,P450arom催化作用使雄激素变为雌激素参与卵泡募集。临床试验显示,针刺可以降低血清FSH水平,提高血清雌二醇（Estradiol,E2）水平,通过调整异常的性激素水平而起到改善卵巢储备功能的作用。动物实验也表明,针刺可调整HPO轴的紊乱状态,一定程度上使分泌过多的下丘脑促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone,GnRH）水平恢复正常。FSH-cAMP信号通路对卵泡发育和卵巢功能十分关键,但基于该信号通路的针刺方面的研究较少。本实验从HPO轴整体调控及卵巢局部FSH-cAMP信号通路两个层面初步探索针刺治疗DOR的作用机制。目的探索针刺对DOR模型大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响。方法实验一:DOR动物模型的建立及验证20 只清洁级（Specific Pathogen Free,SPF）级雌性 Sprague Dawley（SD）大鼠,其中,3月龄大鼠10只,9月龄退役种鼠10只。3月龄大鼠作为对照（Control）组,9月龄退役种鼠作为DOR模型组。常规观察大鼠每日的阴道涂片以确定动情周期,选择处于动情间期的大鼠取材。ELISA法检测血清性激素（FSH、LH、E2、AMH、抑制素B（INH-B））水平、冰冻切片HE染色方法确定左侧卵巢窦卵泡计数。实验二:针刺对DOR大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响40只清洁级（Specific Pathogen Free,SPF）级雌性SD大鼠,其中,3月龄大鼠10只,9月龄退役种鼠30只。3月龄大鼠作为对照组（Control组）,9月龄退役种鼠依据动情间期眼眶血FSH水平,区组随机分为三组:DOR模型组（DOR组）、束缚组（DOR+res组）、针刺组（DOR+acu组）。Control组及DOR组不予干预,DOR+res抓取后放置高台作为束缚固定,DOR+acu组针刺后放置高台,取穴为百会、关元、次髎穴,隔日一次,每次针刺20分钟,共针刺10次。常规观察大鼠每日的阴道涂片以确定动情周期。实验干预结束后选择处于动情间期的大鼠取材。ELISA法检测血清性激素（FSH、LH、E2、AMH、抑制素B（INH-B））水平、下丘脑GnRH含量、垂体FSH和LH含量及卵巢组织cAMP含量。Western Blot法检测卵巢组织FSHR蛋白的相对含量。实时荧光PCR法检测卵巢组织的FSHR mRNA及P450 mRNA相对含量。冰冻切片HE染色方法确定左侧卵巢的形态学改变及窦卵泡计数。结果实验一:DOR动物模型的建立及验证1.动情周期与Control组相比,DOR组大鼠动情周期紊乱率显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2.血清激素水平与Control组相比,DOR组大鼠的血清FSH水平明显升高,E2、AMH水平明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。血清LH、INH-B未见统计学差异（P>0.05）。3.窦卵泡计数与Control组相比,DOR组大鼠的窦卵泡数量明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。实验二:针刺对DOR大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响1.针刺对DOR大鼠HPO轴的影响（1）下丘脑组织GnRH含量:与control组相比,DOR组大鼠下丘脑组织中GnRH水平显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。与DOR组相比,DOR+res组和DOR+acu组的GnRH水平显着降低,差异有显着统计学意义（P<0.01）。与DOR+res组相比,DOR+acu组的GnRH水平显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）垂体组织FSH和LH含量:四组大鼠垂体组织FSH及LH含量的组间两两比较均未见统计学差异（P>0.05）。（3）针刺对DOR大鼠卵巢储备功能的影响:①动情周期紊乱率:与control组相比,DOR组大鼠动情周期紊乱率明显升高,差异有统计学意义（P<0.01）。与DOR组相比,DOR+res组动情周期紊乱率呈升高趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;DOR+acu组动情周期紊乱率呈降低趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。与DOR+res组相比,DOR+acu组动情周期紊乱率显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）。②卵巢组织形态学改变:Control组大鼠卵巢切面皮质较连续,卵泡中颗粒细胞排列紧密,髓质较致密,血管形态完好。DOR组大鼠的卵巢切面皮质不连续,卵泡中颗粒细胞排列紊乱,髓质较稀疏,血管形态不完整。DOR+res组卵巢切面皮质连续性较差,颗粒细胞层连续性欠佳,髓质松散,血管分布较少。DOR+acu组卵巢切面皮质较连续,卵巢颗粒细胞层有增多趋势,髓质结构较稀松散,血管分布较少。③窦卵泡计数:与control组相比,DOR组窦卵泡计数显着减少,差异有统计学意义（P<0.05）。DOR组、DOR+res组和DOR+acu组三组之间窦卵泡数未见显着差异（P>0.05）。④血清性激素水平:与control组相比,DOR组大鼠血清FSH和LH水平显着升高,AMH和E2水平显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）,但INH-B水平未见显着差异（P>0.05）。与DOR组相比,DOR+res组血清5种激素水平均未见显着差异（P>0.05）。与DOR组相比,DOR+acu组血清FSH水平显着降低,E2和AMH水平显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）,其余2种激素水平未见显着差异（P>0.05）。与DOR+res组相比,DOR+acu组血清5种激素水平均未见显着差异（P>0.05）。2.针刺对DOR大鼠FSH-cAMP信号通路的影响:（1）卵巢组织FSHR相对表达量:与control组相比,DOR组大鼠卵巢组织FSHR蛋白相对表达量显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。与DOR组相比,DOR+res组大鼠卵巢组织FSHR蛋白相对表达量未见显着差异（P>0.05）。与DOR和DOR+res组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织FSHR蛋白相对表达量均显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。（2）卵巢组织FSHR mRNA及P450 mRNA相对表达量:①FSHR mRNA相对表达量改变:与Control组相比,DOR组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。与DOR组相比,DOR+res组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量未见显着差异（P>0.05）。与DOR组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量显着升高,差异有统计学意义（P<0.05）。与DOR+res组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织FSHR mRNA相对表达量未见显着差异（P>0.05）。②P450 mRNA相对表达量改变:与Control组相比,DOR组大鼠卵巢组织P450 mRNA相对表达量显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。与DOR组相比,DOR+res组和DOR+acu组大鼠卵巢组织P450 mRNA相对表达量均显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。与DOR+res组相比,DOR+acu组大鼠卵巢组织P450 mRNA相对表达量未见显着差异（P>0.05）。（3）卵巢组织cAMP含量:与Control组相比,DOR组大鼠卵巢组织的cAMP含量显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。与DOR组相比,DOR+res组大鼠卵巢组织的cAMP含量均未见显着差异（P>0.05）。与DOR组及DOR+res组相比,DOR+acu组卵巢组织的cAMP含量显着升高,差异有统计学意义（P<0.01）。结论1.与三月龄雌性大鼠相比,九月龄SD大鼠雌性退役种鼠的卵巢储备功能明显减退,可作为DOR动物模型。2.针刺可降低DOR大鼠下丘脑组织GnRH含量。3.针刺可通过调整紊乱的动情周期及异常的性激素水平一定程度上改善DOR大鼠的卵巢储备功能。4.卵巢颗粒细胞FSH-cAMP信号转导通路可能参与针刺对DOR大鼠卵巢储备功能的调控,该部分结果还需进一步验证。
