一、聚合酶链反应(PCR)检测养殖对虾的白斑症病毒(WSSV)感染（论文文献综述）
王静静[1]（2021）在《传染性皮下及造血组织坏死病毒对不同发育阶段南美白对虾的感染差异研究》文中认为传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus,IHHNV）也称为细角滨对虾浓核病毒（Penaeus stylirostris densovirus,Pst DNV）,是已知对虾病毒中最小的病毒。IHHNV危害性大,感染性强,宿主比较广泛,可感染南美白对虾（Penaeus vannamei）、斑节对虾（Penaeus monodon）、细角滨对虾（Penaeus stylirostris）等,给对虾养殖产业造成了巨大经济损失,是世界动物卫生组织（The World Organization for Animal Health,OIE）规定的须向其申报的甲壳动物重要病原。IHHNV于1981年首次发现于美国太平洋地区,2001年在我国首次报道,目前已经在全国范围内流行开来,是严重危害我国对虾养殖业的主要病毒之一。有相关研究报道,IHHNV对宿主的致病性与宿主的发育阶段密切相关。在细角滨对虾中,幼虾较成虾更容易感染IHHNV。南美白对虾是我国对虾养殖产业最主要的养殖品种,其养殖数量多、规模大,经济价值高。因此,研究IHHNV对不同发育阶段南美白对虾的感染差异,探索南美白对虾对IHHNV的敏感阶段,具有较好的科研价值,可为南美白对虾的病害防控提供理论依据。本文调查了不同发育阶段南美白对虾自然感染IHHNV的规律,并通过室内投喂攻毒,运用普通PCR、实时荧光定量PCR等技术,比较了IHHNV对不同发育阶段南美白对虾的感染差异,以及IHHNV在稚虾和成虾不同组织器官中的感染情况。其主要研究内容及结果如下:1.调查了不同发育阶段南美白对虾自然感染IHHNV的情况。采用普通PCR方法检测了594尾不同发育阶段的南美白对虾样品,200尾样品呈IHHNV阳性,其中南美白对虾仔虾IHHNV感染率为11.9%,稚虾IHHNV感染率为50%,成虾IHHNV感染率为37.9%。将自然感染IHHNV的南美白对虾进行实时荧光定量PCR检测,结果显示南美白对虾仔虾和稚虾病毒载量高于成虾。不同发育阶段南美白对虾IHHNV感染率及病毒载量表明,南美白对虾稚虾自然感染IHHNV较严重。2.通过投喂攻毒的方式研究了不同发育阶段南美白对虾人工感染IHHNV的情况。经普通PCR检测,攻毒组30尾南美白对虾仔虾样品有13尾呈IHHNV阳性,IHHNV感染率为43.3%;攻毒组15尾南美白对虾稚虾样品有12尾呈IHHNV阳性,IHHNV感染率为86.7%;攻毒组15尾南美白对虾成虾样品有7尾呈IHHNV阳性,IHHNV感染率为46.7%。对不同发育阶段南美白对虾IHHNV阳性样品进行实时荧光定量PCR检测,南美白对虾仔虾IHHNV载量最高为28.7 copies/μl DNA,稚虾最高为28.2 copies/μl DNA,成虾最高为18 copies/μl DNA。实验结果表明,不同发育阶段的南美白对虾都可以通过摄食途径感染IHHNV,仔虾和稚虾的病毒载量高于成虾。组织病理学观察表明,IHHNV阳性南美白对虾稚虾和成虾鳃细胞出现细胞核肿大。3.研究了南美白对虾稚虾和成虾不同组织器官（肝胰脏、鳃、肌肉、游泳足、眼）感染IHHNV的情况。经投喂攻毒,15尾南美白对虾稚虾不同组织器官IHHNV感染率分别为肝胰脏100%、鳃86.7%、肌肉33.3%、游泳足86.7%、眼无感染;15尾南美白对虾成虾不同组织器官IHHNV感染率分别为肝胰脏86.6%、鳃46.7%、肌肉13.3%、游泳足13.3%、眼无感染。南美白对虾稚虾和成虾肝胰脏IHHNV感染率最高。采用实时荧光定量PCR方法检测了南美白对虾稚虾和成虾IHHNV阳性的组织器官,结果表明,南美白对虾稚虾和成虾肝胰脏的IHHNV载量最高,为IHHNV的敏感器官。
白亚南[2]（2021）在《金纳米探针结合暗场显微镜快速检测对虾白斑综合征病毒的研究》文中认为对虾白斑综合征（White spot syndrome,WSS）是目前对虾养殖业所面临的分布最广且危害最大的病害之一,该病的病原体为白斑综合征病毒（White spotsyndrome virus,WSSV）。目前没有有效的药物治疗WSS,而且WSSV的扩散速度很快,因此迫切需要一种简便、快捷的WSSV检测技术,以期及早发现WSSV的感染,及时净化养殖水体,预防WSS的爆发,降低经济损失。金纳米颗粒具有优异的等离子共振效应、优良的生物相容性、表面易修饰等特性。目前利用金纳米颗粒制备金纳米探针,并结合暗场显微镜成像技术对目标检测物的位置和数量进行监测的检测方法已广泛应用于分子成像、生物检测等方面。本论文构建了一种特异性标记WSSV的金纳米探针,结合暗场显微镜技术,用于简便快速地检测样本中的WSSV。本研究包括以下几部分:（1）WSSV的增殖纯化及实时荧光定量PCR检测WSSV方法的建立:感染WSSV的克氏原螯虾（小龙虾）组织冰浴研磨液通过蔗糖密度梯度离心分离获得纯化的病毒,透射电子显微镜（TEM）观察发现其纯度高,病毒囊膜多破裂,只剩下核衣壳结构。根据WSSV的保守基因序列设计特异性引物,构建含WSSV目的基因的质粒作为标准品,建立了 WSSV实时荧光定量PCR标准曲线。标准曲线中Ct值与质粒拷贝数（X）的关系为Ct=-3.7168X+42.291（X为质粒拷贝数的对数）,相关系数R2=0.9991,表明标准曲线线性关系良好。通过建立的实时荧光定量PCR技术对纯化的WSSV进行定量检测,测得WSSV的DNA浓度为7.12×107 copies/μL。（2）抗WSSV VP664多克隆抗体的制备与鉴定:本研究将WSSV的核衣壳蛋白VP664基因的一段高度保守序列克隆到pET-28a（+）表达载体上,以E.coli BL21为宿主菌,成功表达并纯化了目的蛋白。随后将该重组蛋白作为免疫原免疫新西兰白兔,通过ELISA实验确定其血清效价为1:256000,血清纯化后经Western blot实验证明制备的多克隆抗体可以与WSSV特异性反应。（3）金纳米探针结合暗场显微镜检测WSSV方法的构建:1)金纳米探针的制备和表征:将制备的多克隆抗体与表面修饰protein A的金纳米颗粒（粒径为15 nm）共同孵育后纯化,制备成可特异性结合WSSV的金纳米探针。通过 SDS-PAGE、UV-Vis 吸收光谱、DLS（Dynamic light scattering）及 TEM 分析制备的探针,结果表明金纳米颗粒成功修饰上了抗体且单分散性良好,每个纳米颗粒表面可以结合约50个抗体分子。2)金纳米探针辅助暗场显微镜检测WSSV:用纯化的WSSV验证金纳米探针结合暗场显微镜的快检方法。金纳米探针与纯化的WSSV孵育后,在暗场显微镜下可以清晰的观察到明亮的金黄色椭圆型结构,而单独的金纳米探针和WSSV在暗场下不可见。TEM观察发现金黄色结构是由于上百个金纳米探针结合于WSSV的核衣壳表面形成的。该计数方法的结果与实时荧光定量PCR检测结果高度吻合,检测限约为5.7×101 copies/μL,灵敏度比荧光定量PCR方法高10倍。最后,我们也检测了感染WSSV的螯虾组织样本,结果表明本研究构建的金纳米探针结合暗场显微镜定量检测WSSV实际样本的结果与荧光定量PCR结果相近。因此,本研究构建的金纳米探针-暗场显微镜检测WSSV方法,制备探针简单,检测快速,灵敏度也比常用的荧光定量PCR技术高10倍。综上所述,本文建立的金纳米探针结合暗场显微镜检测WSSV技术具有操作简便、检测时间短（只需要将虾体组织匀浆上清与探针孵育30分钟后通过暗场拍照并用软件自动计数）和灵敏度高的优势,为WSSV的超灵敏快速检测提供了一种新的技术,有望服务于基层养殖单位。
郭莹[3]（2020）在《罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立》文中研究指明本研究针对罗氏沼虾常见病原白斑综合征（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）和虾肝肠胞虫（EHP）建立了单一PCR病原检测技术和多重PCR病原检测技术,同时对罗氏沼虾致病性气单胞菌维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌进行分离鉴定以及致病性和耐药性进行探究,主要研究结果如下:1. 罗氏沼虾WSSV、IHHNV和EHP单一PCR检测技术的建立本研究通过设计虾肝肠胞虫（EHP）和白斑综合征（WSSV）特异性引物以及OIE推荐检测传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）所用引物序列,建立EHP、WSSV和IHHNV单一PCR检测方法,并对引物退火温度、预变性条件、变性条件和循环数进行优化,探究最佳单一PCR反应条件,并检测单一PCR反应的灵敏度。