一、甜菜夜蛾核多角体病毒sod基因的克隆及原核表达（论文文献综述）
安丽[1]（2021）在《F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用》文中研究指明甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）危害包括白菜、花椰菜、青菜等多种农作物,其分布广泛且具较强的、间歇性的爆发性,对农业经济造成严重损失。杆状病毒专一性感染节肢动物,致病性强且对人畜无害,作为生物杀虫剂广泛应用于防治森林和农作物害虫。甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV）作为环境友好型杀虫剂能有效控制甜菜夜蛾种群数量,利用SeMNPV对甜菜夜蛾进行生物防治备受关注。尽管病毒感染宿主通常造成宿主死亡,但某些情况下病毒不造成宿主死亡,而在宿主体内形成潜伏感染（Latent infection）。当潜伏感染细胞被相同或相似病毒二次感染时,对再次感染的病毒产生排斥,即超感染排斥（Superinfection exclusion）。该排斥机制的研究对抗病毒策略的开发具有重要意义。病毒吸附是病毒成功侵染宿主细胞的第一步。参与吸附的病毒蛋白与宿主细胞表面吸附受体的相互作用作为病毒感染的限速步骤,在病毒感染过程中具有重要作用。前期本实验室通过对SeMNPV无稀释传代建立了SeMNPV潜伏感染细胞株P8-Se301-C1,该细胞对同源SeMNPV具超感染排斥作用,但不影响异源苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV）的再次感染,初步表明对SeMNPV超感染排斥在吸附阶段已产生。目前SeMNPV感染昆虫宿主细胞吸附侵染阶段机制,以及病毒吸附在超感染排斥机制中作用尚未阐明。本研究分别从病毒吸附蛋白及宿主细胞表面吸附受体两方面入手,研究SeMNPV病毒囊膜蛋白F蛋白和细胞受体SeNPC1在SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞吸附阶段,以及P8-Se301-C1细胞对杆状病毒超感染排斥中的作用,阐明SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞吸附阶段分子机制,初步解析P8-Se301-C1细胞对杆状病毒吸附阶段超感染排斥机制。主要研究结果如下:1.通过抗体封闭法封闭SeMNPV的F蛋白位点,病毒在Se301细胞表面的吸附量显着下降。此外,通过Bac-to-Bac系统,把Ac MNPV中的GP64蛋白替换为SeMNPV的F蛋白而构建出重组病毒v Ac WT-GP64KO-F,发现该重组病毒对Se301细胞的吸附能力显着高于野生型Ac MNPV。表明SeMNPV囊膜蛋白F蛋白不仅参与SeMNPV感染Se301细胞的吸附阶段,并且可在Ac MNPV感染Se301细胞的吸附阶段发挥重要作用。2.Ac MNPV在Se301及P8-Se301-C1细胞表面吸附量相当。而v Ac WT-GP64KO-F在P8-Se301-C1细胞表面的吸附量显着低于Se301细胞的,即,SeMNPV F蛋白替换Ac MNPV GP64后影响了P8-Se301-C1细胞对重组Ac MNPV的吸附,导致P8-Se301-C1细胞对异源病毒Ac MNPV在吸附阶段产生排斥。结果表明蛋白在P8-Se301-C1细胞对杆状病毒的超感染排斥中起着关键作用。3.免疫荧光实验结果发现在P8-Se301-C1细胞中未观察到F蛋白信号,表明P8-Se301-C1细胞中Se8转录本可能并没有翻译为F蛋白,P8-Se301-C1细胞对SeMNPV的超感染排斥并非由于F蛋白占据细胞表面吸附位点而影响二次入侵病毒吸附细胞所致。4.使用蛋白酶K和衣霉素处理Se301细胞后,SeMNPV吸附量显着下降,表明SeMNPV在Se301细胞表面的吸附受体本质为糖基化蛋白。以糖基化蛋白为筛选条件,在Se301细胞的转录组数据中挖掘并筛选获得受体相关蛋白NPC1（Niemann-Pick type C1）。无缝克隆Se301细胞Senpc1基因,生物信息学分析表明,Senpc1编码的SeNPC1蛋白为具有多个跨膜域的糖基化蛋白。5.利用NPC1抑制剂处理Se301细胞后影响SeMNPV吸附及子代病毒产量。其中,SeMNPV在细胞表面SeMNPV吸附量下降40.12%,BV产量下降约10倍,多角体产量下降94.28%。通过RNA干扰（RNA interfering）技术干扰Se301细胞中npc1转录本后,SeMNPV在细胞表面的吸附量下降44.76%,但总BV及多角体产量不受影响。以上结果表明SeNPC1蛋白参与SeMNPV感染Se301细胞的吸附阶段。6.对SeMNPV F蛋白及SeNPC1蛋白Domain C进行三级结构建模及分子对接分析,表明F蛋白与SeNPC1蛋白Domain C存在相互作用。该结果暗示F蛋白与SeNPC1分别作为病毒吸附蛋白与宿主吸附受体发生互作。荧光定量PCR检测表明,P8-Se301-C1细胞中Senpc1表达量较Se301细胞的下调5倍,推测Senpc1表达下调降低了SeMNPV对细胞的吸附,从而导致P8-Se301-C1对SeMNPV在吸附阶段的超感染排斥。
刘文彬[2]（2020）在《Vip3Aa杀蜚蠊的作用与机制及其生防工程菌的构建和评价》文中研究指明蜚蠊是“四害”之一,可通过携带的病原菌威胁人类的健康。目前针对蜚蠊的主要防制手段为化学防制,但化学杀虫剂表现出抗药性、害虫的再猖獗和杀虫剂的残毒三大问题。生物防制具有不易产生抗药性、可自然传播、对害虫具有的一定的选择性和无污染等优点。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）可在营养生长阶段分泌一类新型杀虫毒蛋白—营养期杀虫蛋白（Vips）,由于少见耐药性报道是一种有潜力的杀虫蛋白,目前尚未见Vip3Aa蛋白在蜚蠊防制中的相关报道。在杀鳞翅目昆虫的机制中,Vip3Aa蛋白可被昆虫中肠蛋白酶切除N端序列形成活性蛋白。活性蛋白随后穿过围食膜,与中肠上皮细胞顶膜受体结合,导致中肠上皮细胞形成孔洞,最终导致昆虫死亡。N端序列对Vip3A蛋白活性的影响在不同昆虫中存在显着差异。目前针对Vip3Aa杀虫研究仍然处于针对其杀虫机理的研究,而缺乏对其相关分子机制的研究。在生物防制领域,由于蛋白质不稳定的特性,毒力蛋白一般通过构建转基因作物和微生物发挥使用功能。本研究中从Bt菌株中扩增获得vip3Aa基因,并设计新型N端截短vip3Aa基因（j-vip3Aa）,通过原核表达系统成功制备和纯化了 Vip3Aa和J-Vip3Aa蛋白,生测活性显示Vip3Aa蛋白对美洲大蠊和德国小蠊均有杀虫活性。去除N端蛋白后,J-Vip3Aa的杀虫活性低于Vip3Aa蛋白,J-Vip3Aa对中肠消化液的敏感性高于Vip3Aa蛋白。HE染色和扫描电镜显示Vip3Aa可损伤美洲大蠊的中肠和柱状结肠,对嗉囊无影响。Vip3Aa蛋白可引起美洲大蠊解毒酶和蛋白水解酶的活性升高。Vip3Aa蛋白可被胰蛋白酶、美洲大蠊中肠消化液和胰凝乳蛋白酶水解为62 kDa左右蛋白。BBMV成孔实验显示Vip3Aa蛋白可在中肠和柱状结肠形成孔洞。荧光定位实验显示Vip3Aa蛋白和J-Vip3Aa蛋白在中肠和柱状结肠均无结合受体。美洲大蠊中肠转录组分析显示Vip3Aa蛋白给药后,其1539个基因表达上调,763个基因表达下调。通过对凋亡和溶酶体差异基因的分析,结合透射电镜和Hoechst染色结果,Vip3 Aa蛋白可能通过溶酶体-p38MAPK信号通路诱导美洲大蠊中肠上皮细胞的凋亡,从而发挥杀蜚蠊作用。以egfp为指示基因,构建了醋酸锂介导的绿僵菌芽生孢子转化法。vip3Aa基因导入绿僵菌后,杀美洲大蠊和德国小蠊活性分别增强了 3.75倍和4.13倍。初步尝试采用酵母展示系统制备Vip3Aa毒蛋白菌体,野生型酵母不具有杀蜚蠊活性,导入vip3Aa基因后可发挥一定的杀蜚蠊作用。综上所述,Vip3Aa蛋白具有杀蜚蠊作用。Vip3Aa蛋白杀蜚蠊机理不同于杀鳞翅目昆虫,Vip3Aa蛋白不需要切除N端序列即可直接发挥杀蜚蠊作用,且不依赖于和中肠或者柱状结肠受体结合。N端蛋白切除后,Vip3Aa蛋白活性下降,N端蛋白可用于保护Vip3Aa蛋白免受消化液的降解,延长Vip3Aa蛋白作用时间。Vip3Aa蛋白可能通过溶酶体-p38MAPK信号通路诱导美洲大蠊中肠上皮细胞的凋亡,从而发挥杀蜚蠊作用。Vip3Aa蛋白分别构建入绿僵菌和酵母后,可增强绿僵菌的杀蜚蠊活性,使不具有杀蜚蠊活性的酵母产生杀蜚蠊活性。通过上述研究有助于认识Vip3Aa蛋白杀蜚蠊作用及机制,通过和生防菌的结合,有望为蜚蠊的防制提供一种新的选择和一种新的研究思路。
