一、肿瘤抗原MAGE-A亚家族HLA-A2限制性CTL表位的预测及分析（论文文献综述）
张秀敏,李侠,李增山[1]（2020）在《肿瘤相关基因MAGE-n的发现及研究进展》文中认为黑色素瘤抗原-n（MAGE-n）基因是本实验室从肝癌细胞系中克隆得到的MAGE家族新成员,该基因与已报道的MAGE家族基因不同,但与MAGE-A家族基因具有同源性,与MAGE-6、MAGE-3同源性最高。我们分别检测了MAGE-n在不同组织、细胞中的表达和分布情况,结果发现:在正常肝组织、肝硬化组织及其它非肿瘤组织中未检测到MAGE-n的表达,而在肝细胞癌、胃癌等恶性肿瘤组织中表达率较高,且在其他不同肿瘤中的表达水平有差异。后续研究筛选鉴定出了HLA-A2限制性CTL表位,体内外实验均显示出良好的抗肝癌免疫效应。MAGE-n的这种表达模式和免疫特性与MAGE家族其他基因相同,提示其可作为肿瘤免疫治疗,尤其是肝癌免疫治疗的靶分子,为肝癌的免疫治疗研究提供新的策略。现就MAGE-n的研究进展作以下综述。
徐照旭[2]（2020）在《TEX19促进浆液性卵巢癌的进展且是表位肽疫苗免疫治疗的潜在靶点》文中研究指明目的:卵巢癌（Ovarian cancer,OC）由于其缺乏有效的早期诊断策略以及肿瘤的复发和耐药性,成为全世界死亡率最高的妇科恶性肿瘤。目前,卵巢癌主要的治疗方式还是肿瘤细胞减灭术辅以术后化疗,然而患者的预后水平仍较差,其中最常见的上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）的5年生存率小于30%。因此,迫切需要筛选和开发具有高灵敏度和特异性的生物标志物,这对于卵巢癌发病机制的阐明、早期诊断策略的研究以及开发新的治疗方式具有重要的指导意义。睾丸表达蛋白19（Testis expressed 19,TEX19）是近几年被鉴定的癌症/睾丸抗原（Cancer/testis antigen,CTA）之一并已被发现在多种肿瘤中高表达,但是TEX19在浆液性卵巢癌（serous ovarian cancer,SOC）的临床意义和功能中的研究还相对较少。本研究旨在探讨TEX19蛋白在SOC中的表达、临床意义及其对SOC细胞的增殖、迁移及侵袭的影响并进一步筛选用于设计抗肿瘤多肽疫苗的候选表位,为SOC新的生物标志物与治疗策略的进一步研究提供参考。方法:1.通过免疫组织化学评估98例人卵巢癌组织及癌旁组织TEX19蛋白的表达水平。2.利用ROC曲线确定TEX19蛋白表达水平的界值。3.分析TEX19蛋白表达水平与SOC患者临床病理参数的关系。4.通过Kaplan Meier plotter分析TEX19 m RNA表达水平与患者预后的相关性。5.利用Western blotting、q RT-PCR和免疫荧光实验检测TEX19蛋白和m RNA在卵巢癌细胞系和正常卵巢上皮细胞系中的表达水平。6.通过si RNA技术敲低TEX19,并进一步利用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验研究TEX19对SOC细胞株增殖、迁移和侵袭的影响。7.利用IEDB数据库和pepsite2在线分析工具用于筛选潜在的TEX19的HLA-A*0201限制性表位。8.通过T2亲和力实验验证通过上述方法筛选得到的表位肽与HLA-A*0201分子的结合能力。9.通过MOE分子模拟软件对潜在优势候选表位与HLA-A*0201分子相互作用进行分析。结果:1.免疫组织化学结果显示TEX19在人卵巢癌组织中蛋白表达水平显着高于癌旁组织（P=0.0061）。2.TEX19蛋白表达水平与SOC患者临床病理参数进行相关性分析,结果表明TEX19的高表达与TNM分期（P=0.008）、淋巴结转移（P=0.014）和浸润深度（P=0.008）具有显着的相关性。3.Kaplan Meier plotter分析结果显示TEX19 m RNA表达水平高的患者总体生存期（Overall survival,OS）和无病生存期（Progression-free survival,PFS）较短（P<0.05）。4.Western blotting、q RT-PCR和免疫荧光实验发现TEX19蛋白和m RNA在浆液性卵巢癌细胞系OVCAR-3、A2780和HO-8910中蛋白表达上调（P<0.05）。5.CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验证明TEX19的敲低显着抑制了OVCAR-3和A2780细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P<0.05）;6.利用IEDB数据库和pepsite2在线分析工具筛选得到的四条来自TEX19氨基酸序列的候选表位肽。7.通过T2亲和力实验及MOE分子对接模拟分析结果表明四条来自TEX19氨基酸序列的候选表位肽中TL（TLAAAPEGL）能与HLA-A*0201分子结合,且预测结果显示TL与HLA-A*0201分子具有较紧密的相互作用。结论:1.TEX19在卵巢癌中存在明显上调,可能在SOC的增殖、侵袭和转移中发挥关键作用并可能指示SOC患者的不良预后。2.取自TEX19氨基酸序列的TL与HLA-A*0201分子有较强的亲和力,可能是抗SOC治疗性表位肽疫苗的候选优势表位肽。
李申奥[3]（2019）在《胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定》文中提出目的:预测胶质瘤相关抗原MAGE-D4的HLA-A2限制性T细胞抗原肽,分析这些抗原肽负载DC后是否能诱导出具有肿瘤杀伤作用的T细胞,为MAGE-D4的胶质瘤免疫治疗提供实验依据。方法:（1）MAGE-D4表位肽的预测:利用SYFPEITHI和BIMAS网站,分析HLA-A*0201限制性MAGE-D4 T细胞抗原肽,筛选高得分的候选肽;（2）肽-HLA-A2亲和力检测:合成筛选出的抗原肽,将抗原肽与T2细胞孵育,流式细胞仪检测HLA-A2表达荧光强度,分析抗原肽肽与HLA-A2的亲和力;（3）HLA-A*0201表型的筛选鉴定:提取胶质瘤细胞U87的DNA,用HLA-A*0201特性引物进行PCR鉴定;分离健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）,用流式细胞仪筛选HLA-A2健康志愿者。（4）树突状细胞（DC）的体外诱导培养及鉴定:分离HLA-A*0201健康志愿者的外周血PBMC,使用磁珠分选法从PBMC中分离出CD14+细胞,将用细胞因子（rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-a）与CD14+细胞孵育,诱导出成熟的DC,并通过形态学观察、细胞表面标志物（CD83,CD80,CD1a和HLA-DR）的流式细胞术检测对DC进行鉴定。（5）MAGE-D4抗原肽负载DC的制备:将细胞因子诱导培养至第3和第5天的DC用MAGE-D4抗原肽刺激,继续培养至第8天,收集MAGE-D4抗原肽负载DC;（6）效应T细胞的制备:T细胞磁珠分选试剂盒分离HLA-A*0201健康志愿者PBMC中的T细胞,将T细胞与MAGE-D4表位肽负载的DC（T细胞:DC为10:1）孵育,培养至第4天,再以同样的比例与MAGE-D4抗原肽负载的DC孵育,并加入IL-2继续培养4天,然后分别CCK-8和ELISPOT检测T细胞的增殖和分泌INF-γT细胞的频数。（7）效应T细胞杀伤实验:以10:1、20:1的效应细胞:靶细胞孵育,乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定效应T细胞对U87细胞的杀伤作用。结果:（1）通过网站预测出HLA-A*0201限制性候选肽,序列如下:P1（SLLLVILGV）,P2（LLQERANK）,P3（CLPPPNVIL）,P4（ILSNEPWEL）和P5（RLSLLLVIL）;（2）流式细胞仪检测结果显示,除P1外,其余4个肽均与HLA-A*0201分子具有较好的亲和力（FI大于1）。（3）通过PCR检测确定U87细胞为HLA-A*0201表型,通过流式细胞仪筛选出HLA-A2健康志愿者。（4）CD14+细胞经细胞因子诱导后,呈现出典型的DC形态,并高表达CD1a,CD83,CD80和HLA-DR分子。（5）MAGE-D4抗原肽负载DC孵育T细胞后,CCK-8检测结果显示T细胞增殖,但各组间无统计学差异。IFN-γELISPOT检测结果显示分泌IFN-γ的T细胞显着增加,与对照组比较具有统计学差异（P<0.05）。（6）LDH检测结果显示,当效靶比为20:1时,负载P2-DC+TC组、P3-DC+TC组、P4-DC+TC组和P5-DC+TC组的效应性T细胞对U87细胞杀伤效率均明显高于未负载多肽的DC+TC组（P<0.05）;其中P3-DC+TC组、4-DC+TC组和P5-DC+TC组的杀伤效果随效靶比的增大而增强（P<0.05）。结论:MAGE-D4抗原肽（LLQERANK,CLPPPNVIL,ILSNEPWEL,RLSLLLVIL）致敏的DC可在体外诱导出具有杀伤肿瘤细胞的T细胞,提示这些MAGE-D4抗原肽具有用于胶质瘤免疫治疗的潜力。