杨国元[9]（2020）在《探究“膝痛康”治疗膝骨关节炎在关节形态与炎性因子方面作用机制》文中进行了进一步梳理目的:探究“膝痛康”治疗膝骨关节炎在关节形态与炎性因子方面作用机制。材料与方法:1.利用整合药理学对本方主要药物成分与骨关节炎作用靶点进行预测,探究本方核心基因功能和核心信号通路,阐述本方治疗骨关节炎的分子机制。2.将40只健康的SD大鼠,随机分为空白组（蒸馏水,1ml/100g/d）,模型组（蒸馏水,1ml/100g/d）,对照组（壮骨关节丸,1.2g/kg/d）,实验组（膝痛康,5g生药/kg/d）。除空白组,其余各组采用前交叉韧带离断法进行膝骨关节炎造模。给药四周后,对大鼠KOA模型进行实验研究,标本处理后采用HE染色,甲苯胺蓝染色,Masson染色,观察软骨细胞结构及形态变化,并进行软骨Mankin’s评分。采取ELISA法观察血清中TNF-α,IL-1β,PGE2的变化。结果:1.利用整合药理学平台得到膝痛康与膝骨关节炎的药物疾病共有靶标为GNAS,PTGS2。2.利用整合药理学平台得到膝痛康治疗膝骨关节炎核心基因功能20条,核心通路20条。3.实验组软骨细胞的结构、排列、形态、细胞基质及胶原蛋白等方面,在HE染色,甲苯胺蓝染色,Masson染色上均有改善,实验组Mankin’s评分优于模型组及对照组（P<0.01）。4.实验组与模型组对比,实验组血清中TNF-α、IL-1β、PGE2的水平明显下调（P<0.01）,与对照组相比,实验组血清中TNF-α（P<0.01）、IL-1β（P<0.05）、PGE2（P<0.01）水平明显下调。结论:1.利用整合药理学平台得到膝痛康与膝骨关节炎的药物疾病共有靶标为GNAS,PTGS2。2.膝痛康可改善模型大鼠关节软骨Mankin’s评分,减缓软骨破坏,对关节软骨具有保护作用。3.膝痛康可降低模型大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平,减轻膝骨关节的炎症反应。4.膝痛康可降低模型大鼠血清中PGE2水平,具有镇痛作用。5.膝痛康可改善模型大鼠关节软骨的损伤,抑制炎症反应,具有镇痛作用,这可能与抑制IL-1β、TNF-α、PGE2的表达有关。
杨登辉[10]（2020）在《调控大肠杆菌CRISPR/Cas表达的功能分子发掘与机制解析》文中指出致病性大肠杆菌可引发人和动物的多种疾病,给人类健康和动物养殖带来巨大威胁。由于临床菌株对抗生素严重耐受,导致抗生素应用面临挑战。噬菌体作为一种感染细菌的病毒,可特异性裂解细菌,因而具备抗击耐药性大肠杆菌的应用前景。但是大肠杆菌在演化过程中形成了多种抵御噬菌体等外源入侵的免疫机制,其中CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated proteins）就是一种高效的细菌适应性免疫系统,该系统的激活会抑制噬菌体感染、降低噬菌体疗效、制约噬菌体的抗菌应用。大肠杆菌的CRISPR/Cas属于I-E型,其Cas蛋白由cas3基因和cse1操纵子编码,其中cas3基因编码的核酸酶负责干扰阶段外源DNA的降解,它的缺失将导致CRISPR/Cas系统免疫功能的沉默。因此,聚焦cas3基因,挖掘调控CRISPR/Cas的功能分子,不仅有利于精确解析大肠杆菌如何高效、合理利用CRISPR/Cas系统发挥免疫功能,而且能够为采取措施突破CRISPR/Cas防御屏障,提升噬菌体疗效提供更多的靶标分子。据此,本研究以大肠杆菌K-12 MG1655为模式菌株,通过发掘调控cas3基因的功能分子,系统解析相关分子调节cas3表达和影响噬菌体复制的分子基础及调控机制,为利用噬菌体防控耐药性大肠杆菌感染提供理论依据。为了发掘调控大肠杆菌CRISPR/Cas系统cas3基因的功能分子,本文首先通过压力诱导的方式,诱导大肠杆菌MG1655产生萘啶酸抗性,并使用lac Z报告基因的编码区替换cas3基因编码区,成功构建具有萘啶酸抗性的大肠杆菌报告菌株。随后,采用转座子随机突变技术,利用接合转移导入Tn5转座子,通过检测β-半乳糖苷酶活性,结合q RT-PCR分析,筛选因转座子插入导致cas3启动子活性出现差异的菌株。最终在2820个突变株中筛选到4株cas3启动子活性差异较大的突变株,并使用染色体步移方法成功鉴定出相关失活基因为gcv P、atp D、kdp A和waa R,提示这些基因能够直接或间接调控cas3的表达,为进一步研究cas3的调控机制提供了基础。为了筛选直接调控cas3基因的功能分子,采用DNA pull-down技术筛选cas3启动子的互作蛋白,共获得71个具有与cas3启动子结合潜能的蛋白。基于蛋白的功能和相对含量,选择Icl R转录因子调控家族Kdg R蛋白和CRP（c AMP receptor protein,CRP）蛋白进行研究。其中,Kdg R蛋白能够与cas3启动子结合,但调控能力微弱;CRP蛋白不仅能够结合cas3启动子,而且能够激活cas3的表达,具有重要的研究价值。基于转座子随机突变和DNA pull-down的筛选结果,本文重点聚焦gcv P和crp基因的功能研究。为了阐明gcv P和crp基因调控cas3表达的具体分子机制,构建了gcv P和crp基因缺失和回补株,通过检测相应的表型变化探究其生物学功能。研究发现,gcv P作为gcv THP操纵子的重要组成元件,参与编码甘氨酸裂解系统（Glycine cleavage system,GCS）,通过催化甘氨酸产生的N5,N10-亚甲基四氢叶酸(N5,N10-methylene tetrahydrofolate,N5,N10-m THF)促进cas3的表达;然而在crp基因缺失时,GCS则不能调控cas3的表达。同时发现,CRP可与c AMP互作形成c AMP-CRP复合物,进而结合于cas3启动子区（ATGAGCAGN7AAATAGCCCGCTG）促进cas3表达;研究显示,在CRISPR/Cas系统激活时,GCS或CRP的缺失会导致CRISPR/Cas系统的免疫功能显着减弱,大肠杆菌对噬菌体感染的敏感性显着提升。上述结果提示,GCS和CRP通过协同调控cas3表达来影响细菌对噬菌体的敏感性,且GCS对CRISPR/Cas系统的调控作用由c AMP-CRP介导。不仅如此,鉴于不同密度细菌的胞内c AMP水平存在差异,而c AMP为CRP蛋白发挥功能所依赖,且在其它细菌中已发现不同密度细菌的cas基因的表达水平存在差异,提示大肠杆菌的密度感应（Quorum sensing,QS）系统与CRISPR/Cas系统间可能存在相关性。为了明确大肠杆菌CRISPR/Cas系统是否受QS系统的调控,本文针对QS系统中信号分子AI-2合成基因lux S以及调控基因lsr R对CRISPR/Cas系统的调控功能进行分析。研究发现,QS系统lsr R的缺失导致CRISPR/Cas系统中cse1操纵子的表达水平降低。不仅如此,lsr R的缺失导致cse1操纵子抑制基因hns表达水平的提高。结果表明,QS系统中lsr R能够通过调控hns的表达来影响CRISPR/Cas系统cse1的表达。为了进一步拓展对CRISPR/Cas系统cas操纵子的研究,本文对基于转座子随机突变技术筛选的另一基因atp D调控cas操纵子及噬菌体复制的相关机制进行了解析。研究发现,Atp D蛋白属于ATP合酶β亚基,ATP合酶的功能沉默能够导致CRISPR/Cas系统cse1和cas3的表达水平显着下降,进而导致CRISPR/Cas系统对噬菌体抵御功能的丧失。进一步深入研究发现,ATP合酶影响大肠杆菌抵御噬菌体复制,除了通过CRISPR/Cas系统介导外,还能通过调控大肠杆菌LPS核心多糖合成基因waa C的表达影响噬菌体吸附,亦可通过调控噬菌体DNA的注入、压力应激因子rpo S的表达以及调控胞内ATP含量影响噬菌体的复制。