何磊[3]（2019）在《烟芽夜蛾囊泡病毒3h株对甜菜夜蛾几丁质酶活性和表达的影响》文中研究指明几丁质酶是昆虫蜕皮过程中极为重要的参与者与调控者,其正常的代谢对于昆虫生长发育具有至关重要的作用。囊泡病毒作为一种具有较大生防潜力的昆虫病毒,已有研究表明其会造成宿主幼虫生长历期延长、蜕皮困难、无法化蛹的现象。这些现象指示着宿主幼虫几丁质酶的代谢极有可能受到了囊泡病毒的影响。基于此,本研究以期通过对甜菜夜蛾转录组数据的筛选,获得在宿主幼虫感染烟芽夜蛾囊泡病毒3h株（Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h）后显着差异表达的几丁质酶基因。然后通过对HvAV-3h感染和模拟感染幼虫几丁质酶活性及转录、表达模式的分析,从而探明HvAV-3h对宿主几丁质酶的调控,主要研究结果如下:1、甜菜夜蛾几丁质酶基因的克隆与系统发育分析:基于已报道的甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）转录组数据,经过筛选和RT-PCR验证最终获得了HvAV-3h感染后显着差异表达的5个几丁质酶基因（S.exigua chitinase,SeCHIT）和1个几丁质结合域基因（S.exigua chitin-binding domain,SeCBD）。通过分子特征和系统发育分析结果表明:这5个SeCHIT分别命名为SeCHIT7、SeCHIT11、SeCHIT12、SeCHIT13和SeCHIT14,其中SeCHIT7属于III型几丁质酶,而SeCHIT11、SeCHIT12、SeCHIT13和SeCHIT14属于VIII型几丁质酶。2、甜菜夜蛾几丁质酶的原核表达及其多克隆抗体的制备:通过大肠杆菌表达系统成功表达获得了SeCHIT7N（SeCHIT7的N端）、SeCHIT11、SeCHIT12和SeCBD的纯化蛋白,并测定了其活性。结果表明:SeCHIT7N的几丁质酶活性>SeCHIT11>SeCHIT12,而SeCBD无几丁质酶活性。但是SeCBD的存在可以提高3个SeCHIT的几丁质酶活性。最后获得了特异性较高的SeCHIT7N、SeCHIT11和SeCBD的多克隆抗体。3、HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶活性影响的检测:测定了健康甜菜夜蛾不同发育阶段和不同组织中几丁质酶的活性,结果表明:从卵到1龄幼虫几丁质酶活性升高了9.4倍。4龄和5龄幼虫的几丁质酶活性高于1龄、2龄、3龄幼虫,蛹中几丁质酶活性最高（113.77 Unit）。在4个组织中酶活性高低依次为:脂肪体>表皮>中肠>血淋巴。通过比较HvAV-3h感染和模拟感染幼虫不同发育时间和不同组织中几丁质酶的活性,结果表明:在HvAV-3h感染48、72、96、120、144、168 h后,感毒幼虫的几丁质酶活性分别为模拟感染幼虫的13.20%、6.37%、5.63%、10.49%、11.79%和7.94%。在4个组织中,HvAV-3h导致宿主几丁质酶活性在168 hpi显着低于模拟感染幼虫,分别降低了87.95%（血淋巴）、96.96%（脂肪体）、76.84%（中肠）和95.86%（表皮）。4、HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶转录、表达影响的检测:通过荧光定量PCR和Western blot的方法检测了健康幼虫不同发育阶段和不同组织中3个SeCHIT（SeCHIT7、SeCHIT11和SeCHIT12）的转录、表达水平。结果表明:SeCHIT7在5龄幼虫体内检测到最丰富的转录本;SeCHIT11和SeCHIT12在幼虫期表现出相似的转录模式,即从1龄幼虫到3龄幼虫转录水平逐渐升高,随后降低;SeCHIT11在卵中转录水平最高,而SeCHIT12在蛹中转录水平最高。在4个组织中,3个SeCHIT的转录均可被检测到,其中主要在中肠中转录,其次是脂肪体。然后通过比较HvAV-3h感染和模拟感染幼虫不同发育时间全虫中3个SeCHIT的转录水平,发现HvAV-3h导致SeCHIT7在6、9、12、48、72和96 hpi的转录水平显着降低,而SeCHIT11和SeCHIT12在3-96 hpi的转录水平降低;在120-168 hpi,3个SeCHIT的转录水平均显着升高。其中SeCHIT7在96 hpi下降了99.94%,而在120 hpi比模拟感染的幼虫高1300倍以上;与模拟感染幼虫相比,在感毒幼虫体内SeCHIT11的转录水平在6 hpi降低了99.98%,而在168 hpi增加了25.15倍;SeCHIT12的转录水平在6 hpi被HvAV-3h完全抑制,而在120 hpi升高了40.10倍。在不同组织中的转录分析表明HvAV-3h显着影响了3个SeCHIT在甜菜夜蛾幼虫血淋巴、脂肪体、中肠和表皮中的转录模式,特别是SeCHIT7在脂肪体和表皮中的转录以及SeCHIT12在脂肪体中的转录被显着抑制。本研究首先获得了HvAV-3h感染引起显着差异表达的5个甜菜夜蛾几丁质酶基因,并对其分子特征进行了分析描述,然后比较了HvAV-3h感染与模拟感染幼虫体内几丁质酶的活性差异,最后对SeCHIT7、SeCHIT11和SeCHIT12等3个基因的转录、表达进行了时空特异性分析,从而揭示HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶的调控机制,最终为HvAV-3h致病机制的研究奠定了一定的基础。
邵天玉,刘兴龙,刘思竹,谢维欣,王克勤[4]（2016）在《我国甜菜夜蛾核型多角体病毒研究新进展》文中研究表明核型多角体病毒是昆虫病毒中最大的类群,它能够专一性地侵染并杀死一种或者几种农林害虫,并对害虫天敌、环境和人畜无害,是一种值得推广的绿色生物农药。为有效利用绿色生物农药防治病虫害,对我国近几年关于甜菜夜蛾核多角体病毒的毒力、病毒制剂研究与生产、田间应用及药效试验、增效剂研究、分子生物学等方面进行了阐述,并提出了新的展望和应用需求。
葛少彬,梁卿,郑常格,徐树兰,汤历[5]（2015）在《甜菜夜蛾核型多角体病毒研究进展》文中研究表明甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hübner）属夜蛾科（Noctuidae）,是一种世界性分布的多食性害虫。近年来在我国由次要害虫上升为主要害虫,经常暴发成灾,给农业生产带来严重损失。甜菜夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus,Se NPV）能有效控制甜菜夜蛾种群数量,是有效防治甜菜夜蛾的生物制剂,具有重要的经济、生态和环保价值,应用前景广阔。本文从毒力、流行病学、分子生物学、增效剂及对甜菜夜蛾寄生蜂的影响等方面综述了甜菜夜蛾核型多角体病毒的研究进展。