沈晗[4]（2013）在《基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及抗肝癌作用研究》文中研究说明原发性肝癌是目前世界上发病广泛的恶性肿瘤之一,患者死亡率很高,目前已排在所有癌症死亡率的第三位。我国是肝癌的高发区,肝癌的新发和死亡患者占全世界50%以上,每年有近30万人死于肝癌。目前临床上针对肝癌的治疗方法仍然以手术切除、化疗栓塞、局部消融和放射治疗等手段为主,但从整体研究来看,上述治疗对延长患者的中位生存期并没有显着作用,而其伴随带来的一些毒副作用还可能加重患者病情。近年来,新兴的肿瘤免疫治疗手段日益受到重视,与传统疗法相比,其优势体现在治疗的个体化和较少的毒副反应。目前,研究较多的肿瘤免疫疗法主要包括肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen, TAA）肽疫苗治疗和过继性免疫细胞治疗两大类,这些免疫治疗手段都是希望通过激发肿瘤患者体内有效的抗肿瘤免疫反应,进而达到杀灭肿瘤细胞的目的。具体来讲,抗肿瘤免疫反应又分为非特异性和特异性的两类,以细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer, CIK）为代表的过继性细胞治疗发挥广泛而非特异性的杀肿瘤作用,目前已在临床上得到一定应用,对部分患者起到了治疗作用；而以TAA肽疫苗和特异性T细胞抗原受体（T cell receptor, TCR）基因修饰的细胞治疗为代表的特异性抗肿瘤治疗则是以特定的TAA为靶点,希望能激发针对性的抗肿瘤免疫反应,强调肿瘤治疗的特异性和靶向性,是目前肿瘤免疫治疗的研究热点和新方向。TAA是一类与肿瘤的发生发展密切相关的抗原分子,其通常在细胞癌变时表达明显增高,而在正常组织中不表达或微量表达,这一特性使TAA在肿瘤治疗中可能具备潜在应用价值。目前认为,能用于特异性肿瘤免疫治疗的理想TAA应该具备以下三个特征：1.在大多数肿瘤中高表达而在正常组织中表达很少；2.其抗原肽能与主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC）分子有效结合；3.其能被体内的T细胞库所识别并能有效激活特异性T细胞抗肿瘤反应。近三十年来,研究者们已从60多种人类TAA中鉴定出超过170多种抗原肽,并通过实验鉴定获知它们能被MHC分子所呈递并被相应的T细胞所识别,被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。虽然基于多种TAA的肽疫苗已开展了临床试验,但到目前为止,美国FDA仅在2010年批准了唯一一个用于治疗前列腺癌的疫苗Provenge,而其他绝大部分TAA肽疫苗的临床试验没有取得理想的效果,使特异性肿瘤免疫治疗的研究遇到了很大困难。近年来,随着研究的不断深入,对肿瘤疫苗疗效不佳的原因有了新的认识。由于肿瘤是由机体自身细胞发生恶性转化而形成的,TAA绝大部分为自身抗原,由于机体的中枢免疫耐受机制,体内能识别这些TAA的TCR高亲和力T细胞在发育早期即被免疫清除,体内存在的识别这些TAA的成熟T细胞,绝大多数为TCR低亲和力的naive T细胞,难以被TAA肽有效激活,这可能是目前肿瘤疫苗治疗困境的重要原因之一。要解决这一问题,在用于肿瘤特异性免疫治疗的TAA肽设计上需要有新的思路。其次,我们需要认识到,由于肿瘤患者体内的自身免疫功能本身处于一种异常状态,即使TAA肽的设计符合要求,单纯依靠其激发患者体内的特异性CTL抗肿瘤免疫反应也是比较困难的。有研究发现,利用肿瘤抗原在体外活化特异性CTL克隆,经扩增后再过继性回输患者体内可能是一条新的治疗途径。但目前认为,在MHC同型个体的T细胞库中,识别某特定抗原肽的抗原特异性T细胞比例仅为10-6～10-4,要在体外迅速诱导出针对TAA的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）克隆是一个较为困难的过程,同时后续的活化扩增也需要较长时间,这是影响后续过继性抗肿瘤功效的一大障碍。目前,研究较多的用于抗肝癌研究的TAA主要包括,甲胎蛋白（a-fetoprotein, AFP）, NY-ESO1和MAGE-A等,虽然基于这些TAA的疫苗已经有部分被候选用于临床试验,但就已经报道的研究结果来看,绝大部分抗肝癌TAA疫苗的试验疗效并不突出。Survivin抗原属于凋亡抑制蛋白家族,它可以通过阻断细胞凋亡的Caspase-9途径抑制肿瘤细胞凋亡,研究发现Survivin广泛表达于各种恶性肿瘤,其中在90%的肝癌患者中高表达,但其在已分化的正常组织中几乎检测不到,因此被认为是具有较高潜在应用价值的TAA靶点。近年来,以Survivin抗原肽为背景的特异性抗肿瘤研究已在恶性黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌和尿路上皮癌等多种恶性肿瘤中开展,部分研究取得了较好的进展,但目前还未见到基于Survivin抗原肽的特异性抗肝癌肿瘤疫苗研究的实验报道。本研究着眼于上述影响肿瘤特异性免疫治疗的相关问题开展实验设计,在综合国外相关领域的最新研究进展及本研究团队的前期研究成果基础上,我们以Survivin抗原为对象开展针对肝癌的特异性抗肿瘤实验工作,整个研究分三部分进行,首先运用生物信息学技术分析可能的Survivin抗原CTL表位,并利用抗原肽点突变技术提高Survivin抗原肽与MHC分子及TCR分子的结合力,希望解决普通TAA肽免疫原性低下的问题；接着我们利用筛选获得的突变Survivin抗原肽刺激T细胞活化,建立反应性CTLs克隆,希望能解决TAA肽难以有效激活癌症患者体内主动免疫反应的问题；最后我们对突变肽诱导反应性CTL克隆的TCR基因家族表达谱变化进行分析,鉴定并克隆出反应性CTL克隆的TCR基因,将其转染外周血来源的T细胞,希望能通过TCR转基因技术在短时间内获得较多数量的具有抗肿瘤反应性的效应T细胞,为打破肿瘤免疫耐受,提高机体抗肿瘤反应能力提供一种肿瘤特异性免疫治疗新方案。一、点突变Survivin抗原表位的生物信息学分析在抗肿瘤免疫反应中,CTLs通过其表面的TCR分子特异性识别肿瘤细胞MHC-I类分子（在人类为HLA-I类分子）递呈的抗原表位肽进而杀伤肿瘤细胞,因此在肿瘤疫苗的设计中,抗原表位设计的好坏直接决定着抗肿瘤免疫反应的效果。有研究报道,在我国肝癌高发区肝细胞癌患者中有超过50%的比例为HLA-A2分子表达阳性,表明HLA-A2基因型可能与肿瘤密切相关,而成为当地癌症发生的一个易感因素,因此本论文所设计的Survivin抗原表位为HLA-A2所递呈。在本部分研究中,我们的目的是利用生物信息学分析及实验验证寻找理想的候选点突变Survivin抗原表位肽。首先,利用两个经典的CTL抗原表位在线预测系统BIMAS（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla bind/）和SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）对野生型Survivin抗原全长氨基酸序列的HLA-A2限制性9氨基酸表位肽进行了预测评分,我们筛选了两个预测系统评分前二十位的表位肽进行分析,寻找评分较低且氨基酸残基第二位不是V、L、I、M、T等疏水性氨基酸的表位肽,最终确定Sur79（KHSSGCAFL）作为候选野生型Survivin表位肽进行氨基酸位点的人工突变,通过比较突变前后的在线评分变化情况,鉴定出两条用于实验的Survivin点突变肽Sur79L2与Sur79M2。我们接着进一步体外合成了五条Survivin表位肽,利用T2细胞进行MHC-肽结合稳定性实验,结果显示野生型表位肽经突变后与HLA-A2分子的亲和力大大提高,证实突变肽Sur79L2、Sur79M2与MHC分子的结合稳定性显着提高,与生物信息学在线预测结果相一致。该部分研究获得了用于后续实验的点突变Survivin表位肽Sur79L2和Sur79M2。二、点突变Survivin表位肽诱导的抗肝癌特异性CTLs克隆的建立CTL是具有细胞毒作用的效应性CD8+T细胞,其可以通过分泌穿孔素、颗粒酶（Granzyme B, GzmB）等物质直接杀伤靶细胞,也可以通过Fas/FasL途径诱导靶细胞凋亡。CTL杀伤力较强,可反复杀伤靶细胞,而且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤,其杀伤过程具有有高效性,抗原特异性和自身MHC限制性、与自然杀伤细胞构成机体抗肿瘤免疫的重要防线。在本部分研究中,我们的目的是利用之前设计并合成的点突变表位肽Sur79L2和Sur79M2在体外诱导肽反应性CTLs,并验证其针对肝癌细胞系的细胞毒作用。我们利用密度梯度离心法从一位高表达Survivin抗原的]HLA-A2+肝癌患者腹水中分离单个核细胞,单个核细胞贴壁后体外诱导分化为树突细胞（Dendritic cell, DC）,体外诱导10天左右利用流式细胞仪检测成熟DC的表面标记分子表达情况,备用。向腹水来源的肿瘤相关淋巴细胞（tumor-associated lymphocytes, TAL）中分别加入10mM的不同合成表位肽进行首轮刺激培养14天,第二轮刺激加入10mM的抗原肽、300IU/mL的重组人IL-2及诱导成熟的DC,继续培养12天。利用ELISPOT法检测肽刺激后能有效分泌干扰素-γ（Interferon-γ, IFN-γ）的活化淋巴细胞数量；免疫磁珠法分离肽诱导的CD8+T细胞作为效应细胞,以负载合成表位肽的T2细胞作为靶细胞,进行细胞毒试验；将肽刺激的TAL与肝癌细胞系共孵育后,收集淋巴细胞上流式细胞仪检测CD8+T细胞内GzmB的表达情况,倒置相差显微镜观察肝癌细胞形态学变化情况,CytoTox96（?）试剂盒检测CTL对肝癌细胞的裂解情况。结果显示点突变肽Sur79L2和Sur79M2均能有效刺激腹水来源的TAL活化分泌IFN-γ,并能对负载野生肽及突变肽的T2细胞发挥细胞毒作用；与肝癌细胞系共孵育后,能以MHC-Ⅰ类限制性方式有效杀伤肝癌细胞,CD8+T细胞能有效分泌GzmB,肝癌细胞系出现凋亡或坏死样表型变化。该部分研究证实利用点突变Survivin表位肽可以在体外诱导出特异性杀伤肝癌细胞系的CTLs克隆。