一、抗冻蛋白基因转化植物的研究展望（论文文献综述）
丁夕涵[1]（2019）在《小麦重结晶抑制蛋白IRI基因低温表达模式及启动子活性鉴定》文中研究表明低温是一个不利于植物生长和生产的非生物胁迫因素,小麦作为中国第二大的粮食作物,在中国北方地区冬季寒冷,对冬小麦越冬过程产生不利影响,所以,寒冷气候对冬小麦的影响问题是影响小麦产量的关键问题。对小麦抗寒相关基因的研究有利于提高小麦低温防御能力,可以为揭示小麦中抗低温基因表达调控机制和抗寒分子机制提供重要参考价值,有助于利用遗传转化技术改良作物品质。本研究对重结晶抑制蛋白IRI基因启动子及其构建的缺失片段的功能进行验证分析,主要研究结果如下:1.课题组前期获得的IRI基因序列,根据IRI基因家族中不同基因序列的存在的差异性,利用Primer引物设计软件设计IRI基因的特异扩增引物与内参引物,以c DNA为模板,使用经过检测的基因IRI4、IRI5、IRI6的特异性引物,进行实时荧光定量PCR实验,检测在冬小麦M808中IRI4、IRI5、IRI6基因在低温和茉莉酸甲酯处理下的表达活性。经检测发现,三个基因均在低温和茉莉酸甲酯处理下表达水平有提高,且不同基因在植物中的根、茎、叶组织中的表达水平各不同。2.课题组前期使用染色体步移的方法等到基因IRIp1,结合小麦叠连群数据库BLAST分析,最终扩增得到与IRIp1同源性较高的六条IRI基因序列,选取同源性较高的其中两条IRIp2、IRIp3。利用Plant CARE对启动子IRIp1、IRIp2、IRIp3进行顺式作用元件预测。预测结果显示启动子序列上存在MYB,MYC,G-box等相关冷响应元件MEJA应答元件,光响应元件,TATA-box和CAAT-box保守序列以及增强子等重要顺式作用元件。3.对启动子IRIp1、IRIp2、IRIp3构建八条长度不同的缺失片段GUS融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化烟草侵染实验,侵染后烟草植株低温和茉莉酸甲酯处理,结果表明对于低温和激素胁迫处理下的启动子活性各不相同,IRIp1启动子的缺失片段IRIp1-1-GUS,IRIp1-3-GUS,IRIp1-4-GUS的GUS表达活性均较强,且在低温条件下响应于茉莉酸甲酯的诱导,IRIp1-4-GUS的活性较弱;启动子IRIp2和启动子IRIp3的缺失片段在低温与茉莉酸甲酯处理下活性均不强,在低温条件下不响应于茉莉酸甲酯的诱导。4.为进一步验证启动子IRIp1的四个缺失片段在低温和茉莉酸甲酯处理下的启动子活性水平,将八条启动子缺失片段GUS融合表达载体转入拟南芥中,进行拟南芥遗传转化实验,对拟南芥T2代阳性转基因苗进行GUS染色,观察其在低温和茉莉酸甲酯处理下GUS报告基因的表达活性,结果表明IRIp1的四个缺失片段在转基因拟南芥中的染色情况与瞬时表达实验中的染色结果一致。
胡瑞芹[2]（2019）在《抗冻蛋白基因ld4提高鱼类抗寒性能的分子机制研究》文中研究说明在南极洲的沿海水域,海洋鱼类在每年的大部分时间里都经历了接近海水冰点（-1.86°C）的环境温度,并且在南半球夏季只有罕见的变暖期。这些零度以下水域的进化导致了一系列适应性,允许生物在这个寒冷,充满冰的环境中生存,这些适应性进化包括抗冻蛋白的产生,热休克反应的缺失,血红蛋白的丢失,和代谢补偿等。目前在鱼类中主要发现了五种类型的抗冻蛋白,即抗冻糖蛋白（AGFP）、Ⅰ型抗冻蛋白（AFPⅠ）、Ⅱ型抗冻蛋白（AFPⅡ）、Ⅲ型抗冻蛋白（ AFP Ⅲ）和Ⅳ型抗冻蛋白（AFP Ⅳ）。尽管AFP类型在其主要序列和三维结构方面根本不同,但它们都具有相同的性质,即允许它们结合到冰上并降低溶液的凝固点。断线真狼绵鳚（Lycodichthys dearborni）,为辐鳍鱼纲鲈形目绵鳚亚目绵鳚科的一种,分布于南大洋罗斯海海域,属于底栖性鱼类,能够合成Ⅲ型抗冻蛋白（ AFP Ⅲ）。 AFP Ⅲ三维结构是球状的,没有氨基酸组成上的偏向性。先前我们实验室从断线真狼绵鳚（Lycodichthys dearborni）中鉴定到一种含有12个重复结构域的Ⅲ型抗冻蛋白,并命名为ld12。本实验以ld12为模板克隆得到分别含有一个、两个、三个和四个结构域的抗冻基因ld1、ld2、ld3和ld4。传统意义上来说它们抗冻的功能是一种物理学的吸附和抑制功能,没有细胞生理学意义上的生物化学功能。另一方面,越来越多的证据表明,许多抗冻蛋白除了具有抑制冰晶生长的功能外,还具有提高受体动植物耐受低温引起的生化伤害的能力,后者功能不依赖于对冰晶生长的抑制,是一种细胞生理水平的功能。因此,本实验对抗冻蛋白基因ld1、ld2、ld3和ld4在体内和体外同时展开了细胞生理水平上的研究。在体外实验中,构建了能够稳定遗传ld1、ld2、ld3和ld4的ZF4细胞系,并且检测到相应抗冻蛋白能够成功表达。对转基因细胞系进行10°C的低温胁迫后发现,转抗冻蛋白基因的细胞系的细胞毒性明显低于对照组,并且细胞的活性明显高于对照组,表明抗冻蛋白基因能够提高ZF4细胞抵抗低温胁迫的能力。在体内实验中,利用显微注射技术构建瞬时表达抗冻蛋白基因的转基因斑马鱼胚胎,将转基因斑马鱼胚胎进行12°C的低温胁迫24h后进行发育状态观察和统计。从实验结果可以看出,同对照组相比,转抗冻蛋白基因的胚胎的发育状态相对较好,而且胚胎的发育状态同抗冻蛋白的 AFP Ⅲ功能域的数量呈正相关。通过体内和体外实验均证明这些抗冻基因ld1、ld2、ld3和ld4具有在非冰冻温度下保护细胞和生物体抵抗低温伤害的生物学功能,并且在细胞及个体中均能发挥作用,它影响的可能是细胞的基本生命活动过程。同时也发现重复的 AFP Ⅲ结构域越多抗寒性能越强,这也与之前关于抗冻蛋白的抗冻活性与分子量呈正相关的结论一致。为了探究抗冻蛋白的抗寒机制,我们选择抗寒性能最强的ld4作为研究对象进一步探究。以转ld4的ZF4细胞为实验组,转空载体的ZF4细胞为对照组,分别在10°C的低温下胁迫2d后进行转录组和蛋白组测序,利用生物信息学的手段探究和挖掘抗冻蛋白LD4的抗寒机制。通过对转录组和蛋白组分析发现,实验组和对照组存在显着性的差异。通过对两组的差异表达基因和差异表达蛋白分别分析比较,以及将两组进行相关性分析,发现实验组主要富集到的通路有Protein processing in endoplasmic reticulum、Cellular senescence、Regulation actin cytoskeleton、Calcium signaling pathway和Apelin signaling pathway,同转录组富集到的信号通路差别较大,但是和蛋白组的信号通路相似。转录组的差异表达基因主要涉及到Rbosome、Oxidative phosphorylation、Cellular senescence、FoxO signaling pathway、p53 signaling pathway及Spliceosome。蛋白组的差异蛋白主要涉及到Protein processiong in endoplasmic reticulum、Regulation actincytoskeleton和Necroptosis。由此可以说明,低温胁迫下,细胞最终是通过Protein processiong in endoplasmic reticulum、Cellular senescence、Regulation actincytoskeleton、Apelin signaling pathway、Calcium signaling pathway、p53 signaling pathway和Necroptosis来实现应激的,而Rbosome、Oxidative phosphorylation、Cellular senescence、FoxO signaling pathway及Spliceosome是细胞应激反应中经历的过程。结合转录组和蛋白组的分析结果,对LD4可能的抗寒机制进行了实验验证。本实验的一个突破口是寻找与LD4蛋白相互作用的蛋白,通过利用免疫共沉淀技术及串联质谱技术,成功的探究到LD4的相互作用蛋白为Bip蛋白（也称之为GRP78）。它是内质网的分子伴侣,主要参与内质网应激。结合组学分析,我们推测LD4是通过与Bip蛋白相互作用参与内质网的应激来降低细胞的凋亡,从而提高细胞的存活率的,而这种内质网应激可能是钙离子依赖性的。因此,通过对细胞内钙离子的监测和凋亡水平的检测发现,LD4蛋白能够降低胞质内的钙离子浓度,并且降低细胞的凋亡。但是具体的机制还需要进一步探究。本实验室前期的研究发现钙调蛋白（Calmodulin,CaM）在南极鱼类（Dissostichus mawsoni）中的表达非常高（占0.23%）,并且将南极鱼CaM基因转入烟草中发现能够明显的提高低温胁迫下烟草的生长状态,同时发现只保留N端的两个Ca2+结合域（CaMm）具有和完整的结构域（CaM）相同的抗寒效果。而CaM作为Ca2+的感受器,通过调控Ca2+信号通路参与低温胁迫反应中。为了探究南极鱼CaM基因在斑马鱼细胞上是否有同样的功能,以及将CaM和ld4共表达是否能够进一步提高斑马鱼细胞对低温的耐受力,因此利用ZF4细胞构建转基因细胞系进行探究。实验结果表明,在短期胁迫中南极鱼的CaM和CaMm基因均能够提高ZF4细胞抵抗寒冷胁迫的能力,但是随着胁迫时间的延长,南极鱼的CaM和CaMm基因不能持续性的发挥功能。但是,将ld4分别同CaM和CaMm共同转染至ZF4细胞中,发现细胞的耐寒能力得到提高,并且随着胁迫时间的延长,ld4和CaMm共转染的细胞表现出更强的耐寒性能。以上结果说明,南极鱼的CaM和CaMm基因能够提高ZF4细胞的耐寒性能,而且ld4能够使耐寒性能进一步加强,这可能是LD4和CaM共同调控Ca2+信号通路的结果,也进一步说明Ca2+信号通路在LD4抗寒过程中的重要作用。综上所述,我们首次探究并证实了LD4抗冻蛋白的一种新功能-抗寒功能,并且这种功能与分子量呈正相关,即抗寒活性LD4>LD3>LD2>LD1。抗冻蛋白的这种抗寒功能不同与生物物理的吸附抑制功能,而是细胞生理上的功能。这种功能可能是通过钙离子依赖性的内质网应激实现的,最终降低低温胁迫下细胞的凋亡水平。