为了探究基于大肠杆菌模式菌株K-12 MG1655发现的调控机制能否适用于致病性大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas系统。本文分离鉴定了大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体,并利用分离的噬菌体测试了O157:H7中CRISPR/Cas的功能及CRP的调控作用。结果显示,大肠杆菌O157:H7与K-12相比,虽然其cas3蛋白一致性仅为29%,但靶向质粒的导入能够激活大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas系统,发挥抵抗噬菌体的功能;CRP蛋白的过表达可导致cas3表达水平的下降和噬菌体复制能力的提高。表明CRP蛋白对大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas系统同样具有调控作用。综上所述,本文成功发掘了具有调控大肠杆菌CRISPR/Cas系统功能的相关蛋白,初步阐明了GCS、CRP和ATP合酶调控大肠杆菌CRISPR/Cas系统表达及噬菌体复制的分子机制,证实了大肠杆菌QS系统对CRISPR/Cas系统具有调控作用,明确了CRP蛋白对致病性大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas系统具有调控功能,为突破CRISPR/Cas系统防御屏障,提高噬菌体的临床抗菌治疗效果提供了理论依据。
二、HPO结构与受体结合功能关系的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HPO结构与受体结合功能关系的初步研究（论文提纲范文）
（1）PLA2R胞外结构域与PAHs体外相互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 自身免疫性疾病 |
| 1.2 特发性膜性肾病 |
| 1.2.1 膜性肾病 |
| 1.2.2 膜性肾病的特异性抗原 |
| 1.2.3 磷脂酶A2受体(PLA2R) |
| 1.2.4 IMN发病机理综述 |
| 1.3 多环芳烃 |
| 1.3.1 多环芳烃 |
| 1.3.2 多环芳烃在人体的酶促代谢 |
| 1.3.3 多环芳烃在自身免疫性疾病关系 |
| 1.4 等温滴定量热在生物分子相互作用的应用 |
| 1.5 本论文的研究内容与研究思路 |
| 1.6 本论文的立题目的和意义 |
| 2 PLA2R部分胞外结构域原核体系表达纯化及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 主要实验材料 |
| 2.2.3 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PLA2R部分胞外结构域表达载体的构建 |
| 2.3.2 PLA2R部分胞外结构域诱导表达 |
| 2.3.3 PLA2R部分胞外域重组蛋白纯化 |
| 2.3.4 肠激酶表达载体的构建 |
| 2.3.5 肠激酶表达载体的诱导表达 |
| 2.3.6 肠激酶重组蛋白纯化 |
| 2.3.7 圆二色光谱表征蛋白二级结构 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 CTLD1表达载体构建、纯化及表征 |
| 2.4.2 CysR-FNII-CTLD1、Cys R-CTLD1-CTLD7表达载体构建及纯化 |
| 2.4.3 CysR-FNII-CTLD1-CTLD7表达载体构建及纯化 |
| 2.5 小结 |
| 3 同CTLD1相互作用的多环芳烃种类及结合表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 主要实验材料 |
| 3.2.3 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 ITC测定CTLD1与多环芳烃相互作用 |
| 3.3.2 圆二色光谱表征多环芳烃与CTLD1混合物 |
| 3.4 实验结论 |
| 3.4.1 筛选同CTLD1蛋白结合的多环芳烃 |
| 3.4.2 CTLD1蛋白与多环芳烃结合性质 |
| 3.4.3 CTLD1蛋白与多环芳烃混合物圆二色表征 |
| 3.5 小结 |
| 4 CTLD1及其同PAHs复合物晶体生长条件筛选、优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验器材 |
| 4.2.2 主要实验材料 |
| 4.2.3 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 CTLD1蛋白晶体条件初筛 |
| 4.3.2 CTLD1蛋白结晶初筛条件优化 |
| 4.3.3 CTLD1-PAHs复合物共结晶 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CTLD1蛋白结晶条件初筛 |
| 4.4.2 CTLD1蛋白晶体培养条件优化 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 附录内容名称 |
| 致谢 |
（2）基于磷酸镁水合过程的电化学及其分析应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 磷酸镁的种类 |
| 1.2.1 三水合磷酸氢镁 |
| 1.2.2 磷酸镁 |
| 1.2.3 三水合氢氧磷酸二镁 |
| 1.3 镁盐的水合与相转变过程 |
| 1.4 磷酸盐参与的电化学研究 |
| 1.4.1 磷酸盐参与的电化学传感器 |
| 1.4.2 磷酸盐参与的电催化反应 |
| 1.5 电化学检测磷酸根 |
| 1.6 本文的立题依据和主要研究内容 |
| 第二章 磷酸镁相转变机制的探讨 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与办法 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 磷酸镁的制备 |
| 2.2.4 磷酸镁的表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 pH对磷酸镁形成的影响 |
| 2.3.2 镁磷比对磷酸镁形成的影响 |
| 2.3.3 磷酸镁相转变过程探究 |
| 2.3.4 基于核磁共振在线监测的磷酸镁相转变机制研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于磷酸镁水合过程直接电化学法检测磷酸根 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验药品 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 电化学测试 |
| 3.2.4 MgPs/MWCNTs/Nafion修饰电极的制备 |
| 3.2.5 MgPs/MWCNTs/Nafion的表征 |
| 3.2.6 尿液和唾液磷酸根离子的测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 MgPs/MWCNTs/Nafion的制备与表征 |
| 3.3.2 基于MgPs/MWCNTs/Nafion水合过程的电化学研究 |
| 3.3.3 用于磷酸根离子测定的电化学条件优化 |
| 3.3.4 MgPs/MWCNTs/Nafion电化学测定磷酸根离子 |
| 3.3.5 MgPs/MWCNTs/Nafion电极在体液中的分析检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于富含Mg~(2+)磷酸镁水合过程的电化学氧化研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验药品 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 MgPs/MWCNTs/Nafion修饰电极的制备 |
| 4.2.4 MgPs/MWCNTs/Nafion电极的表征 |
| 4.2.5 电化学测试装置和方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 MgPs/MWCNTs/Nafion的表征 |
| 4.3.2 MgPs/MWCNTs/Nafion电极在不同缓冲溶液中的电化学响应 |