三、基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选与抗肝癌功能初步研究TCR分子是T细胞表面的跨膜蛋白,其对抗原肽-MHC复合物的特异性识别为T细胞活化提供第一信号,是T细胞发挥免疫功能的最重要分子之一。根据TCR的类型不同,可分为TCRαβ+T细胞和TCRγδ+T细胞,其中TCRαβ+T细胞占T细胞总数的95%以上,而TCRαβ+CD8+T细胞是发挥重要抗肿瘤免疫功能的一类CTLs。研究发现,肿瘤患者体内可有效识别肿瘤抗原的TCRαβ+T细胞缺失是导致肿瘤免疫耐受发生的重要原因之一。近年来,有研究证实特异性TCR基因转导技术能赋予普通成熟T淋巴细胞新的特异性杀伤抗原靶细胞能力,TCR基因修饰的过继性抗肿瘤免疫治疗也成为研究热点。在本部分研究中,我们的目的是从点突变肽体外诱导的CTLs中筛选出具有显着克隆增殖特点的TCR基因,并将其转染健康人T淋巴细胞验证其对肝癌细胞系的识别杀伤能力。我们首先利用流式细胞术对前期点突变表位肽Sur79L2和Sur79M2体外刺激诱导的CTLs进行TCRVβ基因亚家族表达谱检测,与刺激前的TCRVβ基因亚家族表达谱相比较,寻找比例发生显着性升高的TCRVβ基因亚家族,接着利用GenomeLab GeXP遗传分析系统对肽刺激后CTLs的TCRVα和TCRVβ基因表达情况进行精细分析,筛选出现明显单克隆扩增的TCR基因,将单克隆扩增的TCR基因全序列通过PCR法克隆到T载体上,挑取多个克隆测序,将测序结果进行分析比对,重点比对TCR基因CDR3区的序列差异,寻找多个克隆出现相同CDR3区基因序列的TCR基因。将筛选获得的TCR基因插入腺病毒表达载体中,包装出具有感染能力的腺病毒转染HLA-A2+的健康人T淋巴细胞,利用流式细胞术检测转染后特异性TCR基因的表达水平,将TCR基因修饰的T细胞与肝癌细胞系共孵育,验证其对肝癌细胞系的细胞毒作用。结果显示,点突变表位肽Sur79L2诱导的CTLs中TCRVβ9和TCRVβ2两个基因亚家族出现比例升高,而点突变表位肽Sur79M2诱导的CTLs中TCRVβ7和TCRVβ16两个基因亚家族比例升高,进一步的GeXP检测结果显示在Sur79L2诱导的CTLs中出现一个TCRVα24和TCRVβ9基因的单克隆扩增,而在Sur79M2诱导的CTLs中未发现明显的TCR基因单克隆扩增,进一步通过测序比对鉴定出一个针对Sur79L2的TCR基因TCRa24β9,利用腺病毒传输系统将该TCR基因转染HLA-A2+健康人外周血PBMC,将TCR基因修饰的T淋巴细胞与肝癌细胞系共孵育,可观察到显着的细胞毒作用,其杀伤表现为HLA-A2限制性。该部分研究证实利用我们筛选获得突变肽特异性TCRα24β9基因转染修饰健康人T细胞能够实现对肝癌细胞系的有效杀伤。综上所述,本研究利用生物信息学分析结合试验验证筛选到两个与HLA-A2分子结合能力显着提高的点突变Survivin表位肽Sur79L2和Sur79M2,将这两个点突变肽体外刺激活化一名肝癌患者腹水来源的TAL,可获得具有特异性识别杀伤能力的CTLs,并通过进一步的筛选和鉴定获得了针对Sur79L2的特异性TCRα24β9基因,将该TCR基因转染健康人T细胞后,证实TCR基因修饰的T细胞获得了特异性杀伤肝癌细胞系的能力。本研究有望为为今后开发基于突变抗原肽的特异性T细胞过继性肿瘤治疗新方法和新型靶点治疗抗肿瘤TCR基因药物提供有益的参考与借鉴。
时冉冉[5]（2013）在《肿瘤抗原PL2L60 HLA-A2限制性CTL表位鉴定及改造》文中研究指明肿瘤生物治疗在肿瘤的综合治疗中起到很重要的作用,其中肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的热点之一,近年来发展迅速,且不同于传统概念上对疫苗的定义。肿瘤疫苗的主要目的是肿瘤的治疗,而不是用于预防。肿瘤疫苗最大的优势是通过诱发机体全身性抗肿瘤的主动特异性免疫并形成免疫记忆,监测肿瘤的复发,产生有效而持久的抗肿瘤作用,从而有效地治疗肿瘤,并预防复发和转移。新肿瘤疫苗治疗靶点的寻找、肿瘤疫苗治疗的靶向性以及新型佐剂的应用将成为研究肿瘤疫苗的重点。目的本研究的主要目的是筛选和鉴定在肿瘤细胞中高表达的癌睾抗原PL2L60的HLA-A2限制性CTL表位以及对候选的优势表位进行改造,引入一种新的Tyr类似物的改造,这种改造能增强表位的结合力,稳定性以及免疫原性。方法首先,通过使用生物信息学的预测工具NetCTL1.2, BIMAS, SYFPEITHI和IEDB对PL2L60的HLA-A2限制性表位进行预测。得到高分值的野生型九肽,进行初步的筛选和鉴定确定合适的候选肽,随后对候选肽进行1位Tyr以及Tyr类似物的替换。候选表位肽采用标准Fmoc方案进行合成,经RP-HPLC纯化后,质谱分析证实其分子量应符合理论值。通过T2细胞结合力和稳定性实验来检测表位肽与MHC分子的亲和力和稳定性,RT-PCR和Western blot用来分析肿瘤细胞系中PL2L60的表达,胞内因子染色、ELISPOT实验和体内的细胞毒活性实验等检测表位肽诱导CTL的能力,通过酶降解稳定性分析来比较野生型原肽和改造肽在人血清中的降解速率。结果1.基于四个预测程序的结果,我们选择了以下九个天然表位肽：P42（MLLKGEIL）, P49（LLLPELSFM）, P56（FMTGIPEKM）, P274（ILLQINCKL）, P281（KLGGELWGV）, P317（FVASINLTL）, P400（YQPKMVVFV）, P418（YLAAPQNFV）, P522（QLCENLFFL）。随后进行标准的Fmoc固相合成,质谱鉴定符合理论分子量。2.野生型表位P281显示出了较强的亲和力（FI值为2.42）,而且P281的DCso大于4小时,所以选定P281作为母体肽进行改造。8条改造肽中,均表现了较强的亲和力（FI>1）。3.P281以及相关改造肽的体内外实验。①ELISPOT和胞内因子染色实验检测P281以及相关改造肽体外诱导特异性CTL的能力,其中P2811y、 P2811Nal、 P2811CF和P2811F能够在HLA-A2阳性供者的外周血单核细胞中诱导一定数量的特异性的CTL并能释放产生IFN-γ。②体内外细胞毒活性实验中,P2811CF和P2811F均能够诱导特异性CTL并杀伤靶细胞。③交叉反应实验表明P2811CF和P2811F体外诱导特异性CTL均能识别荷P281的T2细胞以及荷相应的改造肽的T2细胞。④P281以及相关改造肽的体内ELISPOT和ELISA实验结果表明P2811CF和P2811F也能在转基因小鼠体内诱导出一定数量的分泌IFN-γ的CTL细胞数。⑤将1y、1Nal、1CF和1F四种改造同样适用于P154、P271天然肽上,经1CF改造后的多肽,效果稳定。4.酶降解稳定性分析比较野生型原肽和改造肽在人血清中的降解速率。结果表明：P2811CF比其他肽更加稳定,在血清中显示出较好的稳定性。结论1.天然表位肽P281及其改造表位均显示出了较强的结合力和稳定性,其中部分改造肽的结合力和稳定性高于母体肽。2.用HLA-A2+健康供者外周血单核细胞,通过ELISPOT和胞内因子染色实验显示P2811CF能诱导一定数量的特异性的CTL并能释放产生IFN-γ;LDH以及CFSE细胞毒性实验显示P2811CF诱导的特异性CTL可以有效杀伤MCF-7（HLA-A2+, PL2L60+）肿瘤细胞,并且具有一定的HLA限制性。3.转基因小鼠体内实验结果显示P2811CF能够在体内能够被自然的加工和呈递,并且能够诱导特异性CTL反应。4.酶降解稳定性分析结果显示P2811CF比其它肽在血清中显示出较好的稳定性。5.将1y、1Nal、1CF和1F四种改造不仅仅适用与P281,也适用于其他表位,其中经1CF改造的天然肽能增强表位的免疫原性。6.综上所述,我们的结果显示天然表位肽P281可能是PL2L60抗原的HLA-A2限制性CTL候选表位:P2811CF能增强表位的结合力,稳定性以及免疫原性。
李艳秋,鲍布和,高默杰,倪兵,吴玉章[6]（2012）在《MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位肽预测及其三维结构构建》文中研究说明目的从理论上分析、预测黑色素瘤抗原（MAGE）-12的人类白细胞抗原（HLA）-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位肽,并构建其三维结构。方法以肿瘤特异性抗原MAGE-12为研究目标,采用超基序法、量化基序法、多项式法、延展基序法与三维结构构建相结合的CTL表位预测方法。结果预测出的MAGE-12的表位中有4个符合HLA-A2限制性CTL表位要求。结论预测出的4个HLA-A2限制性CTL表位为MAGE-12的表位的可能性较大,经后续实验筛选、鉴定后,可用于基于MAGE-12的肿瘤治疗性多肽疫苗的设计研究。
李艳秋,鲍布和,高默杰,倪兵,吴玉章[7]（2012）在《MAGE-12的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位肽的预测及其三维结构构建》文中研究表明【目的】从理论上分析预测肿瘤抗原MAGE-12（melanoma antigen-12）的HLA-A2（histocompatility leukocyte antigen-A2）限制性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）表位肽并构建其三维结构。【方法】以肿瘤特异性抗原MAGE-12为研究目标,采用超基序法、量化基序法、多项式法、延展基序法与三维结构构建相结合的CTL表位预测方法。【结果】预测出的MAGE-12的表位中有4个符合HLA-A2限制性CTL表位要求。【结论】预测出的4个HLA-A2限制性CTL表位为MAGE-12的表位的可能性较大,经后续实验筛选、鉴定后,可用于基于MAGE-12的肿瘤治疗性多肽疫苗的设计研究。