结果显示:WSSV单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度是59.8℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸50s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,WSSV单一PCR检测灵敏度为200 fg包含5.41x104个拷贝;IHHNV单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性45s,退火温度是57℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸30s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,IHHNV单一PCR的检测灵敏度是200 fg包含5.99x104个拷贝;EHP单一PCR反应的的最优程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度是58℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸20s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP单一PCR检测灵敏度是2 pg,包含6.36x105个拷贝。2. EHP和IHHNV、EHP和WSSV及IHHNV和WSSV多重PCR检测技术的建立本实验对EHP和IHHNV、EHP和WSSV以及IHHNV和WSSV分别建立多重PCR检测方法,对其引物的退火温度、预变性条件、变性条件和循环数进行优化,探究最佳多重PCR反应条件,并检测其特异性和反应灵敏度,结果表明:在EHP和IHHNV多重PCR反应中,其最优反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性45s,退火温度是57℃,反应时间是30s,72℃条件下延伸30s,共36个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP的检测灵敏度是200 pg包含6.36x107个拷贝,IHHNV的检测灵敏度是20 pg包含5.99x106个拷贝;在EHP和WSSV多重PCR反应中,其最优反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度为58℃,反应时间为30s,72℃延伸50s,共35个循环,最后72℃条件下延伸8min,EHP的检测灵敏度是200pg包含6.36x107个拷贝,WSSV的检测灵敏度是2 pg包含5.41x105个拷贝;在IHHNV和WSSV多重PCR反应中,其最反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,退火温度为58.9℃,反应时间为30s,72℃延伸50 s,共38个循环,最后72℃条件下延伸8min,IHHNV的检测灵敏度是20 pg包含5.99x106个拷贝,WSSV的检测灵敏度是2 pg包含5.41x105个拷贝。分别对三种多重PCR反应的特异性进行检测,结果表明,三种多重PCR反应的阴性对照豚鼠气单胞菌DNA和SPF罗氏沼虾DNA均无条带扩出,该结果表明本研究建立的三种多重PCR技术具有较强的特异性。3. 罗氏沼虾维氏气单胞菌和豚鼠气单胞菌的分离鉴定本实验从濒死罗氏沼虾幼虾和成虾肝胰腺中分别分离出两株致病菌,对其溶血性、革兰氏染色、形态学、生理生化进行鉴定,并结合16Sr RNA基因测序以及系统进化树分析,判断两株分离菌株分别为维氏气单胞菌（登录号MN733186）和豚鼠气单胞菌（登录号MN736843）,并利用分离菌株分别进行人工感染实验,结果发现,被感染的罗氏沼虾出现与自然水域患病虾相似的症状,且在较短时间内发病死亡,说明这两株分离菌株对罗氏沼虾均具有较强的致病性,对分离菌株的药物敏感性进行检测,结果显示维氏气单胞菌对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、多西环素和利福平5种药物高度敏感,对新生霉素和复方新诺明2种药物中度敏感,对环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、链霉素、卡那霉素、四环素7种药物耐药;豚鼠气单胞菌对头孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、四环素、多西环素5种药物高度敏感,对卡那霉素1种药物中度敏感,对环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、阿奇霉素、新生霉素、链霉素、复方新诺明和利福平8种药物耐药。本研究实验结果为罗氏沼虾气单胞菌的病原鉴定及药物诊治提供一定的参考和理论基础。
钱珺[4]（2019）在《日本沼虾白斑综合症病毒（WSSV）不同地区感染情况调查及其在不同组织中的分布》文中研究指明日本沼虾（Macrobrachium nipponense）,俗称河虾、青虾等,是我国非常重要的本土经济养殖品种之一,因其肉质鲜美、营养价值高深受广大人民的喜爱。日本沼虾的养殖业是我国甲壳类动物养殖业的重要组成部分,其主要养殖省份为安徽、湖北、江苏等地。白斑综合症病毒（White spot syndrome virus,WSSV）是一种严重的病毒性疾病,是对当今对虾养殖业危害最大的病毒之一。日本沼虾因其抗病能力强在野外或者养殖生产中都不易发生病害。但在2015年,无锡首次发现携带有WSSV的日本沼虾,虽然没有出现白斑综合症的主要症状,但因WSSV的存在,且当今日本沼虾的养殖技术以混养为主,日本沼虾可能成为WSSV的传播媒介,对其他甲壳类动物产生潜在的威胁,所以探索日本沼虾无损检测WSSV技术对于未显现症状的日本沼虾WSSV检测至关重要,且在良种选育、减少损失等方面有着极大的作用。通过该技术对不同地区日本沼虾以及日本沼虾体内组织进行WSSV检测分析,可以监测WSSV在我国部分地区的感染情况及感染规律,为预防治疗WSSV提供重要信息。日本沼虾的第二步足和尾部肌肉在实际检测中,均可作为样本进行WSSV检测,但尾部肌肉的取样会造成样本死亡,而使用第二步足作为取样组织不会造成样本死亡,且虾蟹类有再生功能,所以选用第二步足作为检测样本与尾部肌肉进行对比分析,样品数第二步足与尾部肌肉均为40,两个组织均从从同一样本取下,第二步足WSSV检出率为55%,尾部肌肉检出率为50%,且检出结果均对应,尾部肌肉检测到WSSV,对应的第二步足也可检测到WSSV,结果表明第二步足与尾部肌肉检测出WSSV的一致性较高,且在第二步足中,WSSV表达量更高,更容易被检测出。WSSV检测在我国使用的方法为国标法,但国标法可检测的WSSV病毒量范围较小,当病毒含量较低时,通过国标法,无法做出有效的检测,所以通过使用荧光定量PCR技术,与国标法进行对比。将病毒含量高的样本稀释病毒浓度为1×101.0、1×102.0、1×103.0、1×104.0、1×105.0、1×106.0、1×107.0、1×108.0 copies/g,经检测当病毒浓度低于 1×103.0 copies/g以下时,通过国标法无法检测出有效结果,而荧光定量PCR在这八个病毒浓度梯度均可以检测出有效Ct值。所以使用第二步足作为检测组织,利用荧光定量P C R的技术,建立了一种无损检测感染WSSV日本沼虾的方法。采用荧光定量PCR技术对内蒙古巴彦淖尔乌拉特前旗五原县、湖北荆州、安徽宣城、江苏无锡太湖四个地区的日本沼虾进行WSSV检测,检测结果表明四个地区均有不同程度的感染,其中内蒙古巴彦淖尔乌拉特前旗五原县感染率为55.00%,湖北荆州感染率为19.44%,安徽宣城与江苏太湖地区感染率为25.00%。将Ct值代入标准曲线计算出病毒拷贝数,根据感染程度从高到低:内蒙古>湖北>太湖>安徽,其中内蒙古巴彦淖尔乌拉特前旗五原县日本沼虾感染WSSV的平均病毒拷贝数为103.96 copies/g,湖北荆州为103.70 copies/g,江苏无锡太湖为103.59 copies/g,安徽宣城为103.56 copies/g。采用荧光定量PCR技术对日本沼虾胚胎及不同组织进行病毒分布情况检测,结果表明,在感染WSSV的日本沼虾中,病毒检出率大于90%的有肝胰腺（28/30,93.00%）、脑（27/30,90.00%）、肌肉（27/30,90.00%）、腹神经（27/30,90.00%）,检出率介于 80%到 90%的有心（23/30,83.33%）、肠道（26/30,86.67%）、卵巢（23/30,83.33%）、胚胎（23/30,83.33%）,检出率介于70%到80%的为鳃（23/30,76.67%）。将荧光定量PCR得到的Ct值代入标准曲线,得到的各组织病毒拷贝数,进行SPSS统计分析,结果表明,肠与鳃、卵巢、脑、肌肉差异显着（P<0.05）,肝胰腺与鳃、卵巢、脑差异显着（P<0.05）,卵巢与脑、腹神经、肠、肝胰腺差异显着（P<0.05）,肌肉与肠、肝胰腺差异显着（P<0.05）。WSSV感染程度肝胰腺>胚胎>肠道>腹神经>心>脑>肌肉>鳃>卵巢,感染程度最高的肝胰腺平均病毒拷贝数为104.35copies/g,感染程度最低的卵巢所携带的平均病毒拷贝数103.71 copies/g,其余胚胎平均病毒拷贝数为104.34 copies/g,肠道为104.31 copies/g,腹神经为 104.02 copies/g,心为 103.97 copies/g,脑为 103.89 copies/g,肌肉为103.86 copies/g,鳃为 103.82 copies/g。