唐琦[6]（2013）在《可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析》文中指出家蚕是经济昆虫,它除了抽丝结茧,制造丝绸外,目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）是家蚕的主要病原体,每年,对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而,经过改造的重组杆状病毒作为生物杀虫剂却能够减少农作物、食品中农药的残留及保护环境,因而已经逐渐取代传统的化学农药,广泛应用于农林防护。目前,越来越多的杆状病毒基因相继被研究报道。BmNPV基因组中还有部分基因功能未知,对这些未知功能的基因进行研究,有助于我们更加深入、全面地了解病毒自身增殖和侵染宿主的机制。基于这些理论,从分子水平上改造、修饰或替换掉某些基因,构建重组型的杆状病毒,从而更好地利用杆状病毒表达系统,或作为生物杀虫剂防治农林害虫。本研究选取了家蚕核型多角体病毒的早期基因（Bm65）和晚期基因（Bm91）为研究对象,分别从转录水平、表达水平、亚细胞定位、病毒结构定位等方面来探讨这些基因的基本特性。通过同源重组构建了相应的基因缺失型病毒,进一步对基因功能进行了研究。研究的结果主要如下：一.Bm65基因功能1.生物信息学分析发现Bm65在鳞翅目核型多角体病毒基因组中高度保守。序列分析发现一个典型的早期转录基序TATA位于起始密码子上游,预示Bm65可能为早期基因。Bm65编码一个含有104个氨基酸残基,理论分子量为12.2kDa的蛋白。InterProScan软件分析结果显示,Bm65蛋白属于一个功能未知的GIY-YIG核酸内切酶超家族,推测该基因可能与病毒DNA复制有关。2.利用大肠杆菌表达系统表达Bm65蛋白,制备了抗血清。此外,利用AcMNPV在sf9细胞中真核表达Bm65蛋白,为下一步该蛋白的纯化及体外内切酶活性的鉴定提供基础。3.转录时相分析显示Bm65的转录从病毒感染宿主细胞6h后开始到感染后72h.5’RACE分析显示Bm65只有一个位于ATG上游14个核苷酸处的转录起始位点。荧光共聚焦显微镜观察发现Bm65既位于感染后宿主的细胞质又位于细胞核。4.利用Red重组系统,用Cm基因成功地取代了Bm65后,通过抗性筛选得到缺失型病毒,并通过转座的方式获得带有polh和gfp的野生型、Bm65缺失型、补回型病毒。利用重组型病毒转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,结果显示Bm65缺失后不能产生有感染性的病毒粒子。荧光定量PCR结果进一步证明Bm65缺失后不影响病毒DNA的复制。以上结果表明Bm65为病毒增殖的必需基因,但对于病毒DNA的复制而言是非必需的。二.Bm91基因功能1.Bm91被预测是一个包含105个氨基酸残基、理论分子量为11.8kDa的蛋白,在鳞翅目核型多角体病毒中高度保守。一个典型的晚期转录基序TAAG位于起始密码子上游13个核苷酸处,预示Bm91可能为晚期基因。软件分析结果显示,Bm91属于一个功能未知的杆状病毒11kDa蛋白家族,推测该基因可能与病毒粒子的形成有关。2.原核表达Bm91蛋白,制备多克隆抗体。转录分析表明,Bm91在病毒感染宿主细胞12h后开始转录,一直持续到感染后96h,且只有一个位于起始密码子ATG上游12个核苷酸处的转录起始位点。从病毒感染BmN细胞后24h开始到96h都能在病毒感染的细胞中检测到Bm91的表达。亚细胞定位显示Bm91定位于病毒感染后的BmN细胞的细胞质和细胞核。免疫印迹实验结果表明Bm91是ODV囊膜上的特异性蛋白。N-糖基化抑制实验显示Bm91未经过N-糖基化修饰。3.成功构建了Bm91缺失型病毒,通过转座得到带有polh和gfp的Bm91缺失型、补回型重组病毒。进一步的转染和感染实验发现,Bm91缺失后不影响有感染性的病毒粒子的产生,且该基因缺失后产生的BV较野生型病毒相比,滴度没有明显的变化。幼虫生物学测试实验显示缺失该基因不影响重组病毒感染宿主幼虫的半数致死剂量LD50,却使得宿主幼虫的半数致死时间LT5o延长了24h,提示Bm91为病毒增殖的非必需基因,但该基因可能与病毒毒力有关。以上结果在分子水平上补充和丰富了BmNPV基因功能的研究情况,为全面了解病毒的感染和增殖机制打下基础,也为该病毒的改造和利用提供理论依据。
李赛男,李朝飞,庞义,杨凯[7]（2011）在《杆状病毒SeMNPV Se29基因的克隆、表达与抗体制备》文中研究说明目的:克隆和表达甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMN-PV）ORF29全长基因（Se29）,制备SE29蛋白的多克隆抗体.方法:用PCR的方法扩增得到Se29基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a（+）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下超量表达了SE29蛋白.采用割胶回收的方法纯化SE29蛋白,以纯化的SE29蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔制备了特异的抗SE29蛋白的抗体.结果:构建了Se29基因原核表达质粒,在大肠杆菌中实现了SE29蛋白的原核表达,获得了SE29蛋白的多克隆抗体,West-ern blot分析表明该抗体能与SeMNPV感染的细胞蛋白样品发生特异性反应.结论:SE29蛋白的多克隆抗体的获得为进一步研究SE29蛋白的功能奠定了基础.
岳万福[8]（2009）在《基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究》文中研究表明家蚕杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统,表达的蛋白具有折叠和糖基化,近于真实构相,表达量较大,而且能够可溶性地表达一些原核系统难以表达的大分子量蛋白。我们首先使用家蚕杆状病毒表达系统表达了Mn-SOD基因,并通过低温冷冻真空干燥,以SOD全蚕粉的形式,保持了SOD的活性。对SOD全蚕粉进行了以《保健食品检验与评价技术规范》为标准的安全性和功能性检验。经对小鼠进行人体推荐量360倍的急性毒性检验、90天的长期性毒性检验,小鼠生长正常,各器官无异常现象发生；SOD全蚕粉对ConA刺激导致的淋巴细胞转化,在体外法实验中,显示能明显增加淋巴细胞转化率,提示SOD全蚕粉具有免疫调节作用；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天,能提高小鼠迟发型变态反应能力,在高剂量组达到显着水平,但与阳性对照（黄芪组）有较明显的差距。SOD全蚕粉促进小鼠的体重增长,对脾脏生长无影响,但明显增加小鼠的胸腺／体重比值；用SRBC免疫小鼠后,产生抗SRBC抗体,SOD全蚕粉对血凝素也有明显的作用,表明SOD全蚕粉对正常机体的体液免疫功能均有增强作用；经对小鼠巨噬细胞的功能实验,SOD全蚕粉提高了小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。在家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得SOD全蚕粉,设三个剂量组和阴性、阳性对照组给小鼠灌胃；经口给予小鼠不同剂量的SOD全蚕粉30天,能增加小鼠血和肝脏中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,降低小鼠肝脏中丙二醛含量。在家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得SOD全蚕粉,小鼠灌胃45天,小鼠尾静脉注稀释的印度墨汁,以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力,碳廓清能力提高,说明加速碳粒的清除,显着提高自然杀伤细胞抗瘤活性,增强机体的非特异性细胞免疫功能。