王国珍[8]（2011）在《肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究》文中进行了进一步梳理[背景和目的]肿瘤生物治疗是继手术、放疗及化疗之后的第四种肿瘤治疗方式。而以树突状细胞（Dendritic cells, DCs）为基础的肿瘤免疫治疗是当今肿瘤生物治疗研究的热点。DC是目前发现的具有强大抗原提呈功能的免疫细胞,将肿瘤相关抗原（Tumor-asscociated antigen, TAA）与DC相结合是肿瘤免疫治疗的方式之一。目前所发现的TAA大多具有组织特异性,如AFP抗原只在肝癌中表达,PSA抗原只在前列腺癌中表达,以这些TAA为基础进行肿瘤免疫治疗只能杀伤表达该抗原的肿瘤组织或细胞,其治疗窗窄。因此,寻找可用于大多数肿瘤免疫治疗的肿瘤共有抗原是肿瘤免疫治疗的关键。肝素酶是一种内源性糖苷内切酶,它通过降解基底膜（Basement Membrane,BM）和细胞外基质（Extracellular Matrix ,ECM）中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（Heparan Sulfate Proteoglycans,HSPG）促进细胞的迁移。国内外许多研究表明,肝素酶在绝大多数中晚期肿瘤中表达,与肿瘤患者的预后密切相关。抑制肝素酶的表达可以抑制肿瘤的转移,而将肝素酶转染至肝素酶阴性的肿瘤细胞中可以促进肿瘤的转移。我们过去的研究表明,肝素酶全长cDNA负载的DC可以诱导产生肝素酶特异性的细胞毒T淋巴细胞（Cytotic T Lymphocyte,CTL）,对肝素酶阳性且MHC相匹配的胃癌细胞具有明显的杀伤效应,该研究不仅提示肝素酶可作为肿瘤共有抗原用于肿瘤的免疫治疗,而且在肝素酶的全长氨基酸序列中一定存在能诱导产生肝素酶特异性的CTL表位（Epitopes）。为此,我们进一步采用生物信息学及反向免疫学技术,预测并鉴定了3条人肝素酶抗原表位和2条小鼠肝素酶抗原表位。结果表明,上述多肽表位在体内外均可诱导机体产生肝素酶特异性CTL反应,对肝素酶阳性且MHC相匹配的不同来源的各肿瘤细胞具有明显的杀伤效应;动物实验表明,小鼠肝素酶抗原表位对肿瘤荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗和免疫保护作用。与肝素酶腺病毒疫苗相比,多肽疫苗可以体外合成,没有病毒载体的参与,安体性明显提高,因此具有更广阔的应用前景。但多肽疫苗由于分子量小,免疫原性弱,易降解,体内可能不能诱导足够强的免疫效应,因此限制了其临床应用。为解决这一弊端,1988年Tam首先提出了多抗原肽（Multiple antigen peptides, MAP）的设计策略,即采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质,将若干条（一般为4条或8条）抗原表位单体耦联在一起,形成树枝样结构。这种MAP疫苗的设计原理不仅适用于B细胞表位,而且适用于T细胞表位。基于以上分析,本研究拟在以往研究的基础上,将成功鉴定出的3条人肝素酶CTL表位[277-285（KMLKSFLKA,Hpa277）, 525-533（PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413 （WLS LLFKKL, Hpa405）]和2条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL,mHpa398）分别构建成四分枝肽的MAP疫苗,研究其体内及体外的抗肿瘤活性,并与肝素酶CTL表位单体多肽疫苗诱导的CTL活性进行对比,为肝素酶T细胞MAP疫苗抗肿瘤效应的临床应用提供理论依据。[方法]1、将三条人肝素酶CTL表位[ 277-285（KMLKSFLKA, Hpa277） , 525-533 （PAFSYSFFV,Hpa525）和405-413（WLSLLFKKL, Hpa405）]以及两条小鼠肝素酶CTL表位[519-526（FSYGFFVI, mHpa519）和398-405（LSLLFKKL, mHpa398）]设计成MAP结构,采用标准固相肽合成法（SPSS）合成MAPs;采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度;采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测目标多肽分子量。阴性对照肽选用人HLA限制性流感病毒HLA-A2.1限制性表位（NYKHCFEI）。2、按文献分离培养人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DCs。采用光学显微镜观察其形态,并采用流式细胞术鉴定其细胞表面CD分子的表达。然后以人肝素酶MAP肽、相应单肽分别负载DC后,诱导产生肝素酶特异性CTL,制备效应细胞。采用标准51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对不同靶细胞[SW480结肠癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、KATO-Ⅲ胃癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、U2OS骨肉瘤细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、MCF-7乳腺癌细胞（Hpa-, HLA-A2.1+）、转染了肝素酶cDNA的MCF-7/Hpa乳腺癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）、HepG2肝癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1-）、转染了HLA-A2.1cDNA的HepG2/HLA-A2.1肝癌细胞（Hpa+, HLA-A2.1+）]的免疫杀伤效应;采用同样方法检测上述效应细胞对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC的免疫杀伤活性以研究其毒副作用;采用ELISPOT技术检测上述效应细胞IFN-γ释放情况。3、按文献分离培养C57BL/6-Tg（HLA-A2.1+）小鼠骨髓来源的树突状细胞（mDC）,采用光学显微镜观察其形态,采用流式细胞术鉴定细胞表面CD分子的表达。将所选人肝素酶CTL表位MAP肽、相应单肽负载mDC后,免疫小鼠三次,每周一次。取其脾淋巴细胞作为效应细胞,采用51Cr释放实验检测肝素酶特异性CTL对上述的靶细胞以及自体淋巴细胞和树突状细胞的杀伤效应;采用ELISPOT检测效应细胞IFN-γ释放。4、按文献方法分离培养获得C57BL/6（H-2Kb）小鼠骨髓来源的成熟树突状细胞（mDC）,光学显微镜观察其形态和流式细胞术检测其细胞表面CD分子的表达。用小鼠肝素酶CTL表位多抗原肽、相应单肽分别负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,然后取其脾淋巴细胞当作效应细胞,采用标准51Cr释放试验检测肝素酶多肽诱导的特异性CTL对不同肿瘤细胞[EL-4淋巴瘤细胞(mHpa+,H-2Kb+)、B16黑色素瘤细胞(mHpa+,H-2Kb+)、Lewis肺癌细胞(mHpa+,H-2Kb+)、P815肥大细胞瘤细胞（mHpa+,H-2Kb-）]以及自体淋巴细胞和mDC的免疫杀伤效应。采用ELISPOT检测上述效应细胞IFN-γ释放。5、为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫保护,先将肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,再将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠背部皮下,每10天测一次肿瘤直径,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的免疫治疗作用,先将B16黑色素瘤细胞接种到C57BL/6小鼠皮下,待肿瘤长至1mm左右时,再用肝素酶多肽负载的mDC疫苗免疫C57BL/6小鼠三次,每周一次,一月后处死,比较肿瘤大小。为研究肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠的生存时间的影响,采用免疫治疗的研究方法,观察肝素酶疫苗接种后,记录死亡小鼠的死亡时间、数量及组别,观察时间为三个月。6、实验数据以x±SD表示,采用SPSS11.5统计软件进行t检验,当P﹤0.05时认为有统计学意义。[结果]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成人及小鼠肝素酶MAP肽及相应的单肽。采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度。采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度均在90%以上,达到国际多肽实验标准。所得肽的分子量理论值与实测值之间无明显差异,说明所合成的肽是我们所需的目的多肽。