孙卫芳[5]（2019）在《养殖对虾五种常见病原的MNPCR检测法的构建优化》文中研究表明随着凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）养殖业的规模化发展,其病害的威胁也日益增大,对其病害的防控目前主要以预防为主,防治结合。因此,在养殖生产过程中及时监测虾体携带病原的状况,并科学地运用生态防控技术,这对保障养殖生产效益,促进产业的健康发展具有重要意义。对此,本研究旨在针对养殖对虾虾红细胞虹彩病毒（SHIV）、肝肠胞虫（EHP）、副溶血性弧菌（VPAHPND）、白斑综合症病毒（WSSV）以及传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）等主要的五种常见病原,优化建立一种可同时检测多种病原的多重巢氏PCR（Multiplenested PCR,MNPCR）检测方法,为后续进一步优化和集成养殖对虾病害生态防控技术提供技术支持。本研究首先采用单种病原的PCR检测技术对2017-2018年广东省茂名市和汕尾市的对虾养殖主产区的凡纳滨对虾样品开展SHIV、EHP和VPAHPND等三种病原的感染情况调查分析,结果发现养殖对虾中SHIV、EHP和VPAHPND均有检出,其中SHIV和EHP的阳性率较高,分别为23.81%、23.13%,VPAHPND检出率相对较低,为3.40%。此外,在采集的池塘水和水源水样品中亦均检出SHIV、EHP和VPAHPND,其中,SHIV阳性率为 30.43%和 44.00%,EHP 为 47.83%和 36.00%,VPAHPND 为 4.35%和 4.00%。而在所放养的虾苗中偶尔可检出一定量的VPAHPND;在幼虾饵料生物——丰年虫卵中检测发现其亦具有一定的EHP和VPAHPND阳性。针对以上结果,本研究选择SHIV、EHP和VPAHPND等三种病原,以及WSSV和IHHNV等两种传统常见的对虾病原作为检测目标。分别设计和优化针对SHIV、EHP、VPAHPND、WSSV、IHHNV的特异性巢式PCR引物,以所构建五种病原的阳性质粒为参照,建立并优化可同时检测五种病原的多重巢式PCR技术。结果显示,该多重巢式PCR方法对SHIV、EHP、VPAHPND、WSSV以及IHHNV的扩增产物片段大小分别为129 bp、176 bp、402 bp、230 bp和294 bp。其中,第一轮扩增的最佳退火温度为61℃,最佳引物浓度为0.32 μmol/L,EX Taq和dNTP最佳浓度分别为1.5 U/25 μL、1.5 mmol/L;第二轮扩增的最佳退火温度为60℃,最佳引物浓度为0.48 μmol/L,EX Taq和dNTP最佳浓度分别为1.5 U/25 μL、1.5 mmol/L。经检验,该多重巢式PCR检测技术对IHHNV的最低检测量为1 ×102copy/μL,VPAHPND、WSSV、EHP、SHIV 为 1×101copy/μL。其后,于广东省沿海养殖主产区选择未爆发病害的池塘采集凡纳滨对虾样品,采用该检测技术对其病原进行检测。结果显示,在所检测对虾样品中SHIV、EHP和WSSV的阳性率分别为8.02%、54.01%和15.51%。对汕尾养殖基地发病池塘对虾病原检测结果显示SHIV的阳性率为100%,EHP和WSSV分别为77.78%、44.44%。可见,该检测技术可有效运用于对虾养殖生产过程中的多病原高效监测。
景亚运[6]（2016）在《HD-3复方中草药对凡纳滨对虾免疫酶影响和抗WSSV感染分析》文中研究表明随着国内外学者对对虾白斑综合征病毒（WSSV）的研究深入,在病原分子基因水平、感染传播和对虾免疫保护方面取得了丰硕的研究成果,但在防控技术上未能获得理想的防治效果。本实验旨在调查了解养殖凡纳滨对虾WSSV检出率和发病情况,应用前期筛选的抗WSSV专用中草药HD-3进行感染临床试验,通过统计分析对虾死亡率和对虾免疫酶活数据,结合荧光定量PCR、组织病理学检测和超微病理学检测,确定投喂中草药的最佳预防方案,并开展中试试验检验生产疗效。1.在2014年7月-2015年12月,对辽宁、河北、天津、山东和浙江五省份,杨家泊、滨州、潍坊、胶南等环黄渤海凡纳滨对虾主产区,共采集29批次样品。每个养殖场样品定义为同一批次,进行WSSV病原携带率和养殖工艺调查。通过DNA提取,利用套式PCR和荧光定量PCR诊断凡纳滨对虾的WSSV阳性率。结果显示,在北方凡纳滨对虾主要产区通过套式PCR方法,WSSV阳性检出率高达72.4%;通过荧光定量方法,WSSV检出率达86.2%。荧光定量检测方法敏感度在101copies/mg优于套式PCR。传统土塘养殖工艺凡纳滨对虾WSSV检出率和感染程度高于大棚养殖和工厂化养殖模式。2.基础饲料添加3%HD-3复方中草药做药饵,每天2次投喂量占对虾体重5%,水体温度2528℃,盐度1820‰,溶解氧6.5mg/L以上。投喂1d、4d、7d、10d、13d、16d和19d药饵后进行口服WSSV毒饵感染方式攻毒,统计对虾症状表现和死亡率,测定对虾酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）四种免疫因子。结果显示:在饲料中添加HD-3中草药,可以起到保护对虾的作用,预防13d、16d和19d在试验结束后仍有存活对虾,其中实验组16d获得最高的免疫保护率,达到36.7±3.3%,存活者健康与空白对照组对虾无异。服用HD-3 10d以后,可以显着提高对虾PO、SO D和AKP活力（P<0.05）,缓慢提升ACP活力（P>0.05）。攻毒后服用较长时间中草药的实验组对虾,PO、SOD、AKP和ACP活力可以获得更持久的免疫活性。3.通过荧光定量对阳性对照组和各实验组不同感染时期凡纳滨对虾腮组织内病毒进行定量分析,显示随着服用中草药时间的延长,对虾体内病毒增长幅度和最大峰值总体上低于阳性对照组。在感染72h后,阳性对照组病毒含量达到106 copies/mg峰值时,服用中草药10d以后实验组病毒含量显着小于阳性对照组（P<0.05）,仍在104 copies/mg数量级。而存活对虾体内病毒含量整体较低,处于103 copies/mg数量级以下。通过组织病理观察统计细胞核肿大程度（SOI）,发现SOI与WSSV感染程度成正比,在腮组织和胃组织内,实验组10d-19d在感染后SOI整体上低于阳性对照组,表现出良好的保护率。并且攻毒后存活对虾SOI大多处于中度感染以下。在超微组织病理分析中,阳性对照组中,腮、胃和甲壳下表皮中受WSSV感染细胞数目和完整WSSV病毒含量明显多于用药组的存活对虾。在用药组中对虾病毒形态多表现为大多数细胞完整,有稀疏、少量的病毒粒子存在,囊膜和核衣壳组装多数不完整,亚细胞器诸如线粒体、内质网等较清晰完整。超微电镜观察结果与荧光定量和SOI结果相符,推测该中草药HD-3对阻断WSSV侵染和细胞内增殖有显着效果。4.将抗WSSV中草药HD-3在WSSV阳性检出的对虾养殖场进行中试试验,试验周期28天。经过整个养殖周期,对虾没有爆发白斑综合征,由统计数据分析显示,抗WSSV中草药实验组显着提高了对虾的增重率和成活率（P<0.05）。添加中草药可以在一定程度上提高对虾免疫活力,尤其在高温期,PO和ACP显着高于对照组。通过定量PCR,显示中草药对WSSV有减缓增殖的趋势。
钟汝杰[7]（2013）在《中国对虾整合素β亚基与对虾白斑症病毒（WSSV）感染的相互关系研究》文中研究表明整合素是一类由αβ亚基组成的异二聚体细胞黏附分子，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互黏附，参与细胞与细胞外基质之间的双向信号传导。整合素广泛分布于细胞表面并被证实为大量病毒的受体或共受体，它的大多数配体分子通过特征性的RGD（Arg-Gly-Asp）模体与之结合。对虾白斑症病毒（WSSV）病是危害中国对虾养殖业健康发展的主要疾病之一，前期研究表明WSSV多个含有RGD模体的囊膜蛋白与WSSV的感染相关。因此，整合素可能是WSSV潜在的受体蛋白。为了阐明整合素在WSSV感染过程中的潜在作用，探讨整合素和WSSV的相互关系，本论文利用抗中国对虾整合素β亚基（FcβInt）单克隆抗体2C5，结合ELISA和流式细胞术跟踪检测了中国对虾在感染白斑症病毒（WSSV）后血细胞中的FcβInt表达变化情况，流式细胞术结果显示颗粒与半颗粒血细胞上的FcβInt分布丰度显着高于透明细胞，且在感染WSSV后这两种血细胞上的FcβInt丰度发生显着上调，在12h时达到最高值，而透明细胞上的FcβInt丰度未发生显着变化；ELISA结果显示总血细胞中的FcβInt蛋白含量在感染WSSV后同样出现显着上调，在12h时达到最高值；荧光定量PCR检测结果显示中国对虾在感染WSSV后总血细胞中的FcβInt转录水平发生显着上调，且在12h时达到最高值，而血细胞中的WSSV基因组拷贝数则在24h时发生显着升高。同时，对WSSV六个囊膜蛋白进行原核重组表达，VOPBA和Dot blotting检测结果显示VP37、VP110、VP187及重组VP31均具有FcβInt结合活性，而VP26和VP28不具有FcβInt结合活性；阻断ELISA和Dot blotting检测结果显示FcβInt混合单抗（2C5和2C10）对对虾血细胞与WSSV相互结合作用具有一定阻断效果。论文研究结果为论证FcβInt作为WSSV潜在细胞受体提供了数据支撑。具体研究内容和结果如下：（1）抽提中国对虾血细胞总RNA，根据FcβInt的全长基因序列设计引物，克隆FcβInt VWA结构域基因片段，构建了FcβInt VWA结构域融合表达载体pET32a-FcβInt-VWA，转入大肠杆菌后成功表达，应用镍离子螯合亲和层析纯化重组蛋白，最终获得了分子量大小为50kDa的重组蛋白rFcβInt-VWA。