魏镇[3]（2019）在《黄粉虫抗冻蛋白的表达、纯化及定向进化的研究》文中进行了进一步梳理抗冻蛋白（antifreeze protein,AFP）是一种可以在结冰或者是亚结冰的条件下保护生物有机体免受低温冻害的蛋白质,这种蛋白质不仅抑制细胞内冰晶的增长并且可以非依数性的降低溶液冰点而使其熔点不发生变化（冰点与熔点的温度差即为热滞活性）,降低了生物的低温耐受温度,从而保护生物有机体在低温下存活。虽然抗冻蛋白在自然界中分布广泛,存在于各种各样的生物体中,例如昆虫、植物、微藻类甚至是生活在南极和北极的细菌中,但是其绝对量非常少。昆虫抗冻蛋白被称为抗冻蛋白中的“超级活性蛋白”,其抗冻活性与鱼类抗冻蛋白的抗冻活性相比大约是鱼类的10-100倍。因为本身的高抗冻活性及潜在的商业价值,昆虫抗冻蛋白已经引起了众多研究者们的兴趣,无论是科学上的研究还是商业上的应用都需要大量的可溶性抗冻蛋白。本文以黄粉虫抗冻蛋白（TmAFP）为目的蛋白,通过采用基因工程的方法,成功的在宿主菌大肠杆菌中实现可溶性表达,并通过镍柱纯化回收获得了带有抗冻活性的抗冻蛋白,为抗冻蛋白在科学研究和商业应用上都提供了很有利的技术支持。主要的研究结果如下:（1）以带有氨苄青霉素抗性的表达质粒pET-DsbA为出发载体,成功的构建了黄粉虫抗冻蛋白在大肠杆菌中表达的表达载体pET-DsbA-TmAFP。（2）优化了黄粉虫抗冻蛋白在大肠杆菌中表达的诱导条件,优化条件如下:宿主菌的选择、起始诱导OD600、诱导剂IPTG浓度和诱导培养的温度。最终得到了抗冻蛋白表达的最佳诱导条件:将带有抗冻蛋白表达质粒的大肠杆菌Shuffle T7在30℃摇床上培养至OD600为0.6,加入1 M的IPTG使其终浓度为1 mM,转移至18℃摇床200 rpm诱导培养16 h。（3）将带有His标签的融合抗冻蛋白通过Ni-NTA柱子纯化回收,最终获得了带有抗冻活性的融合抗冻蛋白,对浓度为4.0 mg/mL的融合蛋白测定其热滞活性,可以达到-0.4℃,融合抗冻蛋白在50 mL摇瓶发酵中产量可以达到56 mg/L。（4）将定向进化技术成功的应用到抗冻蛋白的进化上,筛选了大量的突变株,最终获得了一株蛋白突变株（H33N）,其渗透压值与原始蛋白相比提高了 8.4%,测定浓度为4.0 mg/mL的融合蛋白的热滞活性,可以达到-0.6℃。
王羽晗,李子豪,李世彪,陈驰航,王瑜麟,张旸[4]（2018）在《植物抗冻蛋白研究进展》文中研究表明低温胁迫会对植物的生长造成威胁,使农作物产量降低,无法满足人们的生产生活需要。因而,提升植物抗寒能力具有重要意义。抗冻蛋白是提高生物体对低温适应能力的一种蛋白质。目前发现的抗冻蛋白可以通过降低体系冰点、改变冰晶形态、抑制冰晶生长来防止低温胁迫对生物体造成伤害,提高生物体对低温的适应能力。现已在鱼类,昆虫和植物中发现并分离出具有抗冻能力的蛋白质,并且把植物或动物或动植物融合的抗冻蛋白相关基因转入到受体植株,植株的抗寒能力均有所提高,农作物的产量也随之增加。以表格的形式总结了近年来各类抗冻蛋白的研究进展,将从抗冻蛋白的发现、效应、活性的评价方式、作用机理、研究进展及应用等方面进行综述。另外有文献表明,在一些植物中还存在着一些具有调控抗冻蛋白积累的物质,如茉莉花酸和乙烯等,对提高植物在低温下的生活能力也具有重要意义,还需要进一步研究。其次,也发现具有其他的功能的抗冻蛋白,但是这些抗冻蛋白的同源性也不高,还需要我们去进一步探索。
张莉[5]（2018）在《抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性表征》文中指出抗冻肽具有的抗冻作用可以使低温环境下存活的生物免受细胞间形成冰晶引起的损伤或致死作用,因此,将其作为冷冻低温保护剂用于细胞、组织和食品生产中。在本研究中,首先按照乳酸乳球菌密码子偏好性优化并构建抗冻肽序列SF-P,通过基因工程的手段构建重组菌。筛选阳性菌落,菌落聚合酶链式反应和测序鉴定重组菌构建成功。在乳酸链球菌素Nisin诱导下进行目的基因的表达,利用SDS-PAGE和Western-Blot鉴定抗冻蛋白表达成功。然后优化重组菌表达抗冻蛋白的最佳条件,单因素条件为诱导时间6 h,诱导p H为7.0,诱导温度为25℃,诱导剂Nisin浓度为15 ng/m L;正交试验设计组合优化的最佳表达条件为诱导p H=6.0,诱导剂Nisin浓度为25 ng/ml,诱导温度为37℃,培养时间为6 h。最后探究冷冻和冻干胁迫处理后重组菌的抗冻活性。冷冻胁迫后,与对照组相比,SF-P2诱导重组菌未表现出明显的对数生长延滞期和稳定生长延滞期,发酵活力稳定,胞内关键酶活力较正常,细胞的存活率分别从21.00%和22.03%提高到49.28%,活细胞的比例从3.40%增加到56.30%,受损细胞的比例从91.00%下降到41.80%,且热滞活性较高。冻干胁迫后,测定SF-P2诱导重组菌胞内K+、Na+浓度的变化,发现重组菌细胞膜的渗透性损伤程度较低。SEM结果表明重组菌细胞形态较完整,无明显的细胞内容物外溢现象,可以观察到细胞间的边界。本文的研究结果表明,与SF-P1未诱导重组菌和NZ3900空载菌相比,SF-P2诱导重组菌显示较高的细胞存活率和热滞活性,可以保护细胞内关键酶活力和细胞膜完整性,具有明显的抗冻胁迫保护作用。
于淑惠[6]（2016）在《白蜡虫低温适应分子机制及抗冻蛋白功能研究》文中研究指明长春越冬白蜡虫雌成虫能够忍耐-30℃以下的极端低温,能够在东北的极端低温环境下越冬并繁殖后代。白蜡虫对低温的适应性与自然种群分布关系极为密切,为了探讨白蜡虫的低温适应机制,本研究采用高通量测序、荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q-RT-PCR）检测、基因克隆、原核表达、植物转基因等方法,分析了长春越冬白蜡虫雌成虫的转录组、蛋白组、与昆明越冬前白蜡虫雌成虫基因表达差异、抗冻蛋白（antifreeze protein,AFP）候选基因周年表达动态、afp候选基因序列特征、基因功能等,阐述了白蜡虫适应极端低温可能的分子机制,并从中挖掘到新型昆虫afp基因。获得的主要研究结果如下:（1）通过Illumina转录组测序,获得54,934,590条raw reads,拼接后获得161,005个转录本（transcript）,预测有11,871个编码序列（coding sequence,CDS）。在转录组中没有注释到抗冻蛋白。Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析表明,多数转录本富集在信号转导和代谢过程中,其中MAPK信号通路、钙离子信号通路、PI3K-Akt信号通路、可溶性糖、糖醇、游离氨基酸等的生物合成途径占优势,对于白蜡虫的低温适应性具有重要意义。（2）通过蛋白质全谱分析,获得了蜡虫在极端低温下的蛋白组数据,从中分离鉴定白蜡虫抗冻相关的蛋白,如脂肪酸脱氢酶（fatty acid desaturase,FAD）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase,PFK）、脱水蛋白（dehydrin）、热激蛋白（heat shock protein,HSP）等。GO和KEGG分析表明,多数蛋白富集在信号转导和代谢过程中,其中PPAR信号通路、MAPK信号通路、钙离子信号通路占优势。采用random forest approach软件在蛋白组中成功预测到388个抗冻蛋白。（3）通过RNA-Seq测序（RNA Sequencing）技术对昆明越冬前白蜡虫雌成虫进行了表达谱测序,分析了长春越冬白蜡虫雌成虫和昆明越冬前白蜡虫雌成虫基因表达的差异,共鉴定到2,386个差异表达的基因,其中1,124个基因上调表达,1,262个基因下调表达,其中hsp70差异表达显着。这些差异表达基因主要参与糖代谢、精氨酸、脯氨酸代谢。（4）结合蛋白组和差异基因分析,以及random forest approach软件预测结果,共筛选出39个白蜡虫afp候选基因,进一步分析了这39个afp候选基因在长春和昆明白蜡虫中的周年表达动态,发现有10个afp候选基因的表达动态呈“山形”,符合afp基因的周年表达动态的特征。（5）对筛选出的10个白蜡虫afp候选基因,进行了基因编码框cDNA克隆,对获得的序列进行序列特征分析、三级结构预测和系统进化分析,生物信息学分析结果表明,预测的10个白蜡虫afp候选基因具有AFP的序列和结构特点。（6）对这10个白蜡虫afp候选基因,利用同源重组构建了原核表达载体,转化大肠杆菌BL21。采用IPTG诱导,成功表达了1个白蜡虫AFP,该蛋白在上清和菌体中均有表达,而且表达量大,蛋白具有活性,利用差示扫描量热法测得热滞活性为0.97℃。（7）对原核表达成功的afp基因进行植物表达载体构建,采用农杆菌介导的方法,将白蜡虫afp基因整合到烟草的基因组中,过冷却点（supercooling point,SCP）测试表明,转基因植株和野生型对照相差0.36℃,但统计结果表明两者的差异不显着。本研究针对长春地区白蜡虫越冬雌成虫可以抵御当地极端低温的生物学现象,初步阐述了白蜡虫低温适应可能的分子机制,并还挖掘了白蜡虫afp基因。该研究不但有助于了解白蜡虫低温适应性对其种群分布的影响,同时也有助于人们设计和生产出更多具有抗冻活性的分子。
陈佳佳[7]（2015）在《矮沙冬青抗冻蛋白基因（AnAFP）转化玉米》文中提出目前就种植面积和产量而言,玉米是我国乃至世界第一大粮食作物。随着人口的不断增长,进一步增加玉米种植面积,充分发挥其碳四植物的高产优势,对保障粮食安全具有重要意义。然而,玉米起源于热带,对低温较为敏感,限制着玉米种植生长区域的进一步扩大。通过转基因技术,转化利用其他物种的抗冻基因,是改良和提高玉米抗寒、抗冻性的有效途径。抗冻蛋白是寒冷地区的动物、植物为适应低温环境而产生的一类多肽,其作用能抑制冰晶生长,以非依数性形式降低水溶液的冰点,而不改变其熔点的。矮沙冬青为我国西北荒漠唯一常绿阔叶灌木,主要分布于常年干旱,极端温度达-30℃到40℃的西天山与昆仑山结合部。本研究用前期克隆和功能验证的矮沙冬青抗冻蛋白基因AnAFP构建单子叶植物表达载体PTU-An4FP,农杆菌介导法转化玉米愈伤组织,对再生植株及株系进行分子检测和抗冻表型鉴定。结果如下:1、将矮沙冬青抗冻蛋白基因AnAFP插入pTF101.1质粒,构建成单子叶植物表达载体pTU-AnAFP。2、取玉米自交系18-599未成熟幼胚诱导培养愈伤组织,农杆菌介导法转化表达载体pTU-AnAFP,经筛选、分化、再生和PCR检测,获得1株T0代阳性植株。3、对T1代株系的PCR和Southern检测证明,AnAFP基因可能同时插入玉米同源染色体两个非等位位点,T1代即表现形状不分离。4、将T1代株系及对照的幼苗置于0℃低温环境胁迫处理24 h,然后室温下解冻,观察表型变化。野生型玉米对照植株叶片萎蔫,严重失水,而转基因阳性株系表现正常。5、实时荧光定量PCR检测表明,AnAFP基因在T1代株系中异源表达,且响应低温胁迫。上述结果表明,矮沙冬青抗冻蛋白基因AnAFP具有很好的抗冻功能,在玉米中异源表达可明显抗高其抗寒、抗冻性。