2、体外（In vitro）和离体（Ex vivo）实验表明,人肝素酶特异性CTL对于肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的SW480、U2OS和KATO-Ⅲ细胞具有明显的杀伤效应,且肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;但对HLA-A2.1阳性但肝素酶阴性的MCF-7细胞和肝素酶阳性但HLA-A2.1阴性的HepG2细胞均无杀伤效应,而对肝素酶阳性且HLA-A2.1匹配的MCF-7/Hpa细胞和HepG2/HLA-A2.1细胞,且MAP肽诱导的杀伤效应亦明显高于相应单肽诱导的杀伤效应。提示人肝素酶MAP肽能激发较相应单肽更强的特异性抗肿瘤效应;肝素酶MAP肽诱导的CTL反应具有肝素酶特异性且受HLA-A2.1限制。进一步检测了肝素酶特异性CTL对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DC是否具有免疫杀伤效应,结果表明无论是肝素酶MAP肽诱导的效应细胞,还是相应单肽诱导的效应细胞,均对上述两种靶细胞无明显杀伤效应,提示肝素酶MAP肽疫苗的安全性。ELISPOT检测效应细胞IFN-γ的分泌情况,结果表明MAP肽可以诱导更多的效应细胞产生IFN-γ。在删除CD4+T淋巴细胞后,肝素酶MAP肽及相应单肽诱导效应细胞分泌IFN-γ的水平均下降,提示CD4+T淋巴细胞在CD8+ T淋巴细胞的生成过程中具有重要作用。3、小鼠肝素酶多肽疫苗的研究表明,小鼠肝素酶特异性CTL对肝素酶阳性且H-2Kb阳性的EL-4淋巴瘤细胞、Lewis肺癌细胞以及B16黑色素瘤细胞具有明显的杀伤效应,且小鼠肝素酶MAP肽诱导的杀伤效应明显高于相应单肽诱导的杀伤效应;而对肝素酶阳性但H-2Kb阴性的P815肥大细胞瘤细胞不具有杀伤效应,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和mDC亦不具有杀伤效应。进一步采用ELISPOT检测肝素酶特异性效应细胞IFN-γ的分泌能力,结果显示肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力明显高于相应的单肽;在删除CD4+T淋巴细胞后,上述效应细胞IFN-γ分泌水平均明显下降。4、在体研究小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽对小鼠的免疫保护及免疫治疗效应。免疫保护效应结果表明小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫保护组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未保护组（PBS组）（p<0.05）,且MAP肽组小鼠皮下肿瘤体积明显小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶MAP肽对荷瘤小鼠免疫保护效应高于相应的单肽组。免疫治疗效应结果表明,小鼠肝素酶MAP肽及其相应的单肽免疫治疗组小鼠皮下肿瘤体积明显小于阴性肽组及未治疗组（PBS组）（p<0.05）,且多抗原肽组小鼠皮下肿瘤体积小于相应单肽组（p<0.05）,提示小鼠肝素酶多抗原肽对荷瘤小鼠免疫治疗效应强于相应的单肽组。进一步研究肝素酶多肽疫苗对荷瘤小鼠的生存时间的影响,结果表明,肝素酶MAP肽组荷瘤小鼠生存时间明显长于阴性肽组及未治疗组（PBS组）,同样长于相应的单肽组。[结论]1、采用标准固相肽合成法（SPSS）合成三条人及两条小鼠肝素酶多抗原肽[MAP4-Hpa（525-533）（PAFSYSFFV）,MAP4-Hpa（277-285）（KMLKSFLKA）, MAP4-Hpa（405-413）（WLSLLFKKL）, MAP4-mHpa（398-405）（LSLLFKKL）, MAP4-mHpa （519-526） （FSYGFFVI）]及相应的单肽,采用反相高压液相色谱仪（RP-HPLC）分析其纯度,采用液相色谱/质谱联用（LC/MS）测其分子量。结果表明合成的多抗原肽及相应单肽的纯度达到国际多肽实验标准,所合成的肽的分子量理论值与实测值无明显差异,为我们所需的目的多肽。2、无论人还是小鼠的肝素酶MAP肽体外及离体均可诱导产生较相应单肽更强的抗肿瘤反应,这种抗肿瘤免疫效应是肝素酶特异、且受MHC限制。肝素酶特异性CTL,无论是MAP肽诱导的,还是相应单肽诱导的,对少量表达肝素酶的自体淋巴细胞和DCs均无明显的杀伤效应,提示这种疫苗的安全性。此外,肝素酶MAP肽促进效应细胞IFN-γ的分泌能力强于相应的单肽,这种IFN-γ分泌能力在CD4+T淋巴细胞删除后明显减少,提示肝素酶MAP可以通过促进IFN-γ的分泌以增强非特异性的抗肿瘤效应,CD4+T淋巴细胞在CD8+T淋巴细胞的生成过程中发挥重要作用。3、体内研究证实小鼠肝素酶MAP肽可以增强荷瘤鼠的免疫保护及免疫治疗效应,并且可以明显增加荷瘤鼠的生存率,延长荷瘤鼠的生存时间。以上研究表明,肝素酶MAP肽不仅能激发较相应单肽更强的特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个较相应单肽更强的非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶MAP疫苗具有高效、特异、安全的特点,为肝素酶MAP肽疫苗的临床应用提供了理论和实验依据。
贺菽嘉[9]（2010）在《胶质瘤相关抗原MAGE-D4基因重组、表达特性分析及抗体血清学检测》文中认为目的分析MAGE-D4 mRNA和蛋白在胶质瘤以及其他类型肿瘤组织中的表达情况,探讨血清MAGE-D4自身抗体出现的意义,初步了解MAGE-D4在肿瘤发生发展中的作用,为评价其用于肿瘤的辅助诊断和靶向治疗的可能性提供依据。方法1.采用生物信息学方法对MAGE-D4蛋白的同源性、理化性质、跨膜区域、二级结构、结构域、功能性位点、亚细胞定位及抗原表位进行分析和预测。2.采用RT-PCR方法获得MAGE-D4a全长编码区cDNA,构建MAGE-D4原核重组质粒,经测序正确后转化至Rosetta（DE3）大肠杆菌,IPTG诱导融合蛋白的表达,表达的重组蛋白用Amylose Resin亲和层析分离纯化并进行质谱鉴定。3.用MAGE-D4融合蛋白免疫家兔,分离纯化抗血清;获得的抗血清分别用间接ELISA和Western Blot检测其效价和特异性。4.用RT-PCR和免疫组织化学技术,从mRNA和蛋白水平了解MAGE-D4基因表达的特点,并对其与肿瘤临床病理参数之间的关系进行初步分析。5.用重组MAGE-D4融合蛋白的间接ELISA法,检测胶质瘤等6种肿瘤及正常人血清中抗MAGE-D4抗体的阳性率,初步分析抗体出现的意义。结果1.生物信息学分析结果显示,MAGE-D4是一种不稳定的弱酸性可溶蛋白,无跨膜螺旋,无信号肽;二级结构以α螺旋（59.6%）和无规卷曲（23.8%）为主,在第334-368、450-480氨基酸位置处存在2个卷曲螺旋区域;最邻近距离法预测MAGE-D4蛋白定位于细胞核（55.5%）;MAGE-D4蛋白序列中含有MAGE家族的保守结构域,含有N-糖基化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶、酪氨酸激酶、酪蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶C等磷酸化修饰位点以及多种功能性基序,提示其在细胞生长、黏附及信号传导方面具有潜在功能;MAGE-D4蛋白可能存在多种HLA-A2限制性T细胞表位。2.获得了MAGE-D4的原核表达质粒,通过优化体外培养条件,融合蛋白的表达量可达到菌体总蛋白的47.7%,并且部分以可溶形式存在,亲和层析后得到纯度较高的融合蛋白,经质谱鉴定确定与目的蛋白相符。3.制备的MAGE-D4多克隆抗体纯化后的效价大于1﹕64000,能与MAGE-D4融合蛋白特异性识别并结合。4.在各种肿瘤组织中MAGE-D4 mRNA的表达率分别为:胶质瘤85.48%（53/62）、脑膜瘤76.92%（20/26）、肝癌71.70%（38/53）、结直肠癌81.03%（47/58）;肝癌及结直肠癌癌旁组织中MAGE-D4表达频率低于相应的癌组织（P<0.05）,分别为50.94%（27/53）及41.38%（24/58）。在所检测的11株肿瘤细胞中,肝癌、鼻咽癌、舌癌、卵巢癌等肿瘤细胞中表达MAGE-D4,而胃癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞中不表达。免疫组织化学结果显示,MAGE-D4蛋白主要定位在胞浆;胶质瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、胃癌和结肠癌组织中MAGE-D4蛋白的阳性率分别为77.8%（21/27）、69.6%（16/23）、66.7%（2/3）、50%（1/2）和100%（2/2）;3例正常脑组织和27例肺癌癌旁组织均未检测到MAGE-D4蛋白的表达。统计学分析显示胶质瘤及非小细胞肺癌中MAGE-D4蛋白表达与临床病理参数之间无显着性关联。5.肿瘤病人血清中MAGE-D4抗体的总阳性率为19.34%（47/243）,其中肝癌为29%（10/35）,肺癌为27%（8/30）,结直肠癌为19%（12/64）,胶质瘤为18%（9/51）,胃癌为17%（5/30）,脑膜瘤为9%（3/33）;72例正常人血清中未检出MAGE-D4抗体。结论MAGE-D4在肿瘤组织中具有较高的表达频率,而在癌旁组织和正常组织中表达频率较低或不表达,提示它可能是一种肿瘤相关抗原基因。MAGE-D4在多种类型的肿瘤患者体内能引起体液免疫反应,有望成为肿瘤辅助诊断和免疫治疗的分子标记物。