（2） Western blotting分析两株杂交瘤细胞株2C5和2C10分泌小鼠抗FcβInt抗体的类型，两株单抗均属于IgM类；将两株杂交瘤细胞株扩大培养，并腹腔注射BALB/c小鼠制备抗FcβInt腹水单抗，并利用优球蛋白沉淀法结合凝胶过滤法进行纯化，纯化后的单抗经SDS-PAGE分析，纯度较高；间接ELISA实验测得腹水单抗2C5和2C10的效价分别为1:6400和1:12800；斑点免疫印迹实验显示，两株单抗特异性地与rFcβInt-VWA结合；间接免疫荧光实验和Western blotting表明单抗2C5能特异性识别一条分子量为120kDa左右中国对虾血细胞蛋白，推测其为FcβInt。通过对单抗的抗体类型、效价和特异性进行分析，选择抗体类型是IgM类、效价高、特异性好的单抗2C5作为检测中国对虾体内FcβInt的探针。（3）对中国对虾进行WSSV肌内注射后,在不同时间点进行取样。以单抗2C5作为探针，利用流式细胞免疫实验和ELISA检测对虾各时间点血细胞内FcβInt的蛋白动态表达变化；同时以特异性引物作为探针，利用实时荧光定量实验检测各时间点细胞内的FcβInt mRNA转录水平和WSSV病毒粒子拷贝数的动态变化。结果显示，中国对虾三种细胞内的FcβIn丰度不同，且在病毒感染后表现出较大差异的应答调节。在半颗粒和颗粒细胞内FcβInt的丰度相对较高，病毒感染后FcβInt在6h开始上调，并在12h达到最高水平，之后在24h降到对照水平；而在透明细胞上FcβInt的丰度相对较底，并在病毒感染后没有显着变化。荧光定量实验测得，病毒感染后，总血细胞中FcβInt mRNA的转录水平在12h达到峰值，为对照组的5.21倍；WSSV病毒粒子拷贝数在18h前维持在较低水平，在24h急剧升高，之后缓慢上升。（4）对WSSV六个囊膜蛋白进行原核重组表达，VOPBA和Dot blotting检测结果显示VP37、VP110、VP187及重组VP31均具有FcβInt结合活性，而VP26和VP28不具有FcβInt结合活性；阻断ELISA和Dot blotting检测结果显示FcβInt混合单抗（2C5和2C10）对对虾血细胞与WSSV相互结合作用具有一定阻断效果。
刘鹿山[8]（2013）在《对虾白斑综合征病毒（WSSV）双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立与应用》文中进行了进一步梳理对虾白斑病是对虾养殖中危害最大的疾病之一，目前没有有效的治疗手段，因而白斑病的检测成为重要的研究内容。双抗夹心ELISA是一种实验室常用的检测方法，其灵敏度和特异性较高、重复性较好。本文以兔抗对虾白斑综合征病毒（WSSV）多克隆抗体作为捕获抗体，以抗WSSV单克隆抗体作为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA定量检测WSSV的方法，并制作了应用该方法检测WSSV的标准曲线。具体研究内容和结果如下：（1）兔抗WSSV血清的制备：感染WSSV的中国对虾虾鳃冰浴研磨液经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心分离获得WSSV精提液，电镜下观察其纯度高、病毒粒子完整。取0.5mg提纯的WSSV与等量弗氏完全佐剂充分混匀皮下多点注射免疫新西兰大白兔；2周后第1次加强免疫，将WSSV与等量弗氏不完全佐剂混匀，皮下多点注射；此后每隔1周进行第2次和第3次加强免疫，采用皮下多点注射提纯的白斑综合征病毒。第3次加强免疫6d后收集抗血清。间接ELISA测得兔抗WSSV血清的效价为4×105。（2）WSSV单克隆抗体腹水的制备和纯化：复苏抗WSSV杂交瘤细胞株2E6、2A3并在24孔板中培养。用RPMI1640培养基将杂交瘤细胞从24孔板轻轻吹洗下来，1000rpm离心3min，用少量RPMI1640培养基重悬细胞沉淀后吸入注射器，注射到BALB/c小鼠腹腔。待小鼠腹腔膨大后取出腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水，SDS-PAGE结果显示单抗纯度较高。采用考马斯亮蓝法测定2E6、2A3的蛋白浓度分别为10mg/mL和5mg/mL。Western-blot结果显示两种单抗均为IgG。（3）双抗体夹心ELISA建立定量检测WSSV的方法：以兔抗WSSV血清为捕获抗体，WSSV单抗2E6和2A3按1:1（V/V）混合作为检测抗体。测定捕获抗体效价为4×105，检测抗体效价为6400。采用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体的最适工作浓度分别为3200倍和50倍。优化条件后，确定包被条件为4℃过夜，封闭条件为4%BSA于37℃封闭1h，发色条件为8mg/mL pNPP发色液避光发色，从而确定双抗体夹心ELISA的操作步骤。双抗体夹心ELISA测定12.551200倍梯度稀释的已知浓度的WSSV溶液，得到一组OD405值-WSSV浓度对数值的数据，经过非线性拟合得到一个四参数logistic方程标准曲线，浓度范围为7.530720ng/mL。取logistic方程标准曲线中线性相关系数大于0.99的7个连续的有效点，拟合出一个线性的标准曲线，浓度范围为1207680ng/mL，该方法的最低检测限120ng/mL。其恢复率范围为84.82%113.4%，板内重复率CV%值为2.347.11，板间精确率CV%值为2.186.9。（4）标准曲线的应用：应用双抗体夹心ELISA定量检测人工感染WSSV克氏原螯虾组织中WSSV的增殖。实验组和对照组分别有200只健康克氏原螯虾，暂养一周（PCR检测无WSSV），水温逐渐升至25℃。实验组投喂含WSSV的饵料，对照组投喂不含WSSV的饵料。84h内每隔12h分别从实验组和对照组随机抽取8只活虾，取鳃、血淋巴、肝胰腺、心脏、性腺、肠、肌肉，血淋巴按1:1（V/V）加入抗凝剂，其余组织按1g组织加入2mL0.01mol/L PBS冰浴研磨35min，4℃下4000rpm离心10min，上清液-20℃保存备用。感染WSSV的克氏原螯虾最早于24h血淋巴、肠、性腺中检测出WSSV阳性；36h时所有被检测的克氏原螯虾组织均检测为WSSV阳性，其中血淋巴、肠、性腺的病毒含量明显高于鳃、肝胰腺、肌肉、心脏的病毒含量。病毒在组织中含量最大值出现在72h的肠中，含量为6220ng/mL。从整个过程来看，感染前期（036h）病毒在这些组织内快速增殖；感染中期（3672h）病毒在这些组织内增殖速度明显减慢；感染后期（72h以后）病毒含量平稳，克氏原螯虾开始大量死亡。整个感染过程，WSSV敏感组织（血淋巴、肠、性腺）的病毒含量明显高于非敏感组织（鳃、心脏、肌肉、肝胰腺）的病毒含量。综上所述，本文在精提WSSV、制备兔抗WSSV血清、制备并纯化了WSSV单抗腹水的基础上，应用双抗体夹心ELISA建立了定量测定WSSV蛋白浓度的方法，这为实验室检测和定量分析WSSV提供了可靠的方法和依据，对于WSSV定量检测提供一种新的途径，具有重要的意义。
张涛[9]（2012）在《斑节对虾抗WSSV家系筛选》文中认为自1993年对虾白斑综合征病毒（White Spot Syndrom Virus, WSSV）爆发以来，我国对虾养殖业曾遭受重创，但随着WSSV流行病学和控制技术的研究、养殖技术和模式的改进，我国对虾养殖的产量和规模逐渐得到恢复和发展，目前对虾养殖产量每年可达到130多万t以上，但目前WSSV仍严重威胁着我国对虾养殖业的发展。培育在一定程度上抗WSSV的对虾新品种是解决我国对虾养殖业目前困境的有效途径之一。WSSV宿主极其广泛，对虾在养殖过程中普遍存在WSSV潜伏感染，携带少量病毒的对虾可以在良好的环境下继续生存而不暴发白斑综合征。由于此前在斑节对虾抗WSSV家系筛选时仅仅从定性的角度分析了对虾的死亡规律，而没有从定量的角度来选定合适的筛选浓度以及分析对虾肌肉内病毒含量的变化。本研究利用3种浓度WSSV粗提液（3×103、6×102、2×102copies/mL）和PBS液注射感染病毒携带量约1×105copies/g的斑节对虾，研究了斑节对虾的死亡规律、肌肉内病毒含量的变化、总血淋巴细胞数及不同血淋巴细胞的比例变化、5种免疫酶（ACP、AKP、PO、POD、SOD）活性的变化，建立了斑节对虾抗WSSV家系筛选的方法，并初步应用于37个斑节对虾家系的抗病筛选，选出了5个生长速度、抗病能力相对较强的家系。主要研究结果如下：1.3种浓度WSSV感染下，斑节对虾累积死亡率分别为（93.33±2.89）%、（56.67±5.77）%和（45.00±5.00）%，对虾肌肉内病毒含量均在48h达到最大值，濒死对虾肌肉内病毒含量均达到1010copies/g数量级。从对虾死亡规律及体内病毒含量来看，实验所用对虾WSSV毒力较先前报道没有变化；极少量的WSSV引起了潜伏感染WSSV的对虾暴发性死亡。对照组没有出现死亡，表明潜伏感染WSSV的对虾在没有外来病原刺激的情况下未发病死亡。2.3种浓度WSSV感染下，除个别时间点外，对虾总血淋巴细胞数的变化规律与肌肉中WSSV的扩增规律成负相关；半颗粒细胞所占比例最大，且初期呈现显着上升的趋势，后期比例虽有起伏但均维持在较高水平；颗粒细胞与透明细胞比例初期均显着下降，后期颗粒细胞比例显着低于初期，而透明细胞比例则与初期无显着性差异。3.3种浓度WSSV感染下，ACP、AKP、SOD活性总体呈现先上升后下降随后上升的趋势，其中SOD活性后期显着高于初期水平；PO、POD活性总体呈现先下降后上升随后下降、最后上升的趋势，但PO后期活性水平与初期相当，而POD后期活性水平显着高于初期。各免疫相关酶的反应强度与WSSV的感染浓度存在一定关系，除ACP外其余4种酶的活性变化均以6×102copies/mL浓度组最为敏感。PBS组5种免疫酶活性变化幅度均显着小于3种WSSV浓度感染组。4.采用25copies/g对虾体重的WSSV注射液感染37个斑节对虾家系，除两个家系成活率在50%左右外，有17个家系成活率接近100%，另有18个家系成活率几乎为0；根据抗病评价体系Ki=（∑Ai×Mi+1×F）/N将37个家系分为强抗病家系组和弱抗病家系组；通过对所有家系平均体重、抗病评价指数及两指标加权系数等综合分析，Y125*T115、S186、Y126*Y175、 T179*S132、F20*S198五个家系生长速度及抗病性能相对较强。实验结果表明，低剂量WSSV感染可以筛选到具有一定抗病性的对虾，即本研究建立的筛选方法可以应用于斑节对虾抗WSSV家系筛选中来。