陈亮亮[8]（2013）在《转昆虫抗冻蛋白基因棉花的分子检测及其耐寒性研究》文中指出低温冷害是影响农业作物产量和质量的重要非生物胁迫因素之一。许多重要的经济作物，如棉花、大豆、玉米和水稻都对冷害非常敏感，无法在寒冷气温下存活。棉花是世界上重要的经济作物和可再生资源之一。新疆棉区自然条件优越，生产规模大，棉花总产约占全国的1/3，但是棉区常遭遇低温冷害。低温会导致棉花结桃、裂铃、吐絮期受到严重损伤或使植株死亡，对棉花的产量和质量造成了巨大影响。采用传统育种方法来改良植物的抗寒性存在着耗时、费力、很难修饰单一性状、对现有品种依赖性强等问题，而生物技术则是一种提高植物抗寒性相对较快和精确的方式。抗冻蛋白能够使许多生物（从脊椎动物到细菌）在零度以下得以生存。昆虫抗冻蛋白的热滞活性比已发现的大多数其他生物高10-100倍。这使得昆虫抗冻蛋白在植物耐寒性遗传转化过程中有着极大潜力和无以比拟的优势。本研究针对新疆棉区早春、初秋低温冷害冻害等影响棉花产量和质量的自然灾害问题，通过花粉管通道法将昆虫抗冻蛋白基因Mpafp149转化新疆北疆棉区主栽品种，然后对2010至2012年间转基因棉花后代进行分子检测，主要包括PCR，RT-PCR，Southern blot，Western blot以及多孔硅蛋白生物传感器等检测，对T4代转基因植株进行低温处理后抗寒性研究，主要包括低温对表型的影响、及与低温相关的电导率、MDA、脯氨酸等检测。主要结果如下：PCR及PCR-Southern杂交的结果表明昆虫抗冻蛋白基因已传递到了转基因棉花后代中。2011.7MNS T2代和MNS T1代转基因棉花PCR阳性株数为306株，其中T2代的99株，T1代的207株，阳性率分别为60%和53%。2012.5Lab2T3代转基因棉花有抗卡纳抗性87株，NPTⅡPCR阳性100株，Mpafp149PCR阳性86株。RT-PCR结果表明昆虫抗冻蛋白基因已在转基因棉花的转录水平得到了表达。2012.3Lab1T3代转基因棉花RT-PCR阳性13株，阳性率为30%。T3代转基因株系8-3,8-4的Western blot杂交结果显示出了大约10kDa的预期蛋白条带，说明在T3代转基因棉花植株中表达了异源昆虫抗冻蛋白MpAFP149。对T4代转基因植株进行低温（2℃）胁迫24、48和72h处理。表型观测结果表明转抗冻蛋白基因的棉花植株受到的冷害较轻。当处理到72h时，野生型棉花、T3-12和T3-14的相对电导率分别为80%、45%和57%。MDA含量增长分别为21.9、16.8和15.7μmol/g。结果表明转基因植株叶片的相对电导率和丙二醛含量变化均小于野生型棉花对照，反应出转基因棉花在低温处理后质膜受冷害较轻。此外，低温处理72h时，野生型棉花、T3-12和T3-14的脯氨酸含量分别为0.4，0.85和0.81μg/g。转基因株系的脯氨酸含量均高于野生型的。说明低温处理后，转基因植株产生了更多的脯氨酸以提高植物抗低温逆境的影响。T4代转基因棉花低温下的表型及耐寒性生理生化指标结果表明小胸鳖甲昆虫抗冻蛋白MpAFP149能够在一定程度上提高棉花的耐寒性。无标记的多孔硅（PSi）生物传感器是一种很有前景的快速高效的检测生物分子的平台，这种平台已经广泛被用于各种生物分子的检测。本研究利用单层多孔硅蛋白生物传感器对转基因植株在蛋白质水平进行检测，最终检测限为0.0027mg·ml-1。与野生型相比，除了株系2，所有转基因棉花株系均表现出显着的红移，表明该传感器能够用于转基因棉花蛋白质水平的检测。此外，利用多元光子晶体结构多孔硅传感器检测抗冻蛋白基因探针和与其互补DNA片段的杂交情况，结果表明这种DNA之间的互补杂交可以被检测出来，最终检测限为0.0213μM。这些结果将为我们在蛋白质和基因水平对田间大规模的转基因植物进行遗传筛选提供一种新的思路，并有望进一步开发应用于转基因植物筛选检测的技术平台。
褚明宇[9]（2012）在《胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆及对葡萄的遗传转化》文中认为我国葡萄（Vitis vinifera）主栽品种抗冻性弱，根系的抗寒能力差，冬季需要埋土越冬；因此通过遗传转化将植物抗冻基因导入葡萄中，培育转基因葡萄新品系，对改良葡萄抗寒能力具有重要意义。本研究通过PCR方法成功克隆了胡萝卜抗冻蛋白AFP基因并对其进行序列分析，构建了胡萝卜AFP基因的植物表达载体pBI-AFP，以宝石无核（Ruby Seedless）为受体材料进行了遗传转化。主要结果如下：1以胡萝卜植物组织基因组DNA为模板，通过PCR方法，获得了胡萝卜抗冻蛋白AFP基因，并连接到pGEM-T easy载体中。2通过ProtParam软件和蛋白分析软件Predictprotein对AFP抗冻基因生物信息学的分析，预测该蛋白的分子式为C1709H2680N448O502S16，相对分子质量为38.048kDa，等电点为5.43，该蛋白为亲水性分泌型蛋白，有信号肽存在；其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。3pGEM-AFP和pBI-121经Sac I和Xba I双酶切后连接，转化到大肠杆菌E.coilDH5α感受态细胞，成功构建了植物表达载体pBI-AFP。4通过液氮冻融法将植物表达载体pBI-AFP导入根癌农杆菌EHA105菌株中，经抗生素抗性筛选和PCR鉴定重组质粒成功导入农杆菌，构建了工程菌pBI-AFP/At.EHA105。5获得了适宜宝石无核葡萄叶片诱导不定芽的适宜培养基： CH+2-iP4mg/L+6-BA2mg/L+TDZ4mg/L，不定芽的诱导率为53.3%；获得了适宜超级无核葡萄叶片不定芽分化的培养基：CH+2-iP1mg/L+6-BA1mg/L+TDZ0.5mg/L+CPPU0.5mg/L+ZT1mg/L，不定芽诱导率为46.7%。6采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化宝石无核葡萄，通过抗性筛选获得了转化葡萄植株，经PCR检测，初步证明目的基因AFP已导入葡萄植株中。
毛新芳[10]（2011）在《新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白的性质及功能研究》文中认为本研究采用实验室前期从新疆荒漠甲虫光滑鳖甲Anatolica polita体内获得的抗冻蛋白基因Apafp752和Apafp914,构建不同的表达质粒,通过原核表达获得了具有不同标签的重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFPs。采用微升渗透压仪和差示扫描量热仪对ApAFPs的热滞活性（THA）进行测定,同时观察了其对冰晶的修饰作用;通过测定ApAFPs对菌体的体外低温保护作用进一步验证其抗冻活性,并对光滑鳖甲抗冻蛋白的热稳定性、酸碱稳定性及亲水性进行了研究,结果表明ApAFPs具有较强的热稳定性,酸碱耐受性和较高的亲水性。检测了盐溶液NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2;多羟基醇类物质甘油、海藻糖以及羧酸盐Na2CO3、NaAC、柠檬酸钠、EDTA二钠盐对重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752热滞活性的影响。采用圆二色谱法对ApAFPs的二级结构组成进行了测定,建立了ApAFPs的三维结构模型,并利用生物信息学方法分别从氨基酸组成,蛋白序列同源性检索,蛋白序列相似性比对,等电点预测,序列疏水性分析,三级结构预测以及同源进化关系等方面进行预测,系统研究了两种光滑鳖甲抗冻蛋白与其它昆虫抗冻蛋白之间的关系,探讨了其结构与功能之间的关系;同时研究了重组光滑鳖甲抗冻蛋白对鼠红细胞以及乳酸脱氢酶的低温保护作用和抗冻蛋白内源性表达对表达菌自身的低温保护作用。主要研究结果如下:（1）Apafp752在Escherichia coli BL21 （DE3）菌株中可溶性高效表达的融合蛋白Trx-ApAFP752经Ni-NTA亲和层析、离子交换和凝胶过滤层析纯化后纯度达到95%以上,分子量约为30kDa。重组ApAFP752（0.033mM）的热滞值为0.76℃,具有较高的热滞活性和明显的冰晶修饰作用。Trx-ApAFP752可明显提高菌体在低温下的存活率。这种低温保护作用受pH值及蛋白浓度的影响,酸性条件下Trx-ApAFP752对菌体的低温保护作用较弱,而碱性条件可明显提高Trx-ApAFP752对菌体的低温保护作用,并且随着蛋白浓度的增加保护作用也加强。圆二色谱结果表明重组ApAFP752的二级结构主要为β-折叠,在pH2-11的范围内蛋白结构保持稳定,当处理温度达到50℃时结构发生改变;因此,重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752具有较强的酸碱稳定性和一定的热稳定性。（2）采用差示扫描量热仪（DSC）分析重组ApAFP752的量热学特性并对其热滞活性（THA）进行了测定。ApAFP752的THA测定值与溶液中冰核含量有关。当ApAFP752溶液冰核含量小于25.3%时,能够观察到明显的重结晶延滞现象,即当温度降到熔点温度以下溶液才开始结冰,表明ApAFP752具有热滞效应。当溶液冰核含量小于5.1%时,ApAFP752的THA可高达0.76℃。ApAFP752的THA随蛋白浓度的增加而变大,具有明显的浓度效应。采用热重分析仪（TG）对ApAFP752的亲水性进行分析,结果表明ApAFP752具有较强的亲水性。（3）盐离子可明显依数性地增加重组ApAFP752的热滞活性,且二价盐离子溶液的增效作用大于一价盐离子,在低浓度条件下尤为明显。四种羧基化合物的增效作用大小为EDTA>柠檬酸>醋酸钠≥碳酸钠,增效作用与分子中含有的羧基数目相关。两种多羟基物质:甘油、海藻糖的增效作用小于盐离子和羧基化合物,在高浓度下才表现出明显的增效作用。（4）将Anatolica polita抗冻蛋白基因Apafp914分别构建于pET28a和融合绿色荧光蛋白基因的pET28a-egfp载体上,在Escherichia coli中分别以包涵体和可溶形式表达His-ApAFP914和His-EGFP-ApAFP914。绿色荧光蛋白标签的加入增加了ApAFP914的可溶性。0.005mM His-ApAFP914的热滞值为0.67℃,而EGFP-ApAFP914在0.011mM的热滞活性为0.91℃,两种重组ApAFP914在相近摩尔浓度下热滞活性接近,且明显高于ApAFP752;二者也均有明显的冰晶修饰作用。对菌体的低温保护结果表明二者均可明显提高菌体在低温下的存活率,且具有明显的时间效应和浓度效应。相同摩尔浓度下,His-ApAFP914与His-EGFP-ApAFP914的低温保护作用差别不大。二者均具有一定的酸碱稳定性和较高的热稳定性,且重组ApAFP914较ApAFP752具有更高的热稳定性。圆二色谱分析表明His-ApAFP914的主要二级结构为β-折叠,在酸性条件下,β-折叠含量下降,无规卷曲增加,而碱性条件下二级结构组成则较为稳定。（5）ApAFP752和ApAFP914与其它鞘翅目昆虫AFPs的序列相似性远远大于与鳞翅目昆虫AFP的相似性。在同源进化树上可以看出ApAFP914与小胸鳖甲抗冻蛋白亲缘关系较近,而ApAFP752的变异性较大。ApAFP752分子内含有两个TCI基序而非TCT结构,且疏水区面积大于ApAFP914。圆二色谱分析结果表明构成两种ApAFPs的主要二级结构成分为β-折叠,而ApAFP914的β-折叠含量要大于ApAFP752,且无规卷曲含量很低,推测其空间结构更加紧致,有序。ApAFP752和ApAFP914在三级结构上与黄粉虫抗冻蛋白TmAFP相似,都形成右手β-螺旋结构。ApAFP914由含有TCT基序的氨基酸重复序列构成的螺圈数要多于ApAFP752,使之具有更大的冰晶结合表面积,且蛋白N-端具有二硫键更为封闭。冰晶结合表面积的不同以及结构的差异可能是造成二者热滞活性及热稳定性差异的原因。（6）重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914可提高红细胞对-3℃低温耐受的同时,提高了经低温处理后的细胞对渗透胁迫的抗性。rApAFP914也可显着降低4℃处理红细胞的溶血率,并且这种保护作用随蛋白浓度的升高而增大,具有一定的浓度效应。初步推测rApAFP914通过与冰核吸附结合阻止冰晶生长,同时与红细胞膜结合保护膜完整性而发挥低温保护作用。（7）通过测定体内可溶性表达重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914的表达菌对不同低温的耐受性,以及经低温处理后的生长曲线,表明体内rApAFP914的积累能够显着提高表达菌在低温下的存活率,并且随着诱导剂浓度及诱导时间的延长,对菌体的保护效果也增强。为进一步揭示ApAFP914在天然昆虫体内的作用机制奠定了基础。（8）重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFPs对反复冻融的乳酸脱氢酶LDH有显着的低温保护作用,且具有一定的浓度效应,高浓度重组ApAFP752对LDH的保护活性要高于重组ApAFP914。