尚小云[10]（2009）在《基于NY-ESO-1157-165表位的治疗性疫苗的分子设计与免疫学特性研究》文中研究说明细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）在机体控制肿瘤中起重要作用,T细胞识别的是由抗原提呈细胞（antigen presenting cell, APC）表面MHC分子提呈给T细胞抗原受体（T cell antigen receptor, TCR）的一段多肽,即表位（epitope）,基于CTL表位的治疗性肿瘤疫苗已经成为肿瘤综合生物治疗的重要策略之一。迄今为止已从60多种人肿瘤抗原中鉴定出170多个CTL表位,其中基于部分表位的肽疫苗已进入临床试验。临床试验结果表明:一方面,肽疫苗对于机体相对安全,而且易于大规模制备、纯化和质控,显示出诱人的发展空间;但另一方面,基于天然表位（wild type, WT）的肽疫苗免疫原性弱,很难在体内诱导出有效的抗瘤CTL反应。这是因为肿瘤在体内诱导了免疫系统对肿瘤抗原的免疫耐受,表现出免疫系统对肿瘤抗原的特异性免疫低应答或无应答。肿瘤抗原引起的免疫耐受有多种机制,总体可以分为中枢耐受和外周耐受两大类,这两类耐受所包含的机制也不尽相同。肿瘤抗原引起的免疫,既有中枢耐受也有外周耐受,若要在肿瘤免疫治疗中获得理想的疗效,就需要打破由肿瘤抗原引起的免疫耐受。打破免疫耐受最有效的方法就是通过改变致耐受抗原的分子结构,将这些经过改造的抗原给予机体,可特异性终止已建立的耐受。因此,如何对肿瘤抗原进行设计和改造以打破机体的免疫耐受,成了肿瘤治疗性肽疫苗研制的关键问题。在众多增强CTL表位肽免疫原性的策略中,对天然表位肽进行分子改造和修饰被认为是最有前景的方法之一。通过对天然表位肽进行单个氨基酸替换、多肽末端化学修饰或加入非天然氨基酸等可有效提高其免疫原性,诱导更强的CTL活性。诱发有效细胞免疫应答的基础就是T细胞与APC间必须形成稳定的TCR/肽-MHC三分子复合物（TCR/ peptide-MHC complex,简写为TCR /pMHC）结构,CTL表位肽通过两端的残基与MHC分子表面凹槽形成稳定的pMHC复合物,这些残基被称为表位锚着残基（anchor residues）,表位与TCR结合的位点即为非锚着残基。肿瘤抗原的表位改造可以通过改善其与MHC的结合和稳定性达到增强肽免疫原性的目的,或改造TCR结合位点以改变TCR与pMHC结合能力,以增强T细胞的活化,从而克服T细胞耐受,达到使肿瘤消褪的目的。已有研究证实了基于锚着残基改造的候选肽在体内外的实验中均可以一定程度地增强肿瘤特异性CTL的增殖,但这类激动肽（agonist peptide）在肿瘤免疫治疗中都不能产生明显的抑瘤效果。本课题研究中,我们运用分子模拟技术对肿瘤抗原NY-ESO-1的HLA-A*0201限制性T细胞天然表位（wild type, WT）NY-ESO-1157-165进行了非锚着残基的替换。首先借助蛋白质结构数据库（protein database, PDB）数据库中WT特异性TCR-pMHC三元体晶体1G4-9C-A2 （PBD ID:2bnr）,在Insight II工作站上建立1G4-9C-A2结构模型,借助分子动力学模拟、分子柔性对接等技术分析TCR分子与pMHC结合特征,在此基础上,通过计算机丙氨酸突变扫描方法分析天然表位中与TCR分子相互作用的关键位点。结合计算机丙氨酸突变扫描结果和TCR/pMHC相互作用的结构特征,我们以该表位的第四位和第五位为研究对象,对这两个位点进行了天然氨基酸的随机替换,借助结合自由能等计算方法筛选获得系列侯选APL。然后合成多肽通过体外和体内免疫学效应检测进一步筛选可以上调免疫应答的候选APL。体外免疫学效应主要包括肽-MHC分子亲和力检测,APL诱导的特异性CTL分泌细胞因子IFN-γ水平的检测,以及特异性CTL细胞杀伤实验,通过上述实验,我们筛选出了可以上调免疫应答并能和天然表位发生交叉反应的候选APL,该候选APL（NY-ESO-1157-165W5F,简写为W5F）是将天然肽第五位的色氨酸（tryptophan, Trp）替换为苯丙氨酸（Phenylalanine, Phe）。由于此天然肽NY-ESO-1157-165羧基端的半胱氨酸（cysteine, Cys）残基易被氧化,使短肽聚合形成二聚体,影响其免疫性。有研究将其羧基端的半胱氨酸替换为缬氨酸（valine, Val）后可以有效的增强其稳定性,并可以显着提高其免疫原性,在此设计基础之上,结合我们筛选的基于TCR结合位点改造的APL,我们尝试了同时将锚着残基和TCR结合位点进行替换,我们将第五位的色氨酸替换为苯丙氨酸,将第九位的半胱氨酸替换为缬氨酸,基于此,我们得到了一个新的APL:NY-ESO-1157-1655F9V（简写为5F9V）。我们以NY-ESO-1157-1659V（简写为9V）肽作为对照,分析了该APL与HLA-A2分子的亲和力,并结合临床病例,筛选了HLA-A2+NY-ESO-1+的食管癌病人,分离患者外周血单个核淋巴细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC）,分别用9V和5F9V刺激病人PBMC诱导特异性CTL反应,随后检测了APL诱导的特异性CTL分泌细胞因子IFN-γ的水平以及CFSE标记特异性CTL增殖情况,并结合pentamer技术检测诱导出的特异性CTL频率。结果显示,在PBMC可检测到特异性CTL的患者中,其PBMC分别经5F9V和9V肽刺激活化后,5F9V诱导的特异性CTL的频率和分泌细胞因子水平显着高于9V诱导的特异性CTL,其增殖能力也要强于9V肽诱导的CTL,对pentamer标记后的荧光强度进行分析,结果初步提示5F9V比9V诱导的特异性CTL具有更高比例的高亲合力CTL。随后,从特异性CLT库（repertoire）的角度探讨了激动肽5F9V提高天然表位免疫原性的机制,我们利用TCR Vβ各家族特异性抗体和TCR CDR3 spectratyping技术比较分析病人诱导前、天然肽与APL诱导后的特异性CTL库,研究发现APL诱导前后其特异性CTL库谱发生了偏移（bias）,APL与天然肽诱导的特异性CTL库之间也发生了偏移,由此可以推测,5F9V增强的免疫学效应可能是诱发了一群新的具有高亲和力并能与WT肽发生交叉反应的特异性CTL。本研究将反向疫苗学技术与计算机辅助疫苗设计技术相结合,建立了基于分子模拟、分子动力学和结合自由能计算的计算机辅助疫苗设计技术平台,大大的提高了疫苗开发的效率。我们应用该平台对肿瘤抗原表位NY-ESO-1157-165进行了非锚着残基的替换,该疫苗打破了传统的锚着残基改造策略,将肿瘤治疗性多肽疫苗的设计思路由肽-MHC分子相互作用拓展至TCR与pMHC分子复合物的相互作用,我们首次将锚着残基和非锚着残基同时进行了替换。通过In silico分析结合实验研究发现,与天然表位相比,5F9V能形成更稳定的肽-MHC复合物,以及更稳定的TCR/pMHC相互作用。在体内和体外免疫学效应研究中,从细胞因子分泌、细胞杀伤功能及细胞增殖能力等多方面证实了5F9V肽能诱发比天然肽更强的CTL反应。最后通过对激动肽5F9V和WT肽特异性CTL的TCR库谱进行了检测,从分子水平深入分析,证实了APL引起交叉识别及打破免疫耐受的机制可能与其活化了一群新的具有高亲和力的特异性CTL有关,为肿瘤治疗性多肽疫苗设计提供了新的理论基础和技术路线。
二、肿瘤抗原MAGE-A亚家族HLA-A2限制性CTL表位的预测及分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤抗原MAGE-A亚家族HLA-A2限制性CTL表位的预测及分析（论文提纲范文）
（1）肿瘤相关基因MAGE-n的发现及研究进展（论文提纲范文）
| 1 MAGE-n基因 |
| 2 MAGE-n抗原 |
| 3 MAGE-n在肿瘤中的表达 |
| 4 MAGE-n抗原表位的研究 |
| 5 MAGE-n对肿瘤免疫治疗的临床应用 |
| 6 小结与展望 |
（2）TEX19促进浆液性卵巢癌的进展且是表位肽疫苗免疫治疗的潜在靶点（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞/组织来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组织化学 |
| 2.2.2 免疫组织化学结果评价 |
| 2.2.3 细胞株及其培养 |
| 2.2.4 免疫荧光 |
| 2.2.5 Western Blotting实验 |
| 2.2.6 实时荧光定量RT-PCR |
| 2.2.7 TEX19 mRNA表达的生存分析 |
| 2.2.8 TEX19 mRNA的 GSEA基因富集分析 |
| 2.2.9 siRNA与细胞转染 |
| 2.2.10 CCK-8细胞增殖实验 |
| 2.2.11 平板克隆形成实验 |
| 2.2.12 细胞迁移和侵袭试验 |
| 2.2.13 T细胞抗原表位预测 |
| 2.2.14 T2亲和力实验 |
| 2.2.15 候选表位与HLA-A*0201分子相互作用分析 |
| 2.2.16 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组织化学法检测TEX19在人OC组织中的蛋白表达水平 |
| 3.2 人SOC组织中TEX19 蛋白阳性表达的临界值选择 |
| 3.3 SOC患者TEX19 的表达水平与临床病理参数的关系 |
| 3.4 SOC患者TEX19mRNA表达水平与预后的相关性分析 |
| 3.5 人SOC细胞系中TEX19 蛋白和mRNA表达水平 |
| 3.6 敲低TEX19对SOC细胞株增殖能力的影响 |