以NIH小鼠为研究模型,观察SOD全蚕粉对NK细胞活性的影响,证实了SOD全蚕粉有明显的能增强NK细胞的活性,从而增强机体的免疫机能。在此基础上,进行抑制肿瘤实验,结果表明提高小鼠抗肿瘤能力,SOD全蚕粉提高S180肿瘤荷瘤小鼠的淋巴细胞转化率、NK细胞活性,抑制小鼠的肿瘤生长；SOD全蚕粉组对肝癌H22的平均抑瘤率为40.3,表现出较强的抗肿瘤活性,能促进T淋巴细胞转化,提高NK细胞活性。经四氧嘧啶造模成功后小鼠,对其灌胃SOD全蚕粉30天（SOD全蚕粉为家蚕体内表达SOD基因后,经冷冻干燥制得）,结果显示SOD全蚕粉能增加小鼠的糖耐量水平,对小鼠的空腹血糖值有降低趋势,达到显着水平。家蚕杆状病毒表达系统是一个功能强大,可利用范围较广的真核表达系统,然而,由于感染需要节间注射,限制了家蚕杆状病毒表达系统的应用,因此,我们对家蚕杆状病毒表达系统进行了几项攻进。采用荧光增白剂喷洒桑叶,增加家蚕经口对杆状病毒表达系统中携带外源基因病毒的易感性。构建了双表达载体系统,在表达Mn-SOD目的蛋白的同时,恢复表达了多角体基因；多角体基因和Mn-SOD基因被分别插在多角体启动子和P10启动子之下,实现了经口感染。摸索出重组杆状病毒DNA与转染剂混合比例和转染条件,在家蚕体内实现从DNA到病毒的转化,经口感染家蚕幼虫,大大简化外源基因表达的操作手续。表达的目的蛋白在感染后期常被降解,甚至在感染后期家蚕等昆虫组织器官也受到降解,给目的蛋白的纯化等处理带来许多麻烦,这已成为该表达系统,特别是在产业化开发时遇到的一个严重的问题。为了解决表达蛋白的稳定性。引进和采用了缺少半胱氨酸蛋白酶基因的Bacmid质粒载体（CPD）,缺少半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶基因的Bacmid质粒载体（CPPD）,用这些改进后的Bacmid质粒载体表达外源基因,并在人胰岛素的表达中进行了对比；在猪蓝耳病病毒膜蛋白GP5和M基因表达实验中采用了缺少半胱氨酸蛋白酶基因的Bacmid质粒载体（CPD）。在家蚕体内表达出人胰岛素,开发出除大肠杆菌、酵母表达系统外,人胰岛素表达的第三条途径。在家蚕体内表达出猪繁殖与呼吸综合征（蓝耳病）表面抗原蛋白,经ELISA检验有抗原原性,开辟了用家蚕生产DNA等基因工程疫苗的新途径奠定了基础。
刘彩云,刘金瑾,汤显春,张忠信,彭辉银,孙修炼[9]（2008）在《杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性》文中研究指明在比对已公布的37种杆状病毒包涵体蛋白氨基酸序列的基础上,选定棉铃虫核型多角体病毒（HaNPV）多角体蛋白的两个高度保守多肽（54-113aa和206-245aa）制备多克隆抗体,用Western blot法检测这两个高度保守多肽与多种杆状病毒包涵体蛋白之间的血清学关系.结果表明,HaNPV多角体蛋白的两个多肽的抗体与14种核型多角体病毒的多角体蛋白和5种颗粒体病毒的颗粒体蛋白均有明显的杂交信号,表明杆状病毒的包涵体蛋白之间具有共同的抗原决定簇.根据杆状病毒包涵体蛋白之间的这种血清学关系,进一步讨论了利用免疫金试纸技术检测病毒杀虫剂中包涵体含量的可行性.图7参9
沈智蓉[10]（2008）在《斜纹夜蛾复合生物杀虫剂的研究及SpltMNPV-JP-B基因pif-2的克隆与序列分析》文中提出斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）是蔬菜、绿化植物和各类农作物的重要害虫,近年来在各地发生普遍,且为害十分严重。由于化学农药的大量使用与施用方法不当,造成了斜纹夜蛾的抗药性明显上升,给防治带来很大困难。滥用化学农药不但污染环境,破坏生态平衡,而且对人畜健康造成严重危害。因此,在害虫的综合治理中,努力减少化学农药的使用量,大力推广生物防治,是农业可持续发展的需要。斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）是一种病原生物,对宿主种群具有明显的控制作用,目前已经商品化生产。但是,由于病毒具有很强的寄主专一性,对靶标生物之外的其他害虫没有作用,而且病毒对害虫防治的速效性较差,在实际应用中存在一定的不足。为了扩大生物农药的宿主域,提高其防治害虫的速效性,我们采用SpltMNPV与甲维盐复合的方式,通过室内毒力测定和大田防治试验,取得了较明显的结果。同时,在分子水平上,对SpltMNPV与经口感染有关的pif-2基因进行克隆与序列分析。主要工作成果如下:1.在实验室条件下将SpltMNPV的中国株（CN）、3个日本株（A、B、C）与甲维盐进行混合复配,在不同组合、不同浓度、不同温度的条件下,分别测定它们对斜纹夜蛾幼虫的毒杀效果。结果表明,SpltMNPV日本株B型106PIB/mL与1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐1000倍稀释液的复合农药有明显的生物活性,其LT50比甲维盐单剂缩短22.22%,比病毒单剂缩短44.44%,效果显着。2.采用复合生物杀虫剂对斜纹夜蛾、小菜蛾和瓜绢螟等鳞翅目害虫大田防治试验的结果表明,复合生物杀虫剂药后4d和7d对斜纹夜蛾的校正防效分别为76.67%88.48%和92.92%96.30% ,略高于甲维盐单剂的71.63%84.16%和87.56%92.77%;明显高于病毒单剂的21.95%45.13%和68.83%86.11%。同时,复合生物杀虫剂可以兼治小菜蛾、瓜绢螟等鳞翅目害虫,在生产上有较大的实用价值。3.在分子水平上,克隆了SpltMNPV日本株B型的pif-2基因,并对其进行核苷酸和氨基酸序列分析,进行了PIF-2蛋白的二级结构预测及分子系统发育分析。为这一病毒杀虫剂的改良和深入研究奠定了良好的基础。
二、甜菜夜蛾核多角体病毒sod基因的克隆及原核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、甜菜夜蛾核多角体病毒sod基因的克隆及原核表达（论文提纲范文）
（1）F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒及其分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的应用 |
| 1.1.3 杆状病毒的生活周期及感染细胞过程中主要功能基因 |
| 1.2 病毒的隐性感染 |
| 1.2.1 隐性感染 |
| 1.2.2 病毒的超感染排斥及研究意义 |
| 1.2.3 病毒超感染排斥的机制 |
| 1.2.4 昆虫病毒的超感染排斥及其机制 |
| 1.3 超感染排斥研究目的与意义 |
| 1.4 病毒受体及NPC1 |
| 1.4.1 病毒入侵宿主细胞 |
| 1.4.2 昆虫NPC1 概述 |
| 1.4.3 NPC1 在病毒侵染宿主细胞过程中的作用 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 F蛋白在病毒吸附阶段及P8-Se301-C1 对杆状病毒超感染排斥中的作用 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 P8-Se301-C1 细胞对SeMNPV超感染排斥发生在吸附阶段的验证 |
| 2.2.2 SeMNPV F蛋白对宿主Se301 细胞表面SeMNPV BV吸附量的影响 |
| 2.2.3 F蛋白在P8-Se301-C1 细胞对杆状病毒超感染排斥中的作用 |
| 2.2.4 P8-Se301-C1 细胞中Se8 转录未翻译为F蛋白参与超感染排斥 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 P8-Se301-C1 对 Se MNPV 超感染排斥发生在吸附阶段 |