二、抗冻蛋白基因转化植物的研究展望（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗冻蛋白基因转化植物的研究展望（论文提纲范文）
（1）小麦重结晶抑制蛋白IRI基因低温表达模式及启动子活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 低温对植物的影响 |
| 1.2 AFPs的概述 |
| 1.2.1 AFPs的发现 |
| 1.2.2 AFPs的功能 |
| 1.2.3 重结晶抑制蛋白IRI |
| 1.2.4 抗冻蛋白的应用与发展前景 |
| 1.3 启动子 |
| 1.3.1 启动子的概述 |
| 1.3.2 启动子的种类 |
| 1.3.2.1 组成型启动子 |
| 1.3.2.2 组织特异性表达启动子 |
| 1.3.2.3 诱导性启动子 |
| 1.3.2.4 人工合成启动子 |
| 1.3.3 顺式作用元件 |
| 1.4 茉莉酸甲酯(Jasmonic acid,MEJA) |
| 1.4.1 茉莉酸甲酯的介绍 |
| 1.4.2 冷调控相关基因 |
| 1.4.3 茉莉酸甲酯低温胁迫分子响应机制 |
| 1.5 启动子活性与功能验证方法 |
| 1.5.1 启动子活性与功能验证概述 |
| 1.5.2 生物信息学分析 |
| 1.5.3 瞬时表达分析 |
| 1.5.4 遗传转化分析 |
| 1.5.5 电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay EMSA) |
| 1.6 研究目的和意义 |
| 1.7 实验路线 |
| 第二章 强冬性小麦M808IRI基因的表达分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料与处理 |
| 2.1.1.1 植物材料 |
| 2.1.1.2 材料培养 |
| 2.1.1.3 处理条件 |
| 2.1.2 实验试剂与仪器 |
| 2.1.2.1 实验试剂 |
| 2.1.2.2 实验仪器 |
| 2.1.3 前期准备工作 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA产物检测 |
| 2.2.3 反转录合成第一条链cDNA |
| 2.2.4 cDNA检测 |
| 2.2.5 cDNA检测q PCR所用内参引物 |
| 2.2.5.1 PCR检测内参引物 |
| 2.2.5.2 PCR检测步骤 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6.1 实时荧光定量PCR特异性引物 |
| 2.2.6.2 实时荧光定量PCR步骤 |
| 2.2.6.3 结果计算 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 植物组织总RNA的提取 |
| 2.3.2 cDNA检测实时荧光定量PCR所用引物 |
| 2.3.2.1 cDNA检测 |
| 2.3.2.2 PCR检测内参引物 |
| 2.3.2.3 PCR检测IRI基因引物 |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR结果 |
| 2.3.3.1 4 ℃低温诱导下的表达分析 |
| 2.3.3.2 4 ℃-MEJA诱导下的表达分析 |
| 2.3.3.3 基因表达量综合分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 烟草瞬时表达鉴定IRI基因启动子功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.1.1 植物材料选择 |
| 3.1.1.2 材料培养 |
| 3.1.2 菌体与克隆载体 |
| 3.1.3 实验试剂与仪器 |
| 3.1.3.1 实验试剂 |
| 3.1.3.2 实验溶液的配制 |
| 3.1.3.3 常用培养基的配制 |
| 3.1.3.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 重组质粒转入农杆菌感受态 |
| 3.2.1.1 感受态的制备 |
| 3.2.1.2 质粒的提取 |
| 3.2.1.3 农杆菌的转化 |
| 3.2.2 农杆菌的转化的鉴定 |
| 3.2.3 烟草侵染 |
| 3.2.3.1 烟草侵染处理 |
| 3.2.3.2 侵染后烟草的胁迫处理 |
| 3.2.4 烟草叶片GUS组织化学染色 |
| 3.2.5 烟草叶片脱色 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 启动子中与胁迫激素相关顺式作用元件分析 |
| 3.3.2 重组质粒鉴定 |
| 3.3.2.1 质粒的提取 |
| 3.3.2.2 质粒回转农杆菌PCR鉴定 |
| 3.3.3 农杆菌介导GUS报告基因的瞬时表达分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 IRI启动子活性的稳定表达分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料和处理 |
| 4.1.1.1 植物材料种植和培养 |
| 4.1.1.2 收种子 |
| 4.1.2 菌体与克隆载体 |
| 4.1.3 溶液的配制 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 拟南芥的转化 |
| 4.2.1.1 农杆菌菌液的制备 |
| 4.2.1.2 拟南芥侵染转化 |
| 4.2.2 阳性种子筛选 |
| 4.2.3 拟南芥转基因阳性苗的鉴定 |
| 4.2.4 T_2代拟南芥转基因阳性苗胁迫处理 |
| 4.2.5 拟南芥转基因阳性苗GUS染色 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 拟南芥转基因阳性苗鉴定 |
| 4.3.2 拟南芥转基因阳性苗GUS染色结果分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）抗冻蛋白基因ld4提高鱼类抗寒性能的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1 南极鱼的寒冷适应性进化 |
| 1.1 抗冻糖蛋白和抗冻蛋白的产生 |
| 1.2 代谢过程的冷适应 |
| 1.3 代谢酶活性的进化 |
| 1.4 线粒体功能 |
| 1.5 可诱导的热休克反应的丧失 |
| 1.6 血红蛋白丢失 |
| 2 抗冻蛋白 |
| 2.1 海洋衍生的抗冻蛋白 |
| 2.2 真菌抗冻蛋白 |
| 2.3 硅藻抗冻蛋白 |
| 2.4 细菌抗冻蛋白 |
| 3 抗冻蛋白的特性 |
| 本研究的目的和意义 |
| 第二章 探究抗冻蛋白基因ld的细胞生物学功能 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 质粒构建 |
| 2.2.3 转基因细胞系的建立 |
| 2.2.4 转基因斑马鱼品系建立 |
| 2.2.5 低温胁迫策略 |
| 2.2.6 western blot分析蛋白表达 |
| 2.2.7 LDH细胞毒性检测 |
| 2.2.8 细胞活性检测 |
| 2.2.9 细胞免疫荧光实验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 抗冻蛋白基因ld的基因结构分析 |
| 2.3.2 构建ld1、ld2、ld3及ld4 表达载体 |
| 2.3.3 转基因细胞探究ld基因的抗寒功能 |
| 2.3.4 转基因斑马鱼探究ld基因的抗寒功能 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 抗冻活性与分子量呈正相关 |
| 2.4.2 多聚基因结构可能是鱼类基因组适应极端寒冷环境的一种进化机制 |
| 2.4.3 AFP Ⅲ的抗冻活性同分子量和结构表面相关 |
| 第三章 转录组和蛋白组研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 低温胁迫处理细胞 |
| 3.2.2 RNA提取 |
| 3.2.3 蛋白提取 |
| 3.2.4 RNA建库 |
| 3.2.5 转录组分析 |
| 3.2.6 蛋白处理 |
| 3.2.7 LC-MS/MS上机 |
| 3.2.8 蛋白组分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转录组分析 |
| 3.3.2 蛋白组分析 |
| 3.3.3 转录组和蛋白组的相关性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 LD4 与内质网应激 |
| 3.4.2 LD4 与程序性坏死 |
| 第四章 LD4抗寒的信号通路探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 蛋白提取 |
| 4.2.2 Bradford方法测定蛋白浓度 |