| 3.7 敲低TEX19对SOC细胞株迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.8 TEX19的HLA-A*0201 限制性CTL表位的预测 |
| 3.9 优势候选表位与HLA-A*0201分子亲和能力的验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定（论文提纲范文）
| 英文缩略词索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 绪论 |
| 实验设计方案 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及抗肝癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 点突变Survivin抗原表位的生物信息学分析及肽-MHC的稳定性检测 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二章 点突变Survivin表位肽诱导的抗肝癌特异性CTLs的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选与抗肝癌功能初步研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
| 毕业论文统计学审稿证明 |
（5）肿瘤抗原PL2L60 HLA-A2限制性CTL表位鉴定及改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 肿瘤疫苗 |
| 1.1.2 多肽疫苗 |
| 1.1.3 多肽的修饰 |
| 1.1.4 非天然氨基酸的应用 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 研究内容与方法 |
| 第2章 PL2L60抗原CTL表位的预测以及改造 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IEDB预测 |
| 2.2.2 BIMAS预测 |
| 2.2.3 SYFPEITHI预测CTL表位 |
| 2.2.4 NetCTL预测 |
| 2.2.5 氨基酸替换 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 表位肽的合成、纯化和鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 候选肽汇总 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 候选肽的合成 |
| 3.2.2 多肽的纯化 |
| 3.2.3 质谱鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PL2L60抗原CTL表位的筛选与鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 细胞系、血液样本与实验动物 |
| 4.1.4 培养基和常用试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 实验所用肿瘤细胞系及血液样本的HLA-I型别鉴定 |
| 4.2.2 RT-PCR检测肿瘤细胞系PL2L60的抗原表达鉴定 |
| 4.2.3 Western Blot实验检测肿瘤细胞系PL2L60的抗原表达鉴定 |
| 4.2.4 T2A2细胞亲和力实验 |
| 4.2.5 肽/MHC复合物稳定性分析 |
| 4.2.6 体外免疫活性检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肿瘤细胞与健康供者分型结果 |
| 4.3.2 肿瘤抗原PL2L60在肿瘤细胞系中的表达情况 |
| 4.3.3 多肽/HLA-A~*0201结合力与稳定性结果 |
| 4.3.4 HLA-A2健康供者的体外免疫活性检测 |
| 4.3.5 HLA-A2.1/Kb转基因小鼠体内免疫活性检测 |
| 4.3.6 酶降解稳定性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文、专利目录及研究成果 |
（6）MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位肽预测及其三维结构构建（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 抗原氨基酸顺序 |
| 1.2 CTL表位预测方案 |
| 1.2.1 超基序方法 |
| 1.2.2 量化基序方法 |
| 1.2.3 候选表位限制性抗原肽多项式方法 |
| 1.2.4 CTL表位预测的延展基序方法 |
| 1.2.5 表位肽的三维结构构建 |
| 1.2.6 候选表位获得方案 |
| 2 结 果 |
| 2.1采用超基序方法与量化基序方法相结合进行MAGE-12的CTL表位预测 |
| 2.2采用超基序方法与多项式方法相结合进行MAGE-12CTL表位预测 |
| 2.3采用超基序方法、量化基序方法、多项式方法、延展基序方法与三维结构构建相结合筛选候选表位多肽 |
| 3 讨 论 |
（7）MAGE-12的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位肽的预测及其三维结构构建（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 抗原氨基酸顺序 |
| 1.2 CTL表位预测方案 |
| 1.2.1 超基序方法: |
| 1.2.3 候选表位限制性抗原肽多项式方法: |
| 1.2.4 CTL表位预测的延展基序方法: |
| 1.2.5 表位肽的三维结构构建: |
| 1.2.6 候选表位获得方案: |
| 2 结果 |
| 2.1 采用超基序方法与量化基序方法相结合进行MAGE-12的CTL表位预测 |
| 2.2 采用超基序方法与多项式方法相结合进行MAGE-12的CTL表位预测 |
| 2.3 采用超基序方法、量化基序方法、多项式方法、 |
| 3 讨论 |
（8）肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究（论文提纲范文）
| 中英文缩写对照 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 人肝素酶 HLA-A2 限制 CTL 表位MAP 疫苗的设计及体内、外抗肿瘤免疫效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 人肝素酶 HLA-A2 限制性 CTL 表位 MAP 疫苗的设计、合成及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 外周血单个核细胞来源树突状细胞分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 肝素酶 CTL 表位多抗原肽(MAP)负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 小鼠骨髓来源的DC 分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第五节 人肝素酶 CTL 表位多抗原肽(MAP)负载的树突状细胞疫苗诱导小鼠体内肝素酶特异性CTL 反应的研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 主要参考文献 |
| 第二部分 小鼠肝素酶 H-2K~b 限制CTL 表位MAP 疫苗的设计及体内抗肿瘤免疫效应研究 |
| 前言 |
| 第一节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位MAP 疫苗的设计、合成及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 小鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 小鼠肝素酶H-2K~b限制性CTL 表位MAP 肽负载的mDC 疫苗体内抗肿瘤免疫效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 小鼠肝素酶 CTL 表位 MAP 肽对荷瘤小鼠的免疫保护和免疫治疗效应研究 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 主要参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述 多肽疫苗抗肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生在读期间发表的文章 |
（9）胶质瘤相关抗原MAGE-D4基因重组、表达特性分析及抗体血清学检测（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 实验流程 |
| 前言 |
| 第一部分 MAGE-D4 的生物信息学分析 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 生物信息学分析数据库及在线软件 |
| 2.2 分析步骤 |
| 结果 |
| 1 MAGE-D4 核苷酸序列分析 |
| 1.1 MAGE-D4 基因基本信息 |
| 1.2 MAGE-D4 电子表达谱分析 |