| 2.3.2 囊膜蛋白F参与SeMNPV感染甜菜夜蛾细胞Se301 的吸附和膜融合两个阶段 |
| 2.3.3 Ac MNPV在不同昆虫细胞表面吸附量不同 |
| 2.3.4 F蛋白参与P8-Se301-C1 细胞对杆状病毒吸附阶段的超感染排斥 |
| 2.3.5 P8-Se301-C1 细胞中的Se8 转录本未翻译为F蛋白 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 宿主Se301 细胞表面SeMNPV病毒受体本质的鉴定 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 神经氨酸酶、蛋白酶K及衣霉素药物使用浓度筛选 |
| 3.2.2 SeMPV BV感染宿主细胞吸附的受体本质为蛋白质 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 甜菜夜蛾 SeNPC1 蛋白在SeMNPV感染甜菜夜蛾 Se301 细胞中的作用 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验设备 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 甜菜夜蛾Senpc1 基因的克隆鉴定 |
| 4.2.2 甜菜夜蛾SeNPC1 的生物信息学分析 |
| 4.2.3 SeNPC1在SeMNPV感染Se301 细胞中的作用 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 甜菜夜蛾Senpc1 鉴定及分析 |
| 4.3.2 甜菜夜蛾SeNPC1 参与SeMNPV感染Se301 细胞的吸附阶段 |
| 4.3.3 SeNPC1 可能参与P8-Se301-C1 细胞对SeMNPV吸附阶段的超感染排斥 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 SeMNPV F蛋白与SeNPC1 的生物信息学互作分析 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 F蛋白与SeNPC1 蛋白三级结构建模 |
| 5.2.2 SeMNPV F蛋白与SeNPC1 Domain C蛋白模型质量评估分析 |
| 5.2.3 F蛋白与SeNPC1 蛋白Domain C分子对接及相互作用分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间主要研究成果 |
（2）Vip3Aa杀蜚蠊的作用与机制及其生防工程菌的构建和评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 研究思路和技术路线 |
| 第二章 Vip3Aa和J-Vip3Aa蛋白的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Vip3Aa杀蜚蠊活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 美洲大蠊取食Vip3Aa蛋白中肠转录组学研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 转vip3Aa基因蜚蠊生防菌的构建和评价 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 研究展望 |
| 缩写词简表 |
| 致谢 |
| 成果 |
（3）烟芽夜蛾囊泡病毒3h株对甜菜夜蛾几丁质酶活性和表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 甜菜夜蛾及其发生与危害的简介 |
| 1.2 烟芽夜蛾囊泡病毒3h株的简介 |
| 1.3 昆虫几丁质酶 |
| 1.3.1 昆虫几丁质酶的性质 |
| 1.3.2 昆虫几丁质酶的分类 |
| 1.3.3 昆虫几丁质酶的功能 |
| 1.3.4 昆虫几丁质酶体内转录、表达的研究 |
| 1.3.5 昆虫几丁质酶体外表达的研究 |
| 1.4 几丁质酶代谢紊乱对昆虫的影响 |
| 1.5 本论文的研究目的、意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 1.5.3 主要研究内容及技术路线 |
| 第2章 甜菜夜蛾几丁质酶基因的克隆与系统发育分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 试剂及仪器 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾的饲养及样品获取 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 总RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.5 目的片段的扩增与纯化 |
| 2.2.6 蛋白序列和结构分析 |
| 2.2.7 系统发育分析 |
| 2.2.8 技术路线 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因的克隆及测序 |
| 2.3.2 蛋白二级结构分析 |
| 2.3.3 蛋白三级结构分析 |
| 2.3.4 甜菜夜蛾几丁质酶的系统发育分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第3章 甜菜夜蛾几丁质酶的原核表达及其多克隆抗体的制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 试剂及仪器 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 目的片段的扩增与纯化 |
| 3.2.4 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 3.2.5 酶蛋白的外源表达及纯化 |
| 3.2.6 多克隆抗体的制备 |
| 3.2.7 多克隆抗体的检测(Western blot) |
| 3.2.8 体外表达几丁质酶活性的测定 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.2.10 技术路线 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基因的克隆及测序 |
| 3.3.2 重组表达载体的鉴定 |
| 3.3.3 蛋白的少量表达 |
| 3.3.4 蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.5 抗体的检测 |
| 3.3.6 SeCHIT体外活性的测定 |
| 3.3.7 SeCBD对 SeCHIT的活性的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶活性的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.2.1 试剂及仪器 |
| 4.2.2 供试昆虫的饲养及HvAV-3h的扩繁 |
| 4.2.3 病毒的接种和实验样品的获取 |
| 4.2.4 几丁质酶活性的测定 |
| 4.2.5 数据处理 |
| 4.2.6 技术路线 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 几丁质酶活性随甜菜夜蛾生长发育的变化 |
| 4.3.2 几丁质酶活性的组织特异性 |
| 4.3.3 HvAV-3h对不同感染时间几丁质酶活性的影响 |