| 4.2.3 等质量蛋白样品电泳(SDS-PAGE) |
| 4.2.4 考马斯亮蓝染色 |
| 4.2.5 蛋白切胶回收 |
| 4.2.6 蛋白进行胶内酶解 |
| 4.2.7 LC-MS/MS上机 |
| 4.2.8 质谱结果分析 |
| 4.2.9 细胞凋亡检测 |
| 4.2.10 细胞钙流检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 低温胁迫下LD4 的表达 |
| 4.3.2 利用免疫共沉淀技术和串联质谱技术探究LD4 的相互作用蛋白 |
| 4.3.3 利用免疫共沉底技术和荧光共定位实验验证相互作用 |
| 4.3.4 低温下Bip的表达水平 |
| 4.3.5 细胞凋亡检测 |
| 4.3.6 细胞内钙流检测 |
| 4.3.7 LD4 提高细胞抗寒性能的机制假设 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 LD4 与热休克蛋白 |
| 4.4.2 LD4 与细胞凋亡 |
| 4.4.3 LD4与Ca~(2+)信号通路 |
| 第五章 LD4与CaM的抗寒功能初步探究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 南极鱼CaM、CaMm、LD4+CaM及 LD4+CaMm基因的表达分析 |
| 5.3.2 LDH细胞毒性分析 |
| 5.3.3 细胞活性检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 CaM蛋白通过调节Ca~(2+)响应低温胁迫 |
| 5.4.2 钙调蛋白的N-末端是关键功能域 |
| 5.4.3 LD4和CAM与 Ca~(2+)的关系 |
| 第六章 结论 |
| 第七章 展望 |
| 7.1 LD4 与全球变暖 |
| 7.2 LD4 与多重压力 |
| 7.3 LD4 与免疫 |
| 7.4 LD4 与相变 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（3）黄粉虫抗冻蛋白的表达、纯化及定向进化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 前言 |
| 1.1 抗冻蛋白的简介 |
| 1.2 抗冻蛋白的分类 |
| 1.2.1 鱼类抗冻蛋白 |
| 1.2.2 昆虫抗冻蛋白 |
| 1.2.3 植物抗冻蛋白 |
| 1.2.4 微生物抗冻蛋白 |
| 1.3 抗冻蛋白的性质 |
| 1.3.1 非依数性的降低溶液冰点 |
| 1.3.2 抑制冰晶的重结晶 |
| 1.3.3 修饰冰晶形态 |
| 1.4 抗冻活性的测定 |
| 1.4.1 热滞活性的测定 |
| 1.4.2 低温保护活性测定 |
| 1.5 定向进化技术 |
| 1.5.1 定向进化技术简介 |
| 1.5.2 定向进化技术中常用到的策略 |
| 1.5.3 定向进化的应用及前景 |
| 1.6 本论文研究的意义和内容 |
| 1.6.1 本论文研究的意义 |
| 1.6.2 本论文研究的内容 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 工具酶及实验试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 培养基及主要溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.2 大肠杆菌的化学转化 |
| 2.2.3 琼脂糖DNA凝胶电泳 |
| 2.2.4 质粒pET-DsbA-TmAFP的构建 |
| 2.2.5 十二烷基硫酸钠聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.2.6 表达质粒pET-DsbA-TmAFP在E.coli中表达条件的优化 |
| 2.2.7 蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.8 蛋白的活性检测 |
| 2.2.9 蛋白对大肠杆菌在低温下的保护作用 |
| 2.2.10 抗冻蛋白基因上引入突变位点 |
| 2.2.11 抗冻蛋白单密码子突变库的构建及验证 |
| 2.2.12 单密码子突变库中突变蛋白的初筛 |
| 2.2.13 确认初筛获得的正向突变 |
| 2.2.14 纯化验证正向突变蛋白 |
| 3. 结果与讨论 |
| 3.1 蛋白表达系统的构建及表达条件的优化 |
| 3.1.1 表达载体pET-DsbA-TmAFP的构建 |
| 3.1.2 重组质粒表达条件的优化 |
| 3.2 蛋白的表达、纯化及活性测定 |
| 3.2.1 蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.2 蛋白活性的测定 |
| 3.3 融合蛋白对细菌在低温下的保护作用 |
| 3.4 黄粉虫抗冻蛋白的定向进化 |
| 3.4.1 单密码子突变文库的构建 |
| 3.4.2 突变文库中突变蛋白的初筛 |
| 3.4.3 复筛验证初筛获得的正向突变蛋白 |
| 3.4.4 纯化验证复筛获得的正向突变蛋白 |
| 4. 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 论文的创新点 |
| 4.3 论文的不足之处 |
| 5. 展望 |
| 6. 参考文献 |
| 7. 发表论文情况 |
| 8. 致谢 |
| 附录 |
（4）植物抗冻蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 植物抗冻蛋白的发现 |
| 2 抗冻蛋白的效应及抗冻活性的评价方法 |
| 2.1 抗冻蛋白的效应简介 |
| 2.2 抗冻蛋白抗冻活性评价方法 |
| 3 植物抗冻蛋白抗冻机理 |
| 4 植物抗冻蛋白研究进展及应用 |
| 5 结语 |
（5）抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性表征（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗冻肽概述 |
| 1.1.1 抗冻肽定义及分类 |
| 1.1.2 抗冻肽的功能及其作用机制 |
| 1.1.3 抗冻肽的应用 |
| 1.2 外源蛋白表达系统的研究进展 |
| 1.2.1 外源蛋白表达系统的分类 |
| 1.2.2 载体系统表达外源蛋白的影响因素 |
| 1.3 乳酸乳球菌食品级表达载体的研究进展 |
| 1.4 研究意义及主要内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第二章 抗冻肽表达质粒的构建及其在乳酸乳球菌中的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验菌种与材料 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.2.3 主要实验试剂和培养基配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 抗冻肽序列SF-P的乳酸乳球菌表达载体的构建示意图 |
| 2.3.2 抗冻肽SF-P序列和重组质粒pUC57-SF-P的构建 |
| 2.3.3 重组质粒pUC57-SF-P的扩增和酶切鉴定 |
| 2.3.4 乳酸乳球菌表达载体pNZ8149的提取 |
| 2.3.5 抗冻肽目的基因SF-P和乳酸乳球菌表达载体pNZ8149 的连接 |
| 2.3.6 乳酸乳球菌表达载体的电击转化 |
| 2.3.7 乳酸杆菌肉汤培养基(Elliker Broth)筛选阳性菌落 |
| 2.3.8 重组质粒pNZ8149-SF-P的 PCR鉴定 |
| 2.3.9 重组质粒pNZ8149-SF-P的测序鉴定 |
| 2.3.10 重组菌株的诱导表达 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 重组质粒pUC57-SF-P的酶切鉴定 |
| 2.4.2 阳性克隆菌株的筛选 |
| 2.4.3 重组质粒pNZ8149-SF-P的PCR鉴定结果 |
| 2.4.4 重组质粒pNZ8149-SF-P的测序鉴定结果 |
| 2.4.5 SDS-PAGE和Western-Blot鉴定抗冻蛋白的表达 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 重组菌株的诱导表达条件的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究培养时间对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.3.2 研究培养pH对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.3.3 研究培养温度对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.3.4 研究诱导剂Nisin浓度对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.3.5 正交试验设计优化诱导表达条件 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 培养时间对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.4.2 培养pH对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.4.3 培养温度对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.4.4 诱导剂Nisin浓度对重组菌株诱导表达目的蛋白的影响 |
| 3.4.5 重组菌株诱导目的蛋白的表达条件优化分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 重组菌株抗冻胁迫活性功能的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 实验试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 主要实验试剂和培养基配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 冷冻胁迫前后生长曲线的测定 |
| 4.3.2 细胞存活率的测定 |
| 4.3.3 冷冻胁迫前后酸化活力的测定 |
| 4.3.4 冷冻胁迫前后胞外和胞内乳酸脱氢酶活力的测定 |
| 4.3.5 冷冻胁迫前后胞外和胞内β-半乳糖苷酶活力的测定 |