| 4.3.3 不同培养时间对MgPs/MWCNTs/Nafion的电化学响应的影响 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 主要结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 展望 |
| 5.3 本文的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）隔药灸对肾阳虚证多囊卵巢综合征患者的疗效及血清IGF-1水平影响的临床观察（论文提纲范文）
| 中英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 临床研究 |
| 1 临床资料 |
| 1.1 研究病例来源 |
| 1.2 西医诊断标准 |
| 1.3 中医辨病辨证标准 |
| 1.4 纳入标准 |
| 1.5 排除标准 |
| 1.6 病例中止、剔除标准 |
| 1.7 病例脱落标准 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 分组方法 |
| 2.2 治疗方法 |
| 2.3 技术路线图 |
| 3 观察指标 |
| 4 疗效评定标准 |
| 5 统计方法 |
| 6 伦理学要求 |
| 7 结果分析 |
| 7.1 基本资料统计分析 |
| 7.2 临床研究结果统计分析 |
| 7.3 安全性分析 |
| 讨论 |
| 1 中医学对PCOS的认识 |
| 1.1 中医病名 |
| 1.2 病因病机 |
| 1.3 治疗 |
| 2 现代医学对PCOS的相关研究 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 流行病学调查 |
| 2.3 发病机制的研究 |
| 2.4 治疗 |
| 3 课题设计思路 |
| 3.1 立题思路 |
| 3.2 中医对PCOS的病因、病机、治疗方法的再认识 |
| 3.3 穴位的选择 |
| 3.4 隔药灸的选择 |
| 4 研究结果及分析 |
| 4.1 治疗前分析 |
| 4.2 治疗后结果及分析 |
| 5 机理探讨 |
| 5.1 隔药灸改善肾阳虚证PCOS患者症候的依据 |
| 5.2 隔药灸下调肾阳虚证PCOS患者血清IGF-1 水平的机理探讨 |
| 5.3 隔药灸改善肾阳虚证PCOS患者性激素水平的机理探讨 |
| 6 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 针灸治疗多囊卵巢综合征的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）β-葡萄糖苷酶对人参皂苷生物转化及其相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 人参皂苷概述 |
| 1.1.1 人参皂苷的分类及结构 |
| 1.1.2 人参皂苷的生理活性 |
| 1.1.3 人参皂苷的生物转化 |
| 1.2 β-葡萄糖苷酶概述 |
| 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的分类 |
| 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的结构与催化机制 |
| 1.2.3 β-葡萄糖苷酶在食品工业中的应用 |
| 1.3 酶与底物相互作用的研究方法概述 |
| 1.3.1 紫外-可见分光光度法 |
| 1.3.2 荧光光谱法 |
| 1.3.3 表面等离子共振法 |
| 1.3.4 圆二色光谱法 |
| 1.3.5 生物信息学方法 |
| 1.4 研究意义与内容 |
| 1.4.1 研究目的及意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究技术路线 |
| 第2章 β-葡萄糖苷酶全基因合成、表达纯化及生物信息学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 缓冲液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 目的基因合成及密码子优化 |
| 2.3.2 重组质粒的酶切验证 |
| 2.3.3 重组质粒转化感受态细胞 |
| 2.3.4 重组β-葡萄糖苷酶的诱导表达及纯化 |
| 2.3.5 重组β-葡萄糖苷酶的鉴定 |
| 2.3.6 β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析方法 |
| 2.3.7 序列同源性比对 |
| 2.3.8 构建系统进化树 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 目的基因密码子优化及全基因合成 |
| 2.4.2 重组β-葡萄糖苷酶的表达、纯化及鉴定 |
| 2.4.3 β-葡萄糖苷酶生物信息学分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 多光谱方法及分子模拟探究β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用模式 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用荧光光谱测定 |
| 3.3.2 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用紫外-可见光谱测定 |
| 3.3.3 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1的非辐射能量转移 |
| 3.3.4 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用同步荧光光谱测定 |
| 3.3.5 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用三维荧光光谱测定 |
| 3.3.6 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用圆二色光谱的测定 |
| 3.3.7 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用局域表面等离子共振法测定 |
| 3.3.8 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用红外光谱测定 |
| 3.3.9 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用动态光散射测定 |
| 3.3.10 重组β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用Zeta电位测定 |
| 3.3.11 分子对接 |
| 3.3.12 分子动力学模拟 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 人参皂苷Rb_1对β-葡萄糖苷酶的荧光猝灭研究 |
| 3.4.2 β-葡萄糖苷酶和人参皂苷Rb_1的紫外—可见光谱研究 |
| 3.4.3 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1的非辐射能量传递 |
| 3.4.4 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用的同步荧光光谱 |
| 3.4.5 β-葡萄糖苷酶-人参皂苷Rb_1体系三维荧光光谱 |
| 3.4.6 β-葡萄糖苷酶及其与人参皂苷Rb_1相互作用的圆二色光谱 |
| 3.4.7 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1结合作用分析 |
| 3.4.8 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用的红外光谱 |
| 3.4.9 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用前后粒径变化 |
| 3.4.10 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1相互作用前后Zeta电位变化 |
| 3.4.11 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷的分子对接结果分析 |