| 4.3.4 HvAV-3h对不同组织中几丁质酶活性的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第5章 HvAV-3h对甜菜夜蛾几丁质酶转录、表达的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.2.1 试剂及仪器 |
| 5.2.2 昆虫饲养、病毒接种及样品获取 |
| 5.2.3 引物设计 |
| 5.2.4 总RNA提取和c DNA合成 |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR和半定量PCR |
| 5.2.6 甜菜夜蛾虫体蛋白的提取及Western blot检测 |
| 5.2.7 数据处理 |
| 5.2.8 技术路线 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SeCHIT在不同生长发育阶段转录水平的检测 |
| 5.3.2 SeCHIT转录的组织特异性检测 |
| 5.3.3 HvAV-3h对 SeCHIT转录、表达时相的影响 |
| 5.3.4 HvAV-3h对 SeCHIT在各组织中转录水平的影响 |
| 5.3.5 HvAV-3h对 SeCBD转录、表达的影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 本文所用分子克隆方法 |
| 附录2 本文所用溶液及试剂配方 |
| 附录3 本文附图 |
| 附录4 本文附表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）我国甜菜夜蛾核型多角体病毒研究新进展（论文提纲范文）
| 1 病毒毒力 |
| 2 病毒制剂研究与生产 |
| 3 田间应用及药效试验 |
| 4 增效剂研究 |
| 5 分子生物学研究 |
| 5.1 SeNPV基因组结构分析 |
| 5.2 SeNPV部分基因的克隆及功能分析 |
| 6 讨论 |
（5）甜菜夜蛾核型多角体病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1概述 |
| 2致病性研究 |
| 2.1SeNPV对寄主的毒力研究 |
| 2.2SeNPV的流行病学研究 |
| 3分子生物学研究 |
| 4增效剂研究 |
| 5对甜菜夜蛾寄生蜂的影响 |
（6）可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 图表清单 |
| 缩略词 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 家蚕、杆状病毒与食品 |
| 1.1.1 家蚕与食品的关系 |
| 1.1.2 杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.3 杆状病毒杀虫剂与食品安全 |
| 1.1.4 重组杆状病毒杀虫剂 |
| 1.2 杆状病毒概况 |
| 1.2.1 杆状病毒分类及生活周期 |
| 1.2.2 杆状病毒与宿主的相互作用 |
| 1.2.3 杆状病毒宿主范围 |
| 1.2.4 杆状病毒的应用 |
| 1.3 家蚕核刑多角体病毒 |
| 1.3.1 家蚕核型多角体病毒简介 |
| 1.3.2 家蚕核型多角体病毒的多样性 |
| 1.3.3 AcMNPV与BmNPV的基因组比较 |
| 1.3.4 BmNPV基因的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 研究的技术路线 |
| 2 Bm65基因生物信息学分析 |
| 2.1 分析软件及方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Bm65的核苷酸及氨基酸的序列特征 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 Bm65的原核表达、真核表达及多克隆抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌种、载体、实验动物 |
| 3.1.2 酶和化学试剂 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 缓冲液 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计及PCR |
| 3.2.2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 |
| 3.2.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 目的蛋白的割胶纯化 |
| 3.2.5 抗血清的制备 |
| 3.2.6 SDS-PAGE及免疫印迹分析 |
| 3.2.7 pAc~(Bm65-egfp)的构建 |
| 3.2.8 细胞转染 |
| 3.2.9 转染上清感染sf9细胞 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bm65的克隆 |
| 3.3.2 Bm65基因的原核表达及检测 |
| 3.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 3.3.4 Bm65蛋白多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.3.5 Bm65真核表达基因的克隆 |
| 3.3.6 HTB-ie1-egfp-Bm65z-SV40的构建及鉴定 |
| 3.3.7 pAc~(Bm65-egfp) bacmid的构建及鉴定 |
| 3.3.8 pAc~(Bm65-egfp)转染sf9细胞 |
| 3.3.9 免疫印迹检测Bm65的表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Bm65在BmN细胞中的转录分析和蛋白定位 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒、细胞和试剂 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 总RNA的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 5’-RACE分析 |
| 4.2.4 免疫荧光观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Bm65的转录分析 |
| 4.3.2 Bm65的表达时相 |
| 4.3.3 Bm65的亚细胞定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 Bm65缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 质粒、菌株、试剂 |
| 5.1.2 引物 |
| 5.1.3 抗生素配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 Bm65基因打靶线性化片段的制备 |
| 5.2.2 电转化感受态DH10Bac细胞制备 |
| 5.2.3 电击转化同源重组 |
| 5.2.4 含有pBm~(Bm65KO)的菌株中pBAD-gbaA质粒的去除 |
| 5.2.5 供体质粒pFB1-polh-gfp-Bm65的构建 |
| 5.2.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建 |
| 5.2.7 细胞转染 |
| 5.2.8 转染上清感染BmN细胞 |
| 5.2.9 病毒滴度测定 |