| 4.3.6 冷冻胁迫前后菌体细胞凋亡的测定 |
| 4.3.7 冷冻胁迫后菌体热滞活性的测定 |
| 4.3.8 冷冻干燥前后细胞内k~+,Na~+浓度的变化 |
| 4.3.9 冷冻干燥后菌体细胞膜的变化 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 冷冻胁迫对菌体生长状况的影响 |
| 4.4.2 冷冻胁迫对细胞存活率的影响 |
| 4.4.3 冷冻胁迫对菌体酸化活力的影响 |
| 4.4.4 冷冻胁迫对胞外和胞内的乳酸脱氢酶活力的影响 |
| 4.4.5 冷冻胁迫对胞外和胞内的β-半乳糖苷酶活力的影响 |
| 4.4.6 冷冻胁迫对重组菌细胞凋亡的影响 |
| 4.4.7 冷冻胁迫对菌体热滞活性的影响 |
| 4.4.8 冷冻干燥对细胞内外k~+,Na~+浓度的影响 |
| 4.4.9 冷冻干燥对细胞膜的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（6）白蜡虫低温适应分子机制及抗冻蛋白功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 国内外研究现状及评述 |
| 1.2 研究目标和主要研究内容 |
| 1.2.1 关键的科学问题与研究目标 |
| 1.2.2 主要研究内容 |
| 1.2.3 项目来源与经费支持 |
| 1.3 研究的技术路线 |
| 第二章 长春越冬白蜡虫转录组分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 测序结果和de novo组装 |
| 2.2.2 基因功能注释 |
| 2.2.3 GO分类和KEGG代谢通路分析 |
| 2.2.4 可能与低温胁迫相关的转录本 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 信号通路 |
| 2.3.2 细胞膜的流动性 |
| 2.3.3 其它抗冻相关基因 |
| 2.3.4 糖代谢 |
| 2.3.5 抗冻蛋白 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 长春越冬白蜡虫蛋白组分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 蛋白提取 |
| 3.2.2 肽段匹配误差和电荷分布 |
| 3.2.3 鉴定肽段和图谱个数分布 |
| 3.2.4 蛋白鉴定覆盖度分布及参考数据库建设 |
| 3.2.5 GO注释 |
| 3.2.6 COG注释 |
| 3.2.7 Pathway代谢通路注释 |
| 3.2.8 抗冻蛋白预测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 长春越冬白蜡虫和昆明越冬前白蜡虫差异表达基因分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 数据基本分析 |
| 4.2.2 差异基因分析 |
| 4.2.3 差异基因GO富集分析 |
| 4.2.4 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.2.5 差异基因验证 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 糖代谢 |
| 4.3.2 精氨酸和脯氨酸代谢 |
| 4.3.3 热应激蛋白 70 |
| 4.3.4 与抗冻相关的代谢 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 白蜡虫afp候选基因周年表达动态分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 基因表达模式分析 |
| 5.2.2 周年表达动态分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 白蜡虫afp基因c DNA克隆及序列分析 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 基因克隆 |
| 6.2.2 序列分析 |
| 6.2.3 高级结构 |
| 6.2.4 聚类分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章p-afp基因原核表达及热滞活性验证 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 蛋白表达分析 |
| 7.2.2 蛋白纯化分析 |
| 7.2.3 Western Blot结果分析 |
| 7.2.4 热滞活性测定 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 原核表达 |
| 7.3.2 热滞活性 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 白蜡虫afp基因转化烟草的研究 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 实验材料 |
| 8.1.2 实验方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 表达载体构建 |
| 8.2.2 转农杆菌LBA4404感受态细胞 |
| 8.2.3 转基因烟草 |
| 8.2.4 转基因烟草检测 |
| 8.2.5 过冷却点测定 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 讨论与结论 |
| 9.1 讨论 |
| 9.1.1 白蜡虫低温适应的分子机制 |
| 9.1.2 白蜡虫afp基因挖掘 |
| 9.1.3 白蜡虫AFP功能研究 |
| 9.2 结论 |
| 9.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
（7）矮沙冬青抗冻蛋白基因（AnAFP）转化玉米（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 矮沙冬青 |
| 1.1.1 矮沙冬青的分布与种类 |
| 1.1.2 矮沙冬青的生长环境 |
| 1.1.3 矮沙冬青的生物学特性 |
| 1.1.4 矮沙冬青的利用价值 |
| 1.2 抗冻蛋白AFP及抗冻蛋白基因 |
| 1.2.1 抗冻蛋白 |
| 1.2.2 植物抗冻蛋白 |
| 1.2.3 植物抗冻蛋白基因 |
| 1.2.4 矮沙冬青抗冻蛋白 |
| 1.2.5 矮沙冬青抗冻蛋白基因 |
| 1.3 本研究目的意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建pTU-AnAFP植物表达载体 |
| 2.2.2 玉米胚性愈伤组织培养 |
| 2.2.3 植物表达载体转化农杆菌 |
| 2.2.4 农杆菌的浸染转化 |
| 2.2.5 玉米抗性幼胚和胚性愈伤组织的筛选和植株再生 |
| 2.2.6 再生植株的PCR检测 |
| 2.2.7 低温胁迫处理后转基因玉米和野生型玉米的表型观察 |
| 2.2.8 T_1代稳定阳性植株的Southern杂交检测 |
| 2.2.9 荧光定量PCR检测阳性植株AnAFP表达量 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 构建植物表达载体pTU-AnAFP |
| 3.1.1 矮沙冬青抗冻蛋白基因ORF的PCR扩增产物 |
| 3.1.2 重组菌落的PCR鉴定 |
| 3.1.3 阳性克隆的测序结果 |
| 3.1.4 转化表达载体的农杆菌菌株 |
| 3.2 玉米愈伤组织的获得 |
| 3.3 农杆菌介导转化玉米及抗性玉米再生 |
| 3.3.1 农杆菌介导的玉米转化 |
| 3.3.2 抗性愈伤组织的获得 |
| 3.3.3 转基p因植株的再生 |
| 3.4 转基因再生植株的分子检测 |
| 3.4.1 T_0代的转基因植株PCR检测 |
| 3.4.2 T_1代的转基因植株PCR检测 |
| 3.4.3 低温胁迫处理后转基因玉米和野生型玉米的表型观察 |
| 3.4.4 T_1代的转基因植株Southern blot检测 |
| 3.4.5 荧光定量PCR检测阳性植株AnAFP表达量 |
| 4 讨论 |
| 4.1 转基因阳性植株的分子检测 |
| 4.2 AnAFP基因在玉米中异源表达受低温胁迫的影响 |
| 4.3 抗冻蛋白AnAFP的耐寒性机制 |
| 4.4 抗冻基因的研究现状 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（8）转昆虫抗冻蛋白基因棉花的分子检测及其耐寒性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 低温冷害与昆虫抗冻蛋白 |
| 第二章 抗寒转基因植株的检测方法 |
| 1 传统的检测方法 |
| 1.1 分子水平检测 |
| 1.1.1 基因组水平检测 |
| 1.1.2 转录水平检测 |
| 1.1.3 蛋白水平检测 |
| 1.2 生理生化检测 |
| 2 生物传感器检测 |
| 2.1 表面等离子体共振生物传感器 |
| 2.2 多孔硅光学生物传感器 |
| 2.3 压电生物传感器 |
| 第三章 转基因沉默及增强转基因表达的策略 |
| 1 调控转基因表达的基因沉默可能机制 |
| 2 增强转基因表达的策略 |
| 2.1 绝缘子 |
| 2.1.1 增强子阻断绝缘子 |
| 2.1.2 屏蔽绝缘子 |
| 2.2 启动子 |
| 2.3 转化方法策略 |
| 2.4 密码子优化策略 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究正文 |
| 第一章 转昆虫抗冻蛋白基因棉花的分子检测及其抗寒性研究 |
| 1 材料和主要试剂 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组质粒的制备 |
| 2.2 花粉管通道法转化棉花 |
| 2.3 实验室转基因棉花种植 |
| 2.4 卡那素抗性筛选 |
| 2.5 棉花基因组小量提取 |
| 2.6 棉花基因组 PCR |
| 2.7 棉花总 RNA 的提取 |
| 2.8 cDNA 的合成 |
| 2.9 棉花基因组 RT-PCR |
| 2.10 Southern blot 检测 |
| 2.10.1 棉花 DNA 提取 |
| 2.10.2 探针的制备及效率检测 |
| 2.10.3 点杂交 |
| 2.10.4 Southern 杂交 |
| 2.10.5 PCR-Southern |