| 3.4.12 β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb_1分子动力学模拟结果分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 重组β-葡萄糖苷酶的酶学性质探究及其对人参皂苷Rb_1的生物转化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 p NP标准曲线的制定 |
| 4.3.2 溶液中温度及p H对重组β-葡萄糖苷酶活力的影响 |
| 4.3.3 溶液中离子及化学试剂对重组β-葡萄糖苷酶活力的影响 |
| 4.3.4 重组β-葡萄糖苷酶催化动力学参数的测定 |
| 4.3.5 重组β-葡萄糖苷酶对底物的选择性研究 |
| 4.3.6 超高效液相色谱(UPLC)检测方法的建立 |
| 4.3.7 重组β-葡萄糖苷酶对人参皂苷Rb_1的转化 |
| 4.3.8 超高效液相色谱(UPLC)分析 |
| 4.3.9 三重四极杆线性离子阱串联质谱分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 重组β-葡萄糖苷酶的纯化及酶活分析 |
| 4.4.2 温度及pH对重组β-葡萄糖苷酶活力的影响 |
| 4.4.3 重组β-葡萄糖苷酶动力学参数 |
| 4.4.4 重组β-葡萄糖苷酶的底物特异性分析 |
| 4.4.5 超高效液相色谱法检测人参皂苷 |
| 4.4.6 重组β-葡萄糖苷酶生物转化人参皂苷Rb_1途径解析 |
| 4.4.7 质谱法检测单体人参皂苷的裂解规律 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 人参皂苷PPD(S,R)及PPT(S,R)与雌激素受体结合作用及构-效关系探究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ERα-LBD融合表达载体构建及重组蛋白的表达纯化与鉴定 |
| 5.3.2 基于ERα-LBD的人参皂苷荧光偏振检测方法 |
| 5.3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 5.3.4 hERα-LBD与人参皂苷相互作用的计算机模拟 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 重组蛋白hERα-LBD的鉴定 |
| 5.4.2 荧光偏振法探究人参皂苷与hERα-LBD结合能力 |
| 5.4.3 双荧光素酶报告基因实验探究人参皂苷对ERα的转录调控作用 |
| 5.4.4 人参皂苷与hERα-LBD结合的结构基础 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口腔颌面部骨的形成和缺损修复 |
| 1.1.1 口腔颌面部骨的形成与自修复过程 |
| 1.1.2 口腔颌面部骨缺损疾病的治疗方法 |
| 1.2 口腔颌面部骨组织工程概述 |
| 1.2.1 骨组织工程中的种子细胞 |
| 1.2.2 骨组织工程中常用的生长因子及其功能简介 |
| 1.2.3 骨组织工程中常用的支架体系 |
| 1.3 骨缺损修复材料简介 |
| 1.3.1 骨修复材料的研究现状及性能要求 |
| 1.3.2 天然及人工合成的骨修复材料 |
| 1.3.3 骨组织中的羟基磷灰石 |
| 1.3.4 用于骨再生的支架材料 |
| 1.3.5 稀土在生物医学材料中的作用 |
| 1.4 本论文的设计思路和技术路线 |
| 1.4.1 设计思路 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 碳酸化及稀土掺杂的羟基磷灰石仿生骨粉的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 钙-磷-碳酸体系的热力学平衡相图计算 |
| 2.3.2 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的制备 |
| 2.3.3 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的结构表征 |
| 2.3.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.3.5 形貌与化学组成分析 |
| 2.3.6 碳酸化羟基磷灰石纳米骨粉的稀土荧光标记检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 模拟生物矿化环境下的钙-磷-碳酸根热力学平衡相图与矿化因素 |
| 2.4.2 碳酸化羟基磷灰石材料的结构 |
| 2.4.3 碳酸化及矿化环境调控对羟基磷灰石形貌的影响 |
| 2.4.4 碳酸根取代度的确定 |
| 2.4.5 稀土离子标记的碳酸化羟基磷灰石可控制备及光谱性质 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞实验检测稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石材料的生物学性能 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MC3T3-E1 细胞培养 |
| 3.3.2 使用荧光染色观察细胞形态 |
| 3.3.3 使用CCK-8 法检测细胞增殖 |
| 3.3.4 使用活细胞/死细胞染色检测细胞的生长活性 |
| 3.3.5 使用碱性磷酸酶染色检测ALP活性 |
| 3.3.6 使用ALP定量检测试剂盒检测ALP活性 |
| 3.3.7 茜素红染色检测细胞形成的钙结节 |
| 3.3.8 Western blot检测各组材料对细胞成骨分化的影响 |
| 3.3.9 使用三维打印机打印支架 |
| 3.3.10 支架的形貌及成份表征 |
| 3.3.11 扫描电镜检测细胞在支架上的黏附 |
| 3.3.12 使用CCK-8 检测细胞在支架上的增殖 |
| 3.3.13 使用活细胞/死细胞染色检测细胞在支架上的生长活性 |
| 3.3.14 使用ALP染色检测支架上细胞的ALP活性 |
| 3.3.15 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 MC3T3-E1 细胞的培养 |
| 3.4.2 各组材料浸提液对细胞形态的影响 |
| 3.4.3 各组材料浸提液对细胞增殖的影响 |
| 3.4.4 各组材料浸提液对细胞生长活性的影响 |
| 3.4.5 各组材料浸提液对细胞ALP染色的影响 |
| 3.4.6 各组材料浸提液对细胞ALP活性影响的定量分析 |
| 3.4.7 各组材料浸提液对细胞体外矿化的影响 |
| 3.4.8 各组材料浸提液对细胞分泌成骨特异性蛋白的影响 |
| 3.4.9 三维打印支架的宏观外形 |
| 3.4.10 三维打印支架的微观形貌、组分表征 |
| 3.4.11 细胞在各组三维打印支架上的黏附 |
| 3.4.12 细胞在各组三维打印支架上的增殖 |
| 3.4.13 细胞在各组三维打印支架上的生长活性 |
| 3.4.14 细胞在各组三维打印支架上的ALP活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 稀土掺杂及碳酸根取代的羟基磷灰石支架促大鼠颅骨缺损修复的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 大鼠颅骨缺损模型建立及分组 |
| 4.3.2 术后大体观察 |
| 4.3.3 术后影像学观察 |
| 4.3.4 组织学观察染色 |
| 4.3.5 Masson染色 |
| 4.3.6 体内生物安全性评价 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大鼠临界骨缺损模型的建立 |
| 4.4.2 动物处死后标本的获取 |
| 4.4.3 动态Micro-CT观察缺损颅骨的修复 |
| 4.4.4 术后组织学检测 |
| 4.4.5 Masson染色表征 |
| 4.4.6 支架促血管再生 |
| 4.4.7 支架的体内安全性结果分析 |
| 4.4.8 支架促成骨性能讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 本论文的主要创新点 |