韦秀梅[10]（2010）在《抗对虾白斑症病毒（WSSV）囊膜蛋白VP28独特型单克隆抗体的研制与应用》文中提出对虾白斑症病毒（WSSV）病是危害养殖对虾最严重的病害之一,自该病1993年暴发以来,在对其病原、病理、检测及诊断技术等方面的研究上取得了诸多成果。目前,研究WSSV感染的分子机理,寻求防控WSSV感染的方法已成为热点。已有研究表明WSSV-VP28在WSSV的感染入侵过程中起着非常重要的作用。论文纯化了前期制备的具有中和WSSV特性的抗VP28单克隆抗体（单抗）1D6（Abl）,并以之为抗原免疫小鼠,研制抗VP28独特型单抗（Ab2）杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）和竞争ELISA,从中筛选到一株单抗A1A5,该单抗能与WSSV竞争结合抗VP28抗体；以抗-抗独特型抗体（Ab3）进一步分析单抗A1A5的特性,证实了单抗A1A5是能模拟VP28的抗VP28独特型单抗；利用研制的抗VP28独特型单抗研究了VP28与宿主细胞间的相互作用,检测了VP28与中国对虾组织的结合,鉴定了VP28在中国对虾血细胞上的结合蛋白,为进一步确认VP28在WSSV感染中所起的作用,深入研究WSSV感染机理,切断WSSV感染途径提供新的依据。具体研究内容和结果如下：（1）抗VP28独特型单抗的研制。以前期已制备的具有中和WSSV特性的抗VP28单抗1D6杂交瘤细胞生产腹水,腹水依次经辛酸-硫酸铵法和Protein G亲和层析纯化,获得了纯度高、有活性的抗VP28中和单抗并用以免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术,研制抗VP28独特型单抗杂交瘤细胞,采用间接ELISA和竞争ELISA方法从杂交瘤细胞中筛选抗VP28独特型单抗,克隆得到1株抗VP28独特型单抗A1A5能识别抗VP28抗体,并能与WSSV竞争结合抗VP28抗体,初步证实单抗A1A5能模拟VP28的抗原构象。（2）以抗-抗独特型抗体分析抗VP28独特型单抗的特性。为了进一步确认单抗A1A5的特性,以A1A5杂交瘤细胞生产腹水,腹水经辛酸-硫酸铵法和ProteinG亲和层析纯化,获得纯化抗体用以免疫BALB/c小鼠制备抗血清,得到Ab3；采用间接免疫荧光分析（IIFA）、金标免疫电镜法（IEM）、竞争ELISA和螯虾体内中和实验多种方法分析了Ab3特性。IIFA证实Ab3可与感染WSSV的虾鳃反应；IEM结果显示Ab3可与WSSV结合,其结合位点位于WSSV囊膜上；竞争ELISA表明Ab3能与抗VP28抗体竞争结合WSSV上结合位点；以螯虾体内中和实验分析Ab3中和性,注射与Ab3孵育后WSSV的螯虾与仅注射WSSV的螯虾相比,其死亡时间明显延迟,证实Ab3能中和WSSV感染。以上结果说明了由Ab2免疫产生的抗体Ab3具有与类似Ab1特性。因此,根据抗独特型抗体理论推断,单抗A1A5是能模拟VP28的抗VP28独特型单抗。（3）抗VP28独特型单抗的应用。论文在成功研制抗VP28独特型单抗的基础上,利用抗VP28独特型单抗探讨了wSSv囊膜蛋白VP28与宿主细胞之间的相互作用关系。中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）血细胞与单抗A1A5孵育,再以荧光二抗染色,在中国对虾血细胞膜上可见黄绿色荧光,结果表明单抗A1A5能与中国对虾血细胞膜结合,中国对虾血细胞膜上存在VP28的受体蛋白。以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗WSSV混合单抗,建立了基于斑点免疫印迹（Dot-blot）和ELISA的WSSV与血细胞膜体外结合实验体系,提纯的血细胞膜固定于NC膜或酶标板上,将单抗A1A5或抗中国对虾血细胞颗粒单抗1G8与中国对虾血细胞膜作用后,再与WSSV孵育,结果显示A1A5组的WSSV结合量明显低于1G8组,单抗A1A5与中国对虾血细胞膜的结合能部分阻断WSSV与中国对虾血细胞膜的结合,这为证明VP28是WSSV感染相关的重要蛋白提供了新的依据。以IIFA和免疫组织化学方法（IHC）检测单抗A1A5与中国对虾各组织的结合,发现单抗A1A5可以与中国对虾鳃和肠组织结合,而不与肌肉、性腺、心脏、肝胰腺等组织结合,推断中国对虾鳃和肠组织中存在VP28的受体蛋白。以免疫共沉淀鉴定VP28在中国对虾血细胞上的结合蛋白,单抗A1A5可与中国对虾血细胞膜上分子量为47 kDa的蛋白结合,该蛋白可能是VP28在中国对虾血细胞膜上的受体蛋白。本论文为WSSV感染相关蛋白、分子机理以及预防控制研究提供了新的研究工具和研究方法。
二、聚合酶链反应(PCR)检测养殖对虾的白斑症病毒(WSSV)感染（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、聚合酶链反应(PCR)检测养殖对虾的白斑症病毒(WSSV)感染（论文提纲范文）
（1）传染性皮下及造血组织坏死病毒对不同发育阶段南美白对虾的感染差异研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 传染性皮下及造血组织坏死病毒的研究进展 |
| 1.1.1 IHHNV病理特征 |
| 1.1.2 IHHNV流行情况 |
| 1.1.3 IHHNV相关检测方法 |
| 1.1.3.1 常规PCR |
| 1.1.3.2 实时荧光定量PCR |
| 1.1.3.3 环介导等温扩增 |
| 1.1.3.4 组织病理学方法 |
| 1.1.3.5 斑点杂交和原位杂交 |
| 1.1.4 IHHNV预防与防疫 |
| 1.2 本课题的研究目的及意义 |
| 第2章 不同发育阶段南美白对虾自然感染IHHNV的调查 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验样品 |
| 2.3 实验器材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 DNA提取 |
| 2.4.2 感染型IHHNV的鉴定 |
| 2.4.3 普通PCR检测 |
| 2.4.4 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 普通PCR检测结果 |
| 2.5.1.1 IHHNV的普通PCR检测结果 |
| 2.5.1.2 不同地区南美白对虾样品普通PCR检测结果 |
| 2.5.1.3 不同发育阶段南美白对虾样品普通PCR检测结果 |
| 2.5.2 实时荧光定量PCR检测结果 |
| 2.6 讨论 |
| 第3章 不同发育阶段南美白对虾室内攻毒实验 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 南美白对虾仔虾室内攻毒实验 |
| 3.2.1 实验样品 |
| 3.2.2 实验器材 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.3.1 IHHNV病料制备 |
| 3.2.3.2 投喂攻毒 |
| 3.2.3.3 DNA提取 |
| 3.2.3.4 普通PCR检测 |
| 3.2.3.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 3.2.4 实验结果 |
| 3.2.4.1 普通PCR检测结果 |
| 3.2.4.2 实时荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 南美白对虾稚虾室内攻毒实验 |
| 3.3.1 实验样品 |
| 3.3.2 实验器材 |
| 3.3.3 实验方法 |
| 3.3.3.1 IHHNV病料制备 |
| 3.3.3.2 投喂攻毒 |
| 3.3.3.3 DNA提取 |
| 3.3.3.4 普通PCR检测 |
| 3.3.3.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 3.3.3.6 稚虾组织病理学检测 |
| 3.3.4 实验结果 |
| 3.3.4.1 普通PCR检测结果 |
| 3.3.4.2 实时荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3.4.3 组织病理学检测结果 |
| 3.4 南美白对虾成虾室内攻毒实验 |
| 3.4.1 实验样品 |
| 3.4.2 实验器材 |