| 5.2.10 qPCR分析Bm65缺失后对病毒DNA复制的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Bm65基因打靶线性化片断的鉴定 |
| 5.3.2 重组质粒pUC18-Bm65US-Cm-Bm65DS的酶切鉴定 |
| 5.3.3 Bm65缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 5.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm65的构建及鉴定 |
| 5.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 5.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm65KO-GP)和pBm~(Bm65Rep-GP)在BmN细胞上的复制分析 |
| 5.3.7 病毒DNA复制分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 Bm91基因生物信息学分析 |
| 6.1 分析软件及方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Bm91的核苷酸和其编码的氨基酸的序列特征 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 7 Bm91的多克隆抗体制备、转录分析及蛋白定位 |
| 7.1 材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 BV的纯化 |
| 7.2.2 多角体的纯化 |
| 7.2.3 ODV的纯化 |
| 7.2.4 BV/ODV囊膜蛋白的分离纯化 |
| 7.2.5 BV/ODV核衣壳的分离纯化 |
| 7.2.6 N-糖基化抑制实验 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 Bm91的克隆 |
| 7.3.2 Bm91基因的原核表达及检测 |
| 7.3.3 融合蛋白的鉴定 |
| 7.3.4 Bm91蛋白的多克隆抗体制备及抗体的检测 |
| 7.3.5 Bm91的转录分析 |
| 7.3.6 Bm91的表达时相 |
| 7.3.7 Bm91的亚细胞定位 |
| 7.3.8 Bm91蛋白在病毒结构中的定位 |
| 7.3.9 N-糖基化抑制实验 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 Bm91缺失型病毒的构建及功能分析 |
| 8.1 材料 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的构建 |
| 8.2.2 重组病毒半数致死剂量(50% lethal dose,LD_(50))的测定 |
| 8.2.3 重组病毒半数致死时间(50% lethal time,LT_(50))的测定 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 Bm91基因打靶线性化片段的PCR扩增 |
| 8.3.2 重组质粒pUC18-Bm91US-Cm-Bm91DS的酶切鉴定 |
| 8.3.3 Bm91缺失型病毒的构建及鉴定 |
| 8.3.4 pFB1-polh-gfp-Bm91的构建及鉴定 |
| 8.3.5 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)的构建及鉴定 |
| 8.3.6 pBm~(WT-GP)、pBm~(Bm91KO-GP)和pBm~(Bm91Rep-GP)在RmN细胞上的复制 |
| 8.3.7 Bm91缺失病毒的生物学分析 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 总结和展望 |
| 9.1 总结 |
| 9.2 展望 |
| 9.2.1 Bm65的进一步分析 |
| 9.2.2 Bm91的进一步分析 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的研究论文和参加的课题 |
| 发表的研究论文 |
| 导师指导下主持课题 |
| 参与课题 |
（8）基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 杆状病毒表达系统 |
| 1.杆状病毒的生物学特性 |
| 2.杆状病毒表达系统的产生 |
| 3.杆状病毒表达系统特点 |
| 4.杆状病毒表达系统的应用 |
| 5.影响杆状病毒表达系统外源基因表达的因素 |
| 6.杆状病毒的不足 |
| 7.展望 |
| 参考文献 |
| 第二节 Bac-to-Bac昆虫细胞-杆状病毒表达系统 |
| 1.Bac-to-Bac系统的原理 |
| 2.Bac-to-Bac系统的诞生及其优点 |
| 3.Bac-to-Bac系统的发展 |
| 4.Bac-to-Bac在家蚕中的应用 |
| 5.近几年Bac-to-Bac在家蚕中的应用实例 |
| 参考文献 |
| 第三节 SOD的研究概况 |
| 1.SOD研究的基本概况 |
| 2.SOD的来源 |
| 3.SOD克隆和表达的研究近况 |
| 参考文献 |
| 第四节 胰岛素的研究概述 |
| 1.胰岛素与糖尿病 |
| 2.胰岛素的应用 |
| 3.基因工程合成胰岛素 |
| 参考文献 |
| 第五节 猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗研究现状 |
| 1.猪繁殖与呼吸综合征病毒概况 |
| 2.猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究 |
| 3.猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究的展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 SOD基因的克隆和表达 |
| 第一节 SOD基因的获得 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第二节 重组载体和重组病毒构建 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第三节 Mn-SOD基因在家蚕体内表达 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第四节 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SOD功能研究 |
| 第一节 SOD全蚕粉制作 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 第二节 SOD全蚕粉的毒性实验 |
| 1.方法和材料 |
| 2.实验结果 |
| 3.小结 |
| 第三节 Con诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第四节 SOD全蚕粉对小鼠迟发型变态反应的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第五节 SOD全蚕粉增强免疫力实验脏器/体重比值测定 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第六节 SOD全蚕粉增强免疫功能的小鼠血清溶血素测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第七节 SOD全蚕粉的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第八节 SOD全蚕粉的抗氧化功能检验 |