| 5.2 全文结论 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（6）家蚕ENF肽结合蛋白识别配体ENF肽的结构基础和分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 ENF肽的研究 |
| 1.1.1 ENF肽的发现及其结构 |
| 1.1.2 ENF肽的生理功能 |
| 1.2 ENF肽结合蛋白的研究 |
| 1.3 家蚕的ENF肽结合蛋白的研究情况 |
| 1.4 蛋白质结构解析技术 |
| 1.4.1 核磁共振技术 |
| 1.4.2 冷冻电镜技术 |
| 1.4.3 X-射线衍射技术 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景、目的及意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 家蚕ENF肽结合蛋白的晶体获得与三维结构解析 |
| 3.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA 的提取与c DNA 的制备 |
| 3.2.2 目的基因的克隆及重组载体构建 |
| 3.2.3 重组蛋白少量表达检测 |
| 3.2.4 重组蛋白大量表达、纯化 |
| 3.2.5 硒代蛋白的制备 |
| 3.2.6 蛋白的筛选与优化 |
| 3.2.7 防冻剂的配置、晶体捞取及保存 |
| 3.2.8 晶体衍射数据的收集与处理 |
| 3.2.9 晶体结构的解析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 BmENF-BP 的原核表达载体构建及重组BmENF-BP 的小量表达检测 |
| 3.3.2 重组BmENF-BP的表达纯化 |
| 3.3.3 BmENF-BP结晶条件的筛选与优化 |
| 3.3.4 ENF肽结合蛋白三维结构解析 |
| 3.3.5 ENF肽结合蛋白N端结构域的三维结构 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 家蚕ENF肽结合蛋白与底物结合位点分析 |
| 4.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 复合体蛋白载体构建及表达纯化 |
| 4.2.2 重组蛋白少量表达检测与大量表达纯化 |
| 4.2.3 复合体晶体筛选与优化 |
| 4.2.4 复合物X-射线衍射数据的收集与处理 |
| 4.2.5 复合物的结构解析 |
| 4.2.6 配体PP的分子对接 |
| 4.2.7 定点突变载体构建及蛋白表达纯化 |
| 4.2.8 圆二色谱测定突变体蛋白二级结构 |
| 4.2.9 变体蛋白与配体PP结合常数测定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PP与 BmENF-BP复合体的蛋白晶体的筛选、优化及X-射线衍射数据收集 |
| 4.3.2 PP-ENF-BP-N复合体载体构建、表达检测及纯化 |
| 4.3.3 PP-ENF-BP-N复合体蛋白晶体的筛选、优化及X-射线衍射数据收集 |
| 4.3.4 ENF肽结合蛋白与PP的分子对接及关键位点分析 |
| 4.3.5 定点突变载体构建及蛋白表达纯化 |
| 4.3.6 突变体蛋白二级结构测定 |
| 4.3.7 突变体蛋白与PP的结合常数 |
| 4.4 讨论与分析 |
| 第五章 家蚕ENF肽结合蛋白在PP参与的家蚕免疫应答中扮演的角色 |
| 5.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要溶液的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PP及病原菌诱导BmENF-BP和下游抗菌肽基因表达 |
| 5.2.2 PP与 BmENF-BP结合常数测定 |
| 5.2.3 PP与BmE细胞结合常数测定 |
| 5.2.4 PP、BmENF-BP及 BmE细胞免疫荧光共定位 |
| 5.2.5 免疫共沉淀鉴定PP的受体蛋白 |
| 5.2.6 质谱鉴定PP的受体蛋白 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 PP及病原菌诱导BmENF-BP和下游抗菌肽基因表达 |
| 5.3.2 ENF肽结合蛋白、BmE细胞和PP的免疫荧光共定位 |
| 5.3.3 ENF肽的受体鉴定 |
| 5.4 讨论与分析 |
| 第六章 综合与讨论 |
| 1.家蚕ENF肽结合蛋白的晶体获得与三维结构解析 |
| 2.家蚕ENF肽结合蛋白与底物结合位点分析 |
| 3.家蚕ENF肽结合蛋白在PP参与的家蚕免疫应答中扮演的角色 |
| 4.总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及参研课题 |
| 致谢 |
（7）FGD6蛋白DH和PH1结构域的结构和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 小GTP酶家族及其调节因子 |
| 1.1.1 小GTP酶家族概述 |
| 1.1.1.1 Ras家族 |
| 1.1.1.2 Rho家族 |
| 1.1.1.3 Rab家族 |
| 1.1.1.4 Arf家族 |
| 1.1.1.5 Ran家族 |
| 1.1.2 鸟苷酸交换因子 |
| 1.1.3 GTP酶激活蛋白 |
| 1.1.4 鸟苷酸解离抑制因子 |
| 1.2 Rho家族鸟苷酸交换因子 |
| 1.2.1 Dbl家族的结构特点 |
| 1.2.2 Dbl家族的核苷酸交换机制 |
| 1.2.3 DH结构域对GTPase的选择性 |
| 1.2.4 不同家族Rho GEF的 DH结构域与其鸟苷酸交换活性 |
| 1.3 FGD家族蛋白 |
| 1.3.1 FGD家族蛋白与遗传性疾病 |
| 1.3.2 FGD家族蛋白的细胞内功能 |
| 1.3.3 FGD家族蛋白鸟苷酸交换活性的调控 |
| 1.3.4 FGD家族蛋白DH结构域与鸟苷酸交换活性 |
| 1.4 本论文的主要贡献与创新 |
| 1.5 本论文的结构安排 |
| 第二章 FGD6蛋白DH结构域的表达和纯化 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 质粒和菌株 |
| 2.2.2 PCR引物 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 常用试剂和缓冲液的配制 |
| 2.2.5 实验仪器 |
| 2.2.6 重组表达载体的构建 |
| 2.2.6.1 编码序列的克隆 |
| 2.2.6.2 PCR产物的酶切和连接 |
| 2.2.6.3 阳性重组子的鉴定 |
| 2.2.6.4 重组表达载体的提取和保存 |
| 2.2.7 FGD6-DH的表达 |
| 2.2.7.1 构建表达菌株 |
| 2.2.7.2 FGD6-DH的表达 |
| 2.2.8 FGD6-DH的纯化 |
| 2.2.8.1 菌体的破碎和离心 |
| 2.2.8.2 亲和层析 |
| 2.2.8.3 切除GST标签 |
| 2.2.8.4 离子交换层析 |
| 2.2.8.5 凝胶过滤层析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 FGD6-DH的表达和纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 FGD6蛋白的体外鸟苷酸交换活性研究 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 CDC42蛋白的表达和纯化 |
| 3.2.3 制备荧光标记的CDC42蛋白 |
| 3.2.3.1 碱性磷酸酶水解CDC42蛋白 |
| 3.2.3.2 ITC测定mant GDP与 CDC42 的相互作用 |
| 3.2.3.3 制备mant GDP结合的CDC42 蛋白 |
| 3.2.3.4 CDC42 蛋白中mant GDP的加载效率检测 |
| 3.2.4 FGD6蛋白的体外鸟苷酸交换活性研究 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CDC42的表达和纯化 |
| 3.3.2 荧光标记的CDC42 |
| 3.3.2.1 mant GDP与碱性磷酸酶水解后的CDC42 的相互作用 |
| 3.3.2.2 mant GDP-CDC42中mant GDP的加载率 |
| 3.3.3 FGD6蛋白的体外鸟苷酸交换活性 |