| 2.11 Western blot 检测 |
| 2.11.1 植物蛋白提取 |
| 2.11.2 SDS-PAGE 及 Western blot |
| 2.12 低温(2℃)对转基因和野生型棉花表型及生理生化指标的影响 |
| 2.12.1 电导率的测定 |
| 2.12.2 丙二醛含量测定 |
| 2.12.3 脯氨酸含量测定 |
| 2.12.4 转基因棉花可溶性蛋白含量测定及 THA 测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 花粉管通道法转化棉花 |
| 3.2 棉花基因组小量提取 |
| 3.3 2011.7 MNS T2 & MNS T1 转基因棉花分子检测 |
| 3.3.1 转基因棉花的 PCR 检测及测序验证 |
| 3.3.2 部分 T2 代棉花进一步分子检测（2011.7 MNS T2） |
| 3.3.2.1 PCR 检测 |
| 3.3.2.2 PCR –Southern 检测 |
| 3.3.2.3 RT-PCR 检测 |
| 3.4 2012.3 Lab1 T3 代棉花分子检测 |
| 3.4.1 PCR 检测 |
| 3.4.2 RT-PCR 检测 |
| 3.4.3 Western blot |
| 3.4.4 转基因阳性结果统计 |
| 3.5 2012.5 Lab2 T3 代转基因棉花代棉花分子检测 |
| 3.5.1 卡纳筛选 |
| 3.5.2 PCR 检测 |
| 3.5.3 Lab2 T3 代转基因阳性结果统计 |
| 3.6 2012.7 MNS T3 & 2012.7 MNS T1 代转基因棉花 PCR 检测 |
| 3.7 T3 转基因棉花 Southern blot 检测 |
| 3.7.1 探针效率检测 |
| 3.7.2 Dot blot 检测 |
| 3.7.3 Southern blot 检测 |
| 3.8 2012.10 Lab T4 转基因棉花耐寒性检测 |
| 3.8.1 T4 转基因棉花室内种植 |
| 3.8.2 T4 代转基因棉花卡纳筛选 |
| 3.8.3 T4 代转基因棉花的抗寒性检测 |
| 3.8.4 T4 代转基因棉花相对电导率和丙二醛、脯氨酸含量的测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于多孔硅生物传感器的转抗冻基因棉花检测 |
| 1 利用单层多孔硅蛋白生物传感器检测抗冻蛋白 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗血清制备 |
| 1.2.2 棉花叶片总蛋白的提取 |
| 1.2.3 单层多孔硅薄膜材料的制备和氧化膜的形成 |
| 1.2.4 多孔硅芯片活化处理 |
| 1.2.5 抗冻蛋白抗体的固定及蛋白的免疫检测 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 2 利用多元光子晶体结构生物传感器检测抗冻蛋白基因 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗冻蛋白基因的准备 |
| 1.2.2 多元光子晶体芯片的结构 |
| 1.2.3 多元光子晶体芯片的制备及功能化处理 |
| 1.2.4 多元光子晶体芯片免疫检测抗冻蛋白基因 AFP |
| 1.3 结果与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结论与展望 |
| 英文缩略语 |
| 个人简介 |
| 硕士期间参加的研究课题和发表的论文 |
| 致谢 |
（9）胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆及对葡萄的遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写符号及中英文对照表 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物的冻害及冻害机理 |
| 1.1 冻害 |
| 1.2 冻害机理 |
| 2 抗冻基因 |
| 2.1 抗冻蛋白的来源及鱼类抗冻蛋白（AFP） |
| 2.2 鱼类 AFP 及在农业中的应用 |
| 2.3 植物抗冻蛋白 |
| 2.3.1 植物 AFPs 基因的发现 |
| 2.3.2 植物 AFP 基因在提高植物抗冻性方面的应用 |
| 2.4 抗冻相关基因 |
| 2.4.1 抗冻转录因子 CBF 家族的发现 |
| 2.4.2 CBFs 与抗冻基因 |
| 3 葡萄遗传转化的研究 |
| 3.1 葡萄再生体系的研究 |
| 3.1.1 葡萄器官发生途径 |
| 3.1.2 胚状体发生途径 |
| 3.2 葡萄遗传转化途径的研究 |
| 3.2.1 根癌农杆菌介导 Ti 质粒介导基因转化葡萄 |
| 3.2.2 发根农杆菌转化葡萄 |
| 3.2.3 基因枪法转化葡萄 |
| 3.2.4 基因枪法和根癌农杆菌介导法相结合转化葡萄 |
| 4 本项目的研究目的和意义 |
| 5 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1. 植物材料 |
| 1.2 菌种与质粒 |
| 1.3 酶与试剂 |
| 1.4 PCR 引物的设计 |
| 1.5 培养基 |
| 1.5.1 细菌培养基 |
| 1.6 缓冲液 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗冻基因 AFP 的克隆 |
| 2.1.1 胡萝卜基因组总 DNA 的提取方法（CTAB 法） |
| 2.1.2 抗冻蛋白 AFP 基因的扩增 |
| 2.2 目的基因片段的回收 |
| 2.3 目的片段与 pGEm-T easy Vector 载体的连接 |
| 2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.4.2 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.5 质粒 DNA 的提取 |
| 2.6 重组质粒的滞后鉴定 |
| 2.7 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 2.8 重组质粒的酶切鉴定体系 |
| 2.9 重组质粒的序列测序 |
| 2.10 AFP 基因序列的生物信息学分析 |
| 3 抗冻基因 AFP 植物表达载体的构建 |
| 3.1 质粒的酶切 |
| 3.2 连接 AFP 和 pBI121 酶切产物 |
| 3.3 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞 |
| 3.4 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.5 中间载体直接导入农杆菌 |
| 3.6 PCR 扩增 |
| 4 葡萄遗传转化 |
| 4.1 葡萄遗传转化再生体系的诱导 |
| 4.1.1 不同生长调节剂种类及浓度对葡萄遗传转化再生体系的影响 |
| 4.1.2 不同糖分处理的试管苗对葡萄遗传转化再生体系的影响 |
| 4.1.3 不同基因型对葡萄遗传转化再生体系的影响 |
| 4.2 不定芽增殖 |
| 4.3 根癌农杆菌介导胡萝卜 AFP 转化葡萄 |
| 4.3.1 卡那霉素筛选浓度确定 |
| 4.3.2 农杆菌浓度和时间对葡萄遗传转化的影响 |
| 4.3.3 羧苄青霉素敏感性试验 |
| 4.3.4 农杆菌叶盘法转化 |
| 4.3.5 转基因植株的 PCR 鉴定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 胡萝卜抗冻蛋白 AFP 基因克隆 |
| 1.1 胡萝卜总 DNA 的提取与目的片段的 PCR 扩增及回收 |
| 1.1.1 重组体的筛选 |
| 1.1.2 重组质粒的滞后鉴定 |
| 1.1.3 目的片段在重组质粒中的 PCR 鉴定 |
| 1.1.4 目的片段的酶切鉴定 |
| 1.2 AFP 基因测序结果及核苷酸序列分析 |
| 1.3 AFP 基因氨基酸序列同源性分析及分子进化分析 |
| 1.4 蛋白一级结构特征及理化性质分析 |
| 1.5 蛋白质二级结构预测 |
| 2. AFP 抗冻基因载体构建 |
| 2.1 pGEM-AFP 和 pBI121 酶切 |
| 2.2 植物表达载体的鉴定 |
| 2.3 中间载体导入农杆菌的鉴定 |
| 2.3.1 农杆菌的转化 |
| 2.3.2 农杆菌转化的鉴定 |
| 3 葡萄遗传转化 |
| 3.1 不同激素组合对葡萄再生体系的影响 |
| 3.1.1 不同糖分处理的葡萄试管苗对不定芽分化的影响 |
| 3.1.2 不同激素组合对葡萄再生体系的影响 |
| 3.1.3 不同基因型对葡萄再生体系的影响 |
| 3.2 葡萄转化 |
| 3.2.1 卡那霉素筛选浓度确定 |
| 3.2.2 菌液浓度和时间的选择 |
| 3.2.3 羧苄青霉素敏感性筛选 |
| 3.2.4 转化再生植株的 PCR 鉴定 |
| 第四章 讨论 |
| 1 胡萝卜 AFP 基因的进化关系 |
| 2 中间表达载体构建策略 |
| 3 影响葡萄遗传转化的因素 |
| 3.1 外植体对再生体系的影响 |
| 3.2 激素的种类和浓度 |
| 3.3 影响葡萄转化的因素——菌液浓度和浸染时间 |
| 3.4 抗性标记基因的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图版说明 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 导师简介 |
（10）新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白的性质及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 昆虫抗冻蛋白结构与功能关系的研究 |
| 1 超强的抗冻活性 |
| 2 规则的一级结构 |
| 3 相似的冰晶结合表面 |
| 4 昆虫AFPs 的起源与演化 |
| 参考文献 |
| 第二章 昆虫抗冻蛋白作用机理的研究进展 |
| 1 吸附-抑制理论 |
| 2 影响AFP 热滞活性的因素 |
| 2.1 AFP 与不同冰晶表面结合的影响 |
| 2.2 AFP 分子大小的影响 |
| 2.3 AFP 溶解度的影响 |
| 2.4 增效剂对AFP 热滞活性的影响 |
| 3 AFPs 与细胞膜的作用机制 |
| 参考文献 |
| 第三章 抗冻蛋白在低温保护生物学领域的研究进展 |
| 1 AFP 对动物胚胎低温保护作用的研究 |
| 1.1 动物胚胎低温保存技术及影响因素 |
| 1.2 AFP 在动物胚胎低温保存中的应用 |