| 3.4.3 实验方法 |
| 3.4.3.1 IHHNV病料制备 |
| 3.4.3.2 投喂攻毒 |
| 3.4.3.3 DNA提取 |
| 3.4.3.4 普通PCR检测 |
| 3.4.3.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 3.4.3.6 成虾组织病理学检测 |
| 3.4.4 实验结果 |
| 3.4.4.1 普通PCR检测结果 |
| 3.4.4.2 实时荧光定量PCR检测结果 |
| 3.4.4.3 组织病理学检测结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 南美白对虾不同组织器官感染IHHNV的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 南美白对虾稚虾不同组织器官IHHNV的检测 |
| 4.2.1 实验样品 |
| 4.2.2 实验器材 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.3.1 DNA提取 |
| 4.2.3.2 普通PCR检测 |
| 4.2.3.3 实时荧光定量PCR检测 |
| 4.2.4 实验结果 |
| 4.2.4.1 普通PCR检测结果 |
| 4.2.4.2 实时荧光定量PCR检测结果 |
| 4.3 南美白对虾成虾不同组织器官IHHNV的检测 |
| 4.3.1 实验样品 |
| 4.3.2 实验器材 |
| 4.3.3 实验方法 |
| 4.3.3.1 DNA提取 |
| 4.3.3.2 普通PCR检测 |
| 4.3.3.3 实时荧光定量PCR检测 |
| 4.3.4 实验结果 |
| 4.3.4.1 普通PCR检测结果 |
| 4.3.4.2 实时荧光定量PCR检测结果 |
| 4.3.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 附录 B |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）金纳米探针结合暗场显微镜快速检测对虾白斑综合征病毒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 对虾白斑综合征病毒的研究背景 |
| 1.1 对虾白斑综合征病毒的命名及分类地位 |
| 1.2 对虾白斑综合征病毒的形态结构 |
| 1.3 对虾白斑综合征的症状及病理变化 |
| 1.4 对虾白斑综合征病毒的主要结构蛋白 |
| 1.5 对虾白斑综合征病毒的检测方法 |
| 1.6 对虾白斑综合征的防治方法 |
| 2. 金纳米颗粒在生物检测中的应用 |
| 2.1 纳米材料概述 |
| 2.2 金纳米材料的性质 |
| 2.3 金纳米颗粒在生物检测方面的应用 |
| 3. 金纳米探针结合暗场显微镜技术检测病原体的应用 |
| 4. 论文研究内容及意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒方法的建立 |
| 1.材料 |
| 1.1 病毒毒株、质粒、菌株及实验动物 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 WSSV的感染和增殖 |
| 2.2 PCR检测WSSV |
| 2.3 WSSV的纯化 |
| 2.4 透射电镜观察WSSV |
| 2.5 实时荧光定量PCR检测WSSV方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR检测克氏原螯虾的WSSV感染情况 |
| 3.2 透射电镜观察WSSV |
| 3.3 实时荧光定量PCR定量检测WSSV |
| 4. 讨论 |
| 第二章 对虾白斑综合征病毒核衣壳蛋白VP664多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 质粒、菌株及实验动物 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 重组蛋白VP664的制备 |
| 2.2 动物免疫 |
| 2.3 效价测定 |
| 2.4 抗体纯化 |
| 2.5 多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 重组菌的诱导表达 |
| 3.2 重组蛋白的纯化 |
| 3.3 血清的效价测定 |
| 3.4 多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 4.讨论 |
| 第三章 金纳米探针-暗场显微镜检测对虾白斑综合征病毒方法的构建 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂和耗材 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 金纳米探针的制备 |
| 2.2 在暗场下观察探针结合WSSV样品 |
| 2.3 WSSV实际样品的检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 金纳米探针的表征 |
| 3.2 暗场显微镜观察探针捕获WSSV |
| 3.3 透射电镜观察探针标记WSSV的特异性 |
| 3.4 探针结合暗场显微镜定量检测WSSV的灵敏度测定 |
| 3.5 WSSV实际样品的检测 |
| 4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利目录 |
| 致谢 |
（3）罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 罗氏沼虾发展现状 |
| 2 传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) |
| 2.1 IHHNV基因结构与分类 |
| 2.2 IHHNV宿主范围 |
| 2.3 IHHNV病理症状 |
| 2.4 IHHNV的传播途径 |
| 2.5 IHHNV检测技术 |
| 3 白斑综合征病毒(WSSV) |
| 3.1 白斑综合征病毒形态结构 |
| 3.2 白斑综合征病毒命名 |
| 3.3 白斑综合征病毒基因组 |
| 3.4 白斑综合征病毒的病理症状 |
| 3.5 白斑综合征易感宿主和传播途径 |
| 3.6 白斑综合征检测技术 |
| 4 虾肝肠胞虫 |
| 4.1 虾肝肠胞虫的易感宿主和传播途径 |
| 4.2 虾肝肠胞虫致病性 |
| 4.3 虾肝肠胞虫患病症状及病理变化 |
| 4.4 虾肝肠胞虫检测方法 |
| 4.5 虾肝肠胞虫防控措施 |
| 5 细菌常规鉴定法 |
| 5.1 气单胞菌 |
| 5.2 气单胞菌致病性 |
| 5.3 细菌鉴定方法 |
| 6 研究内容及目的意义 |
| 第二章 罗氏沼虾IHHNV、EHP和 WSSV病原检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验毒株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 DNA提取 |
| 2.3 PCR反应体系 |
| 2.4 PCR条件优化 |
| 2.5 质粒构建 |
| 2.6 灵敏度检测 |
| 2.7 临床检验试验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 退火温度优化结果 |
| 3.2 预变性条件优化结果 |
| 3.3 变性条件优化 |
| 3.4 循环数优化 |
| 3.5 WSSV、IHHNV和 EHP的 PCR程序优化结果 |
| 3.6 灵敏度检测 |
| 3.7 临床检测试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 罗氏沼虾IHHNV、EHP和 WSSV多重PCR病原检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA提取 |
| 2.2 多重PCR反应体系 |
| 2.3 多重PCR反应条件优化 |
| 2.4 多重PCR特异性 |
| 2.5 多重PCR反应敏感性 |
| 3 结果 |
| 3.1 多重PCR退火温度优化 |
| 3.2 多重PCR预变性条件优化 |
| 3.3 多重PCR变性条件优化 |
| 3.4 多重PCR循环次数优化 |
| 3.5 多重PCR程序优化结果 |
| 3.6 多重PCR的特异性扩增结果 |
| 3.7 多重PCR灵敏度检测 |
| 4 讨论 |
| 第四章 罗氏沼虾两种细菌性病原的检测与鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要实验材料及仪器设备 |
| 1.2 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细菌分离培养 |
| 2.2 细菌形态观察 |
| 2.3 细菌生理生化特性鉴定 |
| 2.4 药敏实验 |
| 2.5 分子生物学鉴定 |
| 2.6 人工感染实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 病原菌形态特征 |
| 3.2 生理生化特性 |