| 3.3.4 PH1结构域对FGD6鸟苷酸交换活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 FGD6 蛋白与CDC42 的相互作用研究 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料和仪器 |
| 4.2.2 凝胶过滤层析 |
| 4.2.2.1 FGD6-DH与 CDC42 蛋白直接孵育 |
| 4.2.2.2 EDTA与 FGD6-DH和 CDC42 蛋白共同孵育 |
| 4.2.2.3 碱性磷酸酶水解CDC42 后与FGD6-DH蛋白共同孵育 |
| 4.2.3 pull-down |
| 4.2.4 等温滴定量热法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 凝胶过滤层析检测FGD6-DH与 CDC42 相互作用的结果 |
| 4.3.2 pull-down检测FGD6-DH与 CDC42 相互作用的结果 |
| 4.3.3 ITC检测FGD6-DH与 CDC42 相互作用的结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 FGD6蛋白DH结构域的结构研究 |
| 5.1 概述 |
| 5.2 实验材料和方法方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 FGD6-DH的结晶初筛 |
| 5.2.3 晶体生长条件的优化 |
| 5.2.3.1 添加剂的筛选 |
| 5.2.3.2 沉淀剂浓度的筛选 |
| 5.2.4 冻存晶体 |
| 5.2.5 数据收集和结构解析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 FGD6-DH的结晶初筛 |
| 5.3.2 最优结晶条件 |
| 5.3.3 FGD6-DH的晶体结构 |
| 5.3.3.1 FGD6-DH的总体结构 |
| 5.3.3.2 FGD6-DH与其他蛋白的DH结构域比较 |
| 5.3.3.3 与CDC42 蛋白的switch I区域的相互作用 |
| 5.3.3.4 与CDC42蛋白的补丁区域的相互作用 |
| 5.3.3.5 与CDC42 蛋白的switch II区域的相互作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 新型冠状病毒抗体检测方法的建立和初步应用 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（8）针刺对卵巢储备功能减退模型大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 卵巢储备功能减退的生物学机制研究进展 |
| 1. 下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱与卵巢储备功能减退生物学机制 |
| 2. 氧化应激参与卵巢储备功能减退生物学机制 |
| 3. 自身免疫反应参与卵巢储备功能减退生物学机制 |
| 4. 基因功能异常与卵巢储备功能减退生物学机制 |
| 5. 线粒体功能异常参与卵巢储备功能减退生物学机制 |
| 6. 脑源性神经营养因子参与卵巢储备功能减退生物学机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 针刺改善卵巢储备功能的动物学实验研究进展 |
| 1. 现有的卵巢储备功能减退模型 |
| 2. 针刺干预卵巢储备功能减退的机理研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一: DOR动物模型的建立及验证 |
| 1. 材料及方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 实验二: 针刺对DOR大鼠的HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响 |
| 1. 材料及方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）探究“膝痛康”治疗膝骨关节炎在关节形态与炎性因子方面作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 基于整合药理学预测膝痛康治疗膝骨关节炎的作用机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 膝痛康对膝骨关节炎大鼠关节形态与炎性因子的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 膝骨关节炎中西医发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（10）调控大肠杆菌CRISPR/Cas表达的功能分子发掘与机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviations) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大肠杆菌的耐药性和防治 |
| 1.1 大肠杆菌的耐药现状 |
| 1.2 大肠杆菌的噬菌体防治 |
| 2 细菌对噬菌体的抵抗机制 |
| 2.1 基于受体调控的防御机制 |
| 2.2 基于外膜囊泡的防御机制 |
| 2.3 基于密度感应调控的防御机制 |
| 2.4 限制-修饰系统 |
| 2.5 基于流产感染的防御机制 |
| 2.6 噬菌体排除系统 |
| 2.7 基于超感染免疫的防御机制 |
| 2.8 CRISPR/Cas系统 |
| 3 CRISPR/Cas系统概述 |
| 3.1 CRISPR/Cas系统的进化背景 |
| 3.2 CRISPR/Cas系统的免疫过程 |
| 3.3 CRISPR/Cas系统的功能组件与核心基因 |
| 3.4 CRISPR/Cas系统的分类 |
| 3.5 大肠杆菌CRISPR/Cas系统的作用机制 |
| 4 噬菌体与细菌CRISPR/Cas系统间的博弈 |
| 4.1 细菌基于种群密度规避噬菌体的逃逸突变 |
| 4.2 噬菌体中的抗CRISPR/Cas蛋白 |
| 4.3 大肠杆菌中H-NS和LeuO蛋白对CRISPR/Cas系统的调控作用 |
| 4.4 沙雷菌中密度感应系统对CRISPR/Cas系统的调控作用 |
| 4.5 铜绿假单胞菌中密度感应系统对CRISPR/Cas系统的调控研究 |
| 本研究的目的意义及内容 |
| 第二章 基于转座子随机突变筛选大肠杆菌中调控cas3 的基因 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试剂、仪器和耗材 |
| 1.2 实验菌株和质粒 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 大肠杆菌MG1655ΔlacZΔcas3::lacZ报告菌株的构建 |
| 2.2 大肠杆菌MG1655ΔlacZΔcas3::lacZ报告菌株转座子突变库的构建 |
| 2.3 突变库中cas3启动子活性差异菌株的初步筛选 |
| 2.4 突变库中cas3启动子活性差异菌株的二次筛选及qRT-PCR检测 |
| 2.5 突变菌株中Tn5插入失活基因的鉴定 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 大肠杆菌MG1655ΔlacZ的构建 |
| 3.2 大肠杆菌MG1655ΔlacZΔcas3::lacZ报告菌株的构建 |
| 3.3 大肠杆菌MG1655ΔlacZΔcas3::lacZ报告菌株β-半乳糖苷酶活性的测定 |
| 3.4 大肠杆菌MG1655ΔlacZΔcas3::lacZ报告菌株转座子突变库的构建 |
| 3.5 突变库中cas3启动子活性差异菌株的筛选 |
| 3.6 突变菌株中Tn5插入失活基因的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 基于DNA pull-down筛选大肠杆菌中直接调控cas3的基因 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试剂、仪器和耗材 |
| 1.2 实验菌株和质粒 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 cas3启动子活性区域的测定 |