| 1.3 MAGE-D4a mRNA 密码子偏好性分析 |
| 2 MAGE-D4 蛋白结构与功能分析 |
| 2.1 蛋白质同源性分析 |
| 2.2 MAGE-D4 蛋白的理化性质 |
| 2.3 MAGE-D4 蛋白跨膜信息分析 |
| 2.4 MAGE-D4 蛋白信号肽预测 |
| 2.5 MAGE-D4 蛋白二级结构预测 |
| 2.6 MAGE-D4 蛋白结构域和功能性位点分析 |
| 2.7 MAGE-D4 蛋白亚细胞定位预测 |
| 2.8 MAGE-D4 蛋白 T 细胞抗原表位的预测 |
| 讨论 |
| 第二部分 MAGE-D4 融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 MAGE-D4 基因体外重组 |
| 2.1.1 引物的设计 |
| 2.1.2 PCR 扩增目的基因 |
| 2.1.3 PCR 产物的纯化 |
| 2.1.4 pMAL-c2 质粒的扩增及提取 |
| 2.1.5 目的基因的酶切处理 |
| 2.1.6 质粒的酶切处理 |
| 2.1.7 目的基因与质粒的连接 |
| 2.1.8 重组质粒的转化与筛选 |
| 2.1.9 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.10 重组质粒和菌种的保存 |
| 2.2 MAGE-D4 融合蛋白的体外诱导表达 |
| 2.2.1 感受态细胞的制备(CaCl_2法) |
| 2.2.2 MAGE-D4 融合蛋白在 Rosetta(DE3)宿主菌中的表达 |
| 2.2.3 MAGE-D4 融合蛋白表达形式的确定 |
| 2.2.4 融合蛋白体外表达条件的优化 |
| 2.3 原核表达蛋白的分离纯化及鉴定 |
| 2.3.1 MAGE-D4 融合蛋白的分离纯化 |
| 2.3.2 MAGE-D4 融合蛋白的透析除盐及冷冻干燥 |
| 2.3.3 MAGE-D4 融合蛋白的质谱鉴定 |
| 结果 |
| 1 MAGE-D4 基因体外重组 |
| 1.1 PCR 扩增 MAGE-D4 目的基因 |
| 1.2 重组质粒的鉴定 |
| 2 MAGE-D4 融合蛋白的体外诱导表达 |
| 2.1 融合蛋白在 Rosetta(DE3)宿主菌中的表达 |
| 2.2 MAGE-D4 融合蛋白表达形式的确定 |
| 2.3 融合蛋白体外表达条件的优化 |
| 2.4 原核表达蛋白的分离纯化及质谱分析 |
| 讨论 |
| 第三部分 MAGE-D4 多克隆抗体的制备材料与方法 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 抗原的制备 |
| 2.2 免疫方法 |
| 2.3 抗血清的收集 |
| 2.4 抗血清的纯化与保存 |
| 2.5 间接 ELISA 检测抗血清的效价 |
| 2.6 抗血清的免疫印迹检测(Western Blot) |
| 结果 |
| 1 抗血清的纯化 |
| 2 抗血清效价的测定 |
| 3 抗血清特异性的检测 |
| 讨论 |
| 第四部分 MAGE-D4 基因表达的检测 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总 RNA 的提取 |
| 2.2 总 RNA 的检测 |
| 2.3 cDNA 的合成 |
| 2.4 cDNA 质量的检测 |
| 2.5 MAGE-D4 基因的扩增及电泳鉴定 |
| 2.6 免疫组织化学染色 |
| 2.7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 RNA 质量的检测 |
| 2 cDNA 质量的检测 |
| 3 MAGE-D4 mRNA 表达及其与肿瘤临床病理参数关系的分析 |
| 3.1 肿瘤组织和肿瘤细胞株中 MAGE-D4 mRNA 表达的检测 |
| 3.2 MAGE-D4 mRNA 表达与结直肠癌临床病理参数关系的分析 |
| 4 MAGE-D4 蛋白表达及其与肿瘤临床病理参数关系的分析 |
| 4.1 胶质瘤组织中 MAGE-D4 蛋白的表达及意义 |
| 4.2 非小细胞肺癌组织中 MAGE-D4 蛋白的表达及意义 |
| 4.3 MAGE-D4 蛋白在其他肿瘤组织中的表达 |
| 讨论 |
| 第五部分 MAGE-D4 抗体血清学检测 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料与仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Bradford 法测定包被蛋白的浓度 |
| 2.2 间接 ELISA 检测血清中抗 MAGE-D4 抗体的技术流程 |
| 2.3 抗 MAGE-D4 抗体阳性血清的确定 |
| 2.4 抗原最适包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 2.5 间接 ELISA 具体步骤 |
| 2.6 重复性实验 |
| 2.7 阳性结果的判断 |
| 2.8 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 包被蛋白浓度的测定 |
| 2 抗 MAGE-D4 抗体阳性血清的确定 |
| 3 抗原最适包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 4 血清抗 MAGE-D4 抗体的检测 |
| 4.1 正常人血清抗 MAGE-D4 抗体的检测结果 |
| 4.2 肿瘤病人血清抗 MAGE-D4 抗体的检测结果 |
| 4.3 胶质瘤 MAGE-D4 表达与血清抗体存在的情况 |
| 4.4 MAGE-D4 抗体与胶质瘤临床病理参数关系的分析 |
| 5 重复性实验 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 创新性的自我评价 |
| 问题和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）基于NY-ESO-1157-165表位的治疗性疫苗的分子设计与免疫学特性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 基于肿瘤抗原表位的治疗性疫苗的分子设计与免疫学特性研究 |
| 前言 |
| 第一部分 NY-ESO-1_(157-165)表位TCR结合位点改造设计 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 APLs体外免疫学效应评价 |
| 第一节 各候选肽的合成及其与MHC结合亲和力的评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 APLs体外刺激健康人PBMC免疫学效应的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 APLs在病人PBMC的免疫学效应的评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 APLs体内免疫学效应的评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 APL与WT天然表位肽诱导的特异性CTL库谱比较分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 文献综述一 表位改造在肿瘤治疗性多肽疫苗研究中的进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 T细胞受体多样性分析在特异性免疫应答中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的论文及申请的专利 |
四、肿瘤抗原MAGE-A亚家族HLA-A2限制性CTL表位的预测及分析（论文参考文献）
- [1]肿瘤相关基因MAGE-n的发现及研究进展[J]. 张秀敏,李侠,李增山. 现代肿瘤医学, 2020(11)
- [2]TEX19促进浆液性卵巢癌的进展且是表位肽疫苗免疫治疗的潜在靶点[D]. 徐照旭. 中国医科大学, 2020(01)
- [3]胶质瘤相关抗原MAGE-D4 T细胞抗原肽的预测和鉴定[D]. 李申奥. 广西医科大学, 2019(08)
- [4]基于点突变Survivin表位肽的TCR基因筛选及抗肝癌作用研究[D]. 沈晗. 南方医科大学, 2013(03)
- [5]肿瘤抗原PL2L60 HLA-A2限制性CTL表位鉴定及改造[D]. 时冉冉. 郑州大学, 2013(11)
- [6]MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位肽预测及其三维结构构建[J]. 李艳秋,鲍布和,高默杰,倪兵,吴玉章. 国际检验医学杂志, 2012(20)
- [7]MAGE-12的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位肽的预测及其三维结构构建[J]. 李艳秋,鲍布和,高默杰,倪兵,吴玉章. 武警后勤学院学报(医学版), 2012(07)
- [8]肝素酶CTL表位多抗原肽（MAP）疫苗的设计及其抗肿瘤免疫效应研究[D]. 王国珍. 第三军医大学, 2011(12)
- [9]胶质瘤相关抗原MAGE-D4基因重组、表达特性分析及抗体血清学检测[D]. 贺菽嘉. 广西医科大学, 2010(08)
- [10]基于NY-ESO-1157-165表位的治疗性疫苗的分子设计与免疫学特性研究[D]. 尚小云. 第三军医大学, 2009(05)