| 3.3 药敏试验 |
| 3.4 细菌16SrRNA分子鉴定 |
| 3.5 人工感染 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）日本沼虾白斑综合症病毒（WSSV）不同地区感染情况调查及其在不同组织中的分布（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 白斑综合症研究进展 |
| 1.1 白斑综合症病毒概况 |
| 1.2 白斑综合征病毒的宿主及传播途径 |
| 1.3 白斑综合症病毒的入侵机制及形态发生 |
| 1.4 白斑综合症病毒症状及组织病理学研究 |
| 1.5 白斑综合症病毒的检测方法研究 |
| 1.6 白斑综合症的免疫与防治 |
| 2 日本沼虾白斑综合症病毒研究概况 |
| 2.1 日本沼虾养殖业发展现状 |
| 2.2 关于WSSV感染日本沼虾的研究进展 |
| 3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 日本沼虾无损检测WSSV方法的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验样品来源 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 预实验及样品制备 |
| 2.4.2 DNA的提取 |
| 2.4.3 国标法 |
| 2.4.4 实时荧光定量PCR及WSSV表达量检测 |
| 2.4.5 标准曲线的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 荧光定量检测第二步足与尾部肌肉中WSSV感染率 |
| 3.2 国标法与荧光定量PCR检测WSSV的差异 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 四个地区日本沼虾感染白斑综合症病毒情况调查分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 样品准备 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 四个地区WSSV感染率调查 |
| 3.2 四个地区感染WSSV程度调查 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 白斑综合症病毒在日本沼虾各组织中的分布 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 荧光定量检测各组织及胚胎感染WSSV情况 |
| 3.2 各组织WSSV感染程度差异对比 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 已发表或已接的收论文 |
（5）养殖对虾五种常见病原的MNPCR检测法的构建优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 凡纳滨对虾养殖概况 |
| 1.2 当前对虾养殖生产中的常见病原 |
| 1.2.1 副溶血性弧菌 |
| 1.2.2 肝肠胞虫 |
| 1.2.3 白斑综合症病毒 |
| 1.2.4 传染性皮下及造血组织坏死病毒 |
| 1.2.5 虾血细胞虹彩病毒 |
| 1.2.6 桃拉综合症病毒 |
| 1.2.7 对虾杆状病毒 |
| 1.3 对虾病原微生物的检测技术 |
| 1.3.1 组织病理学诊断 |
| 1.3.2 胶体金免疫层析技术检测法 |
| 1.3.3 分子生物学方法 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 广东沿海地区凡纳滨对虾EHP、VP_(AHPND)和SHIV感染情况调查与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 样品采集 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA提取 |
| 2.2.2 病原检测 |
| 2.2.3 PCR扩增 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 EHP、VP_(AHPND)和SHIV的PCR检测结果 |
| 2.3.2 不同地区养殖凡纳滨对虾三种病原的感染情况 |
| 2.3.3 不同养殖模式下凡纳滨对虾三种病原的感染情况 |
| 2.3.4 各个养殖要素的病原携带情况 |
| 2.3.5 滞长养殖对虾的病原检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 两个养殖区EHP、VP_(AHPND)和SHIV的分布特征分析 |
| 2.4.2 养殖对虾出现生长相关问题的病原因素分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 五种病原的多重巢式PCR检测方法的构建与优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 样品采集 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 五种病原的特异性引物设计 |
| 3.2.2 阳性质粒DNA的制备 |
| 3.2.3 多重巢式PCR反应条件优化 |
| 3.2.4 多重巢式PCR方法的灵敏度检测 |
| 3.2.5 以多重巢式PCR方法检测采集的样品 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 多重巢式PCR反应条件的优化结果 |
| 3.3.2 多重巢式PCR检测方法的灵敏度测试 |
| 3.3.3 凡纳滨对虾病原检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 多重巢式PCR体系优化结果分析 |
| 3.4.2 两种养殖模式下EHP、WSSV、IHHNV、VP_(AHPND)和SHIV的分布特征分析 |
| 3.4.3 养殖对虾生长问题与感染EHP的相关性分析 |
| 3.4.4 汕尾市高位池养殖池中对虾出现大规模死亡的原因分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
（6）HD-3复方中草药对凡纳滨对虾免疫酶影响和抗WSSV感染分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 我国凡纳滨对虾养殖现状 |
| 1.2 对虾白斑综合征病毒（WSSV）研究进展 |
| 1.2.1 对虾白斑综合征病毒的形态结构 |
| 1.2.2 对虾白斑综合征的病症及检测方法 |
| 1.2.3 WSSV检测方法 |
| 1.2.4 对虾白斑综合征病毒的宿主及传播途径 |
| 1.2.5 WSSV侵染过程 |
| 1.3 对虾免疫研究进展 |
| 1.3.1 物理防御 |
| 1.3.2 细胞免疫 |
| 1.3.3 体液免疫 |
| 1.3.4 对虾抗病毒免疫研究存在的问题 |
| 1.4 WSSV防治的研究进展 |
| 1.4.1 免疫增强剂的应用 |
| 1.4.2 消毒剂使用 |
| 1.4.3 养殖环境的改善 |
| 1.4.4 分子水平防治 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 第二章 环黄渤海养殖凡纳滨对虾WSSV初步调查 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 对虾WSSV阳性检测 |
| 2.2.2 WSSV感染调查及养殖工艺调查统计 |
| 2.2.3 标准品的构建 |
| 2.2.4 标准曲线的绘制 |
| 2.2.5 重复性实验 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 HD-3 中草药对养殖凡纳滨对虾免疫酶的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物及养殖用水 |
| 3.1.2 药饵的制备 |
| 3.1.3 毒饵的制备 |
| 3.1.4 实验设计 |
| 3.1.5 人工感染方法 |
| 3.1.6 凡纳滨对虾免疫因子测定方法 |
| 3.1.7 攻毒后对虾阳性检测 |
| 3.1.8 数据处理与分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 人工感染的结果 |
| 3.2.2 感染对虾的症状 |
| 3.2.3 抗WSSV中草药对凡纳滨对虾生长的影响 |
| 3.2.4 抗WSSV中草药对凡纳滨对虾免疫指标的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 HD-3 复方中草药对凡纳滨对虾感染WSSV的防治效果 |
| 3.3.2 HD-3 复方中草药对对虾生长性能的影响 |
| 3.3.3 中草药对对虾非特异性免疫酶的影响 |
| 第四章 HD-3 复方中草药阻断WSSV感染病理分析 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 凡纳滨对虾组织内病毒数量变化 |
| 4.1.2 组织病理切片 |