| 2.2 cas3启动子结合蛋白的获取 |
| 2.3 cas3启动子结合蛋白的质谱分析 |
| 2.4 KdgR蛋白和TnaA蛋白分别与cas3启动子结合的功能检测 |
| 2.5 KdgR和TnaA蛋白对cas3启动子调控作用的检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 MG1655中cas3启动子活性区域的确定 |
| 3.2 cas3启动子结合蛋白的获取 |
| 3.3 cas3启动子结合蛋白的质谱分析 |
| 3.4 KdgR蛋白和TnaA蛋白的纯化 |
| 3.5 KdgR蛋白能够与cas3启动子结合 |
| 3.6 TnaA的缺失导致cas3启动子活性提升 |
| 3.7 TnaA的缺失导致cas3表达水平提升 |
| 3.8 TnaA的缺失导致CRISPR/Cas系统介导的噬菌体复制能力降低 |
| 4 讨论 |
| 第四章 大肠杆菌甘氨酸裂解系统调控cas3表达的机制解析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试剂、仪器和耗材 |
| 1.2 实验菌株和质粒 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物序列 |
| 2.2 cas3和cse1表达水平检测 |
| 2.3 CRP蛋白与cas3启动子结合的EMSA实验 |
| 2.4 CRP蛋白与cas3启动子结合区域的鉴定 |
| 2.5 GCS和CRP对CRISPR/Cas系统介导的噬菌体复制能力的影响 |
| 2.6 GCS和CRP缺失对外源质粒转化的影响 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 gcvP和gcvT通过调控cas3表达影响噬菌体复制 |
| 3.2 甘氨酸促进cas3和gcvTHP启动子的表达 |
| 3.3 N~5,N~(10)-mTHF促进cas3启动子的表达 |
| 3.4 CRP蛋白通过调控cas3表达影响噬菌体复制 |
| 3.5 CRP蛋白通过结合cas3启动子以促进cas3 的表达 |
| 3.6 GCS对cas3启动子的调控作用由CRP介导 |
| 3.7 cAMP能够恢复由GCS缺失造成的cas3启动子活性降低 |
| 3.8 H-NS蛋白对cse1操纵子的抑制不影响GCS和CRP对cas3的调控 |
| 3.9 GCS和CRP影响CRISPR/Cas系统的干扰功能 |
| 3.10 葡萄糖通过非CRISPR/Cas依赖途径影响噬菌体复制 |
| 4 讨论 |
| 第五章 大肠杆菌密度感应分子调控CRISPR/Cas机制的初步解析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试剂、仪器和耗材 |
| 1.2 实验菌株和质粒 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物序列 |
| 2.2 luxS基因和lsrR基因缺失株的构建 |
| 2.3 luxS基因缺失对cas3及cse1表达水平的影响 |
| 2.4 lsrR基因缺失对cse1表达水平的影响 |
| 2.5 hns基因缺失基础上lsrR基因缺失对cse1表达水平的影响 |
| 2.6 lsrR基因缺失对hns表达水平的影响 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 QS系统luxS基因能够影响cse1启动子活性 |
| 3.2 QS系统lsrR基因能够影响cse1启动子活性 |
| 3.3 QS系统lsrR基因通过调控hns表达影响cse1启动子活性 |
| 4 讨论 |
| 第六章 大肠杆菌ATP合酶调控CRISPR/Cas和噬菌体复制的机制解析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试剂、仪器和耗材 |
| 1.2 实验菌株和质粒 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物序列 |
| 2.2 MG1655中ATP合酶操纵子的鉴定 |
| 2.3 缺失株的构建 |
| 2.4 cas3及cse1表达水平检测 |
| 2.5 AtpD蛋白与cas3启动子结合的EMSA实验 |
| 2.6 目的基因转录水平的qRT-PCR检测 |
| 2.7 噬菌体复制和吸附能力的测定 |
| 2.8 野生株和缺失株脂多糖的鉴定 |
| 2.9 噬菌体DNA注入相对含量和复制效率的检测 |
| 2.10 野生株与atpD缺失株转录组测序 |
| 2.11 细菌胞内ATP含量的检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 ATP合酶操纵子的鉴定 |
| 3.2 ATP合酶间接调控cas3的表达 |
| 3.3 ATP合酶通过CRISPR/Cas介导或其它途径影响噬菌体复制 |
| 3.4 ATP合酶影响噬菌体的吸附 |
| 3.5 ATP合酶能够通过调控LamB和部分LPS核心多糖表达影响噬菌体复制 |
| 3.6 LPS核心多糖的部分缺失能够影响噬菌体的复制 |
| 3.7 LPS核心多糖主链的全部缺失能够影响噬菌体吸附和复制 |
| 3.8 ATP合酶影响噬菌体DNA注入效率和复制效率 |
| 3.9 ΔatpD缺失株和野生株转录组分析及验证 |
| 3.10 ATP合酶通过调控rpoS影响噬菌体复制 |
| 3.11 ATP合酶的缺失不通过降低噬菌体DNA的转录水平影响噬菌体增殖 |
| 3.12 ATP合酶的缺失导致细菌胞内ATP水平显着下降 |
| 4 讨论 |
| 第七章 致病性大肠杆菌中CRP蛋白调控CRISPR/Cas的分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 主要试剂、仪器和耗材 |
| 1.2 实验菌株和质粒 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物序列 |
| 2.2 噬菌体的分离鉴定 |
| 2.3 噬菌体的生物学特性分析 |
| 2.4 噬菌体靶向质粒的构建 |
| 2.5 Min27中cas3启动子活性的测定 |
| 2.6 Min27中CRISPR/Cas系统功能检测及CRP的调控功能检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 噬菌体的分离和鉴定 |
| 3.2 噬菌体的生物学特性分析 |
| 3.3 Min27中cas3启动子活性的测定 |
| 3.4 Min27中CRISPR/Cas系统功能检测及CRP的调控功能检测 |
| 4 讨论 |
| 第八章 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 本研究的创新点 |
| 3 全文讨论和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、HPO结构与受体结合功能关系的初步研究（论文参考文献）
- [1]PLA2R胞外结构域与PAHs体外相互作用研究[D]. 陈璐. 大连理工大学, 2021(01)
- [2]基于磷酸镁水合过程的电化学及其分析应用[D]. 陈启煊. 江南大学, 2021(01)
- [3]隔药灸对肾阳虚证多囊卵巢综合征患者的疗效及血清IGF-1水平影响的临床观察[D]. 林净. 福建中医药大学, 2021(01)
- [4]β-葡萄糖苷酶对人参皂苷生物转化及其相互作用机制研究[D]. 钟姝凝. 吉林大学, 2021(01)
- [5]含稀土碳酸化羟基磷灰石材料的制备及其应用于骨修复的实验研究[D]. 刘鹏. 吉林大学, 2021(01)
- [6]家蚕ENF肽结合蛋白识别配体ENF肽的结构基础和分子机制[D]. 徐海洋. 西南大学, 2021(01)
- [7]FGD6蛋白DH和PH1结构域的结构和功能研究[D]. 串俊兰. 电子科技大学, 2020(03)
- [8]针刺对卵巢储备功能减退模型大鼠HPO轴及FSH-cAMP信号通路的影响[D]. 尹雅倩. 中国中医科学院, 2020(01)
- [9]探究“膝痛康”治疗膝骨关节炎在关节形态与炎性因子方面作用机制[D]. 杨国元. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [10]调控大肠杆菌CRISPR/Cas表达的功能分子发掘与机制解析[D]. 杨登辉. 上海交通大学, 2020(01)