| 1.3 AFP 应用于动物胚胎低温保存的展望 |
| 2 AFP 对真核细胞和脏器的低温保护作用及保护机理研究 |
| 2.1 在0-4℃低温下的保护作用 |
| 2.2 在零下低温的保护作用 |
| 2.3 AFP 在低温保存中的作用机理 |
| 3 AFP 在食品冷冻保鲜领域的应用前景 |
| 4 转基因抗冻生物的研究进展 |
| 4.1 AFP 转基因动物的研究 |
| 4.2 AFP 转基因植物的研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP 的表达与性质研究 |
| 第一章 光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752 的原核表达及性质研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 常规溶液 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 抗冻蛋白基因Apafp752 的克隆 |
| 1.5 原核表达载体的构建 |
| 1.6 融合蛋白TrxA-ApAFP752 的表达、SDS-PAGE 检测及纯化 |
| 1.7 蛋白印迹分析 |
| 1.8 融合蛋白TrxA-ApAFP752 的热滞活性测定 |
| 1.9 体外低温保护活性分析 |
| 1.10 pH 稳定性和热稳定性 |
| 1.11 三维结构模型建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 ApAFP752 的序列分析 |
| 2.2 原核表达载体的构建 |
| 2.3 TrxA- ApAFP752 的表达及纯化 |
| 2.4 TrxA-ApAFP752 对冰晶形态的修饰作用 |
| 2.5 体外低温保护活性分析 |
| 2.6 pH 稳定性和热稳定性 |
| 2.7 ApAFP752 的三维结构预测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752 的热力学性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 重组抗冻蛋白ApAFP752 的制备 |
| 1.2 差示扫描量热（DSC）分析 |
| 1.3 热重分析 |
| 1.4 圆二色光谱分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 差示扫描量热（DSC）分析 |
| 2.2 热重分析 |
| 2.3 CD 光谱分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 小分子物质对重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP752 的增效作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 重组ApAFP752 的制备 |
| 1.3 热滞活性测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 盐离子对ApAFP752 的增效作用 |
| 2.2 羧基化合物对ApAFP752 的增效作用 |
| 2.3 多羟基化合物对ApAFP752 的增效作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 两种重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914 的比较研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 His-ApAFP914 的引物设计与合成 |
| 1.3 EGFP-ApAFP914 的引物设计与合成 |
| 1.4 抗冻蛋白基因Apafp914 和绿色荧光蛋白基因egfp 的PCR 扩增 |
| 1.5 原核表达载体pET28a-Apafp914 的构建 |
| 1.6 原核表达载体pET28a-egfp-Apafp914 的构建 |
| 1.7 感受态细胞的制备及转化 |
| 1.8 重组蛋白His-ApAFP914 的表达及SDS-PAGE 检测 |
| 1.9 重组蛋白His-ApAFP914 包涵体的复性及纯化 |
| 1.10 重组蛋白EGFP-ApAFP914 的表达及SDS-PAGE 检测与纯化 |
| 1.11 重组蛋白ApAFP914 的蛋白印迹分析 |
| 1.12 两种重组ApAFP914 的热滞活性测定及冰晶形态观察 |
| 1.13 两种重组ApAFP914 的体外低温保护活性分析 |
| 1.14 pH 稳定性和热稳定性检测 |
| 1.15 His-ApAFP914 的圆二色光谱分析 |
| 1.16 ApAFP914 三维结构模型建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 ApAFP914 的序列分析 |
| 2.2 原核表达载体pET28a-Apafp914 的构建 |
| 2.3 原核表达载体pET28a-egfp-Apafp914 的构建 |
| 2.4 His-ApAFP914 的表达及纯化 |
| 2.5 EGFP-ApAFP914 的表达与纯化 |
| 2.6 重组ApAFP914 的热滞活性测定及冰晶形态观察 |
| 2.7 重组ApAFP914 体外低温保护活性分析 |
| 2.8 两种重组ApAFP914 的pH 稳定性和热稳定性 |
| 2.9 His-ApAFP914 的CD 光谱分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 光滑鳖甲抗冻蛋白生物信息学研究及结构与功能的比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 序列比对、疏水性及等电点分析方法 |
| 1.3 圆二色光谱分析 |
| 1.4 三维结构模型建立 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 氨基酸序列同源性检索 |
| 2.2 序列分析 |
| 2.3 同源进化树的构建 |
| 2.4 疏水性分析 |
| 2.5 二级结构测定 |
| 2.6 三维结构预测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 重组光滑鳖甲抗冻蛋白的低温保护应用研究 |
| 第一章 重组光滑鳖甲抗冻蛋白内源性表达对菌体低温存活的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 感受态细胞的制备及转化 |
| 1.3 重组蛋白EGFP-ApAFP914 在菌体中的表达及检测 |
| 1.4 表达菌低温存活率的测定 |
| 1.5 低温处理后表达菌的生长曲线 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白在菌体中的表达及检测 |
| 2.2 表达菌低温存活率的测定 |
| 2.3 低温处理后表达菌的生长曲线 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组光滑鳖甲抗冻蛋白改善哺乳动物红细胞的低温保存 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 重组光滑鳖甲抗冻蛋白ApAFP914 的制备 |
| 1.3 红细胞的制备 |
| 1.4 重组ApAFP914 对红细胞的毒性检测 |
| 1.5 抗冻蛋白对低温保存红细胞的保护分析 |
| 1.6 红细胞渗透性分析 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 rApAFP914 对红细胞的毒性分析 |
| 2.2 rApAFP914 对零下低温-3℃处理的红细胞的保护作用 |
| 2.3 rApAFP914 对4℃处理的红细胞的保护作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组光滑鳖甲抗冻蛋白对反复冻融的乳酸脱氢酶活性影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 重组光滑鳖甲抗冻蛋白的制备 |
| 1.3 重组光滑鳖甲抗冻蛋白的热滞活性测定 |
| 1.4 测定使乳酸脱氢酶LDH 失活的冻融次数 |
| 1.5 重组光滑鳖甲抗冻蛋白对LDH 的低温保护分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组光滑鳖甲抗冻蛋白的热滞活性测定 |
| 2.2 LDH 失活冻融次数的确定 |
| 2.3 重组ApAFPs 对LDH 活性影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 结论与展望 |
| 1、新疆荒漠甲虫光滑鳖甲抗冻蛋白的表达及性质研究 |
| 2、光滑鳖甲抗冻蛋白的低温保护应用研究 |
| 附录1 英文缩略语 |
| 附录2 主要实验仪器 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
四、抗冻蛋白基因转化植物的研究展望（论文参考文献）
- [1]小麦重结晶抑制蛋白IRI基因低温表达模式及启动子活性鉴定[D]. 丁夕涵. 沈阳农业大学, 2019(03)
- [2]抗冻蛋白基因ld4提高鱼类抗寒性能的分子机制研究[D]. 胡瑞芹. 上海海洋大学, 2019(06)
- [3]黄粉虫抗冻蛋白的表达、纯化及定向进化的研究[D]. 魏镇. 天津科技大学, 2019(08)
- [4]植物抗冻蛋白研究进展[J]. 王羽晗,李子豪,李世彪,陈驰航,王瑜麟,张旸. 生物技术通报, 2018(12)
- [5]抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性表征[D]. 张莉. 上海交通大学, 2018(06)
- [6]白蜡虫低温适应分子机制及抗冻蛋白功能研究[D]. 于淑惠. 中国林业科学研究院, 2016(01)
- [7]矮沙冬青抗冻蛋白基因（AnAFP）转化玉米[D]. 陈佳佳. 四川农业大学, 2015(07)
- [8]转昆虫抗冻蛋白基因棉花的分子检测及其耐寒性研究[D]. 陈亮亮. 新疆大学, 2013(10)
- [9]胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆及对葡萄的遗传转化[D]. 褚明宇. 甘肃农业大学, 2012(12)
- [10]新疆荒漠昆虫光滑鳖甲抗冻蛋白的性质及功能研究[D]. 毛新芳. 新疆大学, 2011(11)