| 一、造模 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 二、小鼠血中和肝匀浆中MDA(丙二醛)含量测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 三、SOD全蚕粉灌胃后小鼠血/组织中抗氧化酶SOD活力测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 四、SOD全蚕粉灌胃后小鼠的血/组织中谷脱甘肤过氧化物酶活力测定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第九节 SOD全蚕粉增强免疫功能的小鼠碳廓清实验 |
| 1.材料 |
| 2.方法和步骤 |
| 3.结果 |
| 4.小结 |
| 第十节 SOD全蚕粉对小鼠NK细胞活性影响的实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.结果 |
| 4.小结 |
| 第十一节 SOD全蚕粉辅助降血糖功能检验 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第十二节 SOD全蚕粉对S180荷瘤小鼠免疫调节作用的研究 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第十三节 SOD全蚕粉抗肝癌(H22)的作用及其机制实验 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第十四节 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 家蚕杆状病毒表达系统的改进 |
| 第一节 荧光增白剂增强对家蚕NPV病毒经口感染能力实验 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第二节 双启动子重组病毒构建与经口感染效率 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第三节 重组病毒DNA注射感染 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.小结 |
| 第四节 讨论 |
| 1.杆状病毒表达系统发展 |
| 2.多角体去除后的得失 |
| 3.我国应用杆状病毒表达系统的国情与优势 |
| 4.有益的改进 |
| 5.减少表达蛋白降解的改进 |
| 参考文献 |
| 第五章 人胰岛素在家蚕体内的表达 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 猪蓝耳病E、M基因在家蚕中的融合表达 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 结论、创新点、及后续研究 |
| 致谢 |
| 附件:作者简历 |
| 发表论文 |
| 发明专利申请公布说明书 |
（9）杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 杆状病毒包涵体蛋白氨基酸分析 |
| 1.3 病毒包涵体蛋白的提取 |
| 1.4 HaNPV多角体蛋白基因保守区ph1、ph2的克隆与原核表达 |
| 1.5 细胞破碎与蛋白纯化 |
| 1.6 抗HaNPV多角体蛋白高保守区多克隆抗体的制备 |
| 1.7 Western法检测包涵体蛋白之间的血清学关系 |
| 2 结果 |
| 2.1 包涵体蛋白氨基酸分析与高度保守区的确定 |
| 1.2 目的基因的克隆与原核表达载体的构建 |
| 1.3 目的蛋白的原核表达与纯化 |
| 1.4 多克隆抗体的制备与检测 |
| 1.5 Western blot检测PH1、PH2与其它包涵体蛋白之间的血清学关系 |
| 3 讨论 |
（10）斜纹夜蛾复合生物杀虫剂的研究及SpltMNPV-JP-B基因pif-2的克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 中文提要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 斜纹夜蛾的生物防治研究 |
| 1 自然天敌防治 |
| 2 生物农药防治 |
| 3 昆虫激素防治 |
| 4 生物技术手段防治 |
| 5 寄主植物品种对昆虫诱导抗药性的研究 |
| 6 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 昆虫杆状病毒的研究进展 |
| 1 杆状病毒的生物学特性 |
| 2 pif 基因的作用 |
| 3 杆状病毒基因工程技术的发展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 斜纹夜蛾复合生物杀虫剂的研究 |
| 第三章 斜纹夜蛾NPV 的室内毒力测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 斜纹夜蛾NPV 与甲维盐复合生物杀虫剂的毒力测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 4 复合生物农药的发展前景 |
| 参考文献 |
| 第五章 斜纹夜蛾复合生物杀虫剂的田间防治试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三篇 斜纹夜蛾核型多角体病毒分子生物研究 |
| 第六章 SpltMNPV-JP-B 经口感染必需基因pif-2 的克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 在读期间公开发表的研究论文 |
| 致谢 |
四、甜菜夜蛾核多角体病毒sod基因的克隆及原核表达（论文参考文献）
- [1]F蛋白与SeNPC1在SeMNPV感染宿主吸附阶段及在对杆状病毒超感染排斥中的作用[D]. 安丽. 贵州师范大学, 2021(12)
- [2]Vip3Aa杀蜚蠊的作用与机制及其生防工程菌的构建和评价[D]. 刘文彬. 南方医科大学, 2020(01)
- [3]烟芽夜蛾囊泡病毒3h株对甜菜夜蛾几丁质酶活性和表达的影响[D]. 何磊. 湖南农业大学, 2019
- [4]我国甜菜夜蛾核型多角体病毒研究新进展[J]. 邵天玉,刘兴龙,刘思竹,谢维欣,王克勤. 黑龙江农业科学, 2016(01)
- [5]甜菜夜蛾核型多角体病毒研究进展[J]. 葛少彬,梁卿,郑常格,徐树兰,汤历. 中国植保导刊, 2015(09)
- [6]可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析[D]. 唐琦. 江苏大学, 2013(07)
- [7]杆状病毒SeMNPV Se29基因的克隆、表达与抗体制备[J]. 李赛男,李朝飞,庞义,杨凯. 湖南师范大学自然科学学报, 2011(04)
- [8]基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究[D]. 岳万福. 浙江大学, 2009(05)
- [9]杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性[J]. 刘彩云,刘金瑾,汤显春,张忠信,彭辉银,孙修炼. 应用与环境生物学报, 2008(06)
- [10]斜纹夜蛾复合生物杀虫剂的研究及SpltMNPV-JP-B基因pif-2的克隆与序列分析[D]. 沈智蓉. 苏州大学, 2008(11)