| 4.1.3 超微病理切片 |
| 4.1.4 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 病毒粒子数量变化 |
| 4.2.2 组织病理感染程度分析 |
| 4.2.3 超微病理切片 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 HD-3 复方中草药对病毒增殖作用 |
| 4.3.2 HD-3 复方中草药对对虾机体组织保护 |
| 第五章 HD-3 复方中草药的生产性验证 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 对虾生长参数测定 |
| 5.2.2 HD-3 复方中草药对凡纳滨对虾免疫指标的影响 |
| 5.2.3 凡纳滨对虾WSSV携带量的变化 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 HD-3 复方中草药对凡纳滨对虾生长的影响 |
| 5.3.2 HD-3 复方中草药对凡纳滨对虾免疫酶活性的影响 |
| 5.3.3 HD-3 复方中草药对对虾白斑综合征的预防效果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）中国对虾整合素β亚基与对虾白斑症病毒（WSSV）感染的相互关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 对虾白斑症病毒病（WSSV）的研究进展 |
| 1.1.1 WSSV的病原学和流行病学 |
| 1.1.2 WSSV形态与超微结构 |
| 1.1.3 WSSV的主要囊膜蛋白 |
| 1.1.4 WSSV的主要核衣壳蛋白 |
| 1.1.5 WSSV基因组 |
| 1.1.6 WSSV的组织嗜性 |
| 1.1.7 WSSV的传播，寄主范围和潜在的携带者 |
| 1.2 整合素的研究进展 |
| 1.2.1 整合素家族的基因结构与进化历史 |
| 1.2.2 整合素的结构特征 |
| 1.2.3 整合素的分布和功能 |
| 1.2.4 内信号调节整合素的亲和力 |
| 1.2.5 细胞内外信号转导 |
| 1.2.6 整合素作为病毒受体的研究 |
| 1.3 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 中国对虾β-integrin VWA结构域的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 中国对虾血细胞mRNA的抽提 |
| 2.2.2 cDNA 模板的合成 |
| 2.2.3 FcβInt-VWA表达基因的扩增及纯化 |
| 2.2.4 表达载体pET32a-FcβInt-VWA的构建 |
| 2.2.5 表达载体pET32a-FcβInt-VWA的诱导表达 |
| 2.2.6 重组表达蛋白rFcβInt-VWA及标签蛋白rHis的纯化 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 中国对虾血细胞总RNA的提取 |
| 2.3.2 pET32a-FcβInt-VWA的基因克隆 |
| 2.3.3 rFcβInt-VWA的诱导表达及纯化 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 抗中国对虾β-integrin单克隆抗体的生产 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗中国对虾β-integrin单克隆抗体类型的鉴定 |
| 3.2.2 抗中国对虾β-integrin单克隆抗体的腹水生产 |
| 3.2.3 抗中国对虾β-integrin单克隆抗体的特性分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 抗中国对虾β-integrin单克隆抗体的类型 |
| 3.3.2 腹水的纯化 |
| 3.3.3 单抗的腹水蛋白浓度及效价测定 |
| 3.3.4 Dot blotting检测单抗与免疫原的结合特异性 |
| 3.3.5 间接免疫荧光法（IFAT）检测单抗与血细胞的结合特异性 |
| 3.3.6 Western blotting检测单抗与血细胞膜的结合特异性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 单抗类型的鉴定 |
| 3.4.2 腹水的生产 |
| 3.4.3 腹水的纯化 |
| 3.4.4 单抗的特性分析 |
| 小结 |
| 第四章 中国对虾β-integrin对白斑症病毒感染的应答研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 WSSV的精提 |
| 4.2.2 WSSV感染及取样 |
| 4.2.3 流式细胞免疫荧光分析(FCIFA) 检测FcβInt |
| 4.2.4 间接ELISA检测FcβInt |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR相对定量检测FcβInt mRNA转录水平 |
| 4.2.6 实时定量PCR检测病毒粒子拷贝数 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 WSSV感染后对虾血细胞上FcβInt表达动态变化 |
| 4.3.2 WSSV感染后对虾血细胞中FcβInt蛋白浓度的动态变化 |
| 4.3.3 WSSV感染后对虾血细胞中FcβInt转录水平的动态变化 |
| 4.3.4 WSSV感染后对虾血细胞中病毒粒子拷贝数的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 中国对虾β-integrin与WSSV相互关系研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 WSSV囊膜蛋白的诱导表达及纯化 |
| 5.2.2 VOPBA鉴定具β-integrin 结合活性的WSSV囊膜蛋白 |
| 5.2.3 Dot blotting检测FcβInt与重组囊膜蛋白的结合活性 |
| 5.2.4 WSSV颗粒的地高辛（DIG）标记 |
| 5.2.5 ELISA检测β-integrin单抗对WSSV阻断效果 |
| 5.2.6 Dot blotting检测β-integrin单抗对WSSV阻断效果 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 WSSV及其重组囊膜蛋白与β-integrin 的结合活性检测 |
| 5.3.2 Dot blotting检测FcβInt与重组囊膜蛋白的结合活性 |
| 5.3.3 WSSV的DIG标记 |
| 5.3.4 ELISA检测β-integrin单抗对WSSV阻断效果 |
| 5.3.5 Dot blotting检测β-integrin单抗对WSSV阻断效果 |
| 5.4 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）对虾白斑综合征病毒（WSSV）双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 0 前言 |
| 0.1 对虾白斑综合征病毒概述 |
| 0.2 对虾白斑综合征病毒检测技术的研究进展 |
| 0.3 双抗体夹心ELISA的研究进展 |
| 1 兔抗WSSV血清的生产 |
| 1.1 抗原的生产 |
| 1.2 兔抗WSSV血清的生产 |
| 2 WSSV单克隆抗体的生产 |
| 2.1 WSSV单克隆抗体类型的鉴定 |
| 2.2 抗WSSV单克隆抗体的体内生产 |
| 3 双抗体夹心ELISA检测WSSV标准曲线的建立 |
| 3.1 兔抗WSSV血清和单抗的效价测定 |
| 3.2 双抗夹心ELISA最适条件的确定 |
| 3.3 双抗体夹心ELISA标准曲线的建立 |
| 3.4 克氏原螯虾体内组织的WSSV随时间的含量变化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
（9）斑节对虾抗WSSV家系筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 我国对虾养殖业的发展及斑节对虾养殖概况 |
| 1.1 我国对虾养殖业的发展 |
| 1.2 斑节对虾养殖概况 |
| 第二节 白斑综合征病毒的研究进展 |
| 第三节 国内外对虾抗病良种选育的研究 |
| 3.1 抗病良种选育简介 |
| 3.2 国内外对虾良种选育的概况 |
| 第二章 斑节对虾抗 WSSV 家系筛选方法的建立 |
| 第一节 半致死浓度的筛选 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 第二节 低剂量 WSSV 感染对斑节对虾体内潜伏期病毒及机体免疫的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 斑节对虾抗 WSSV 家系筛选 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 总结 |
| 缩写词 |
| 参考文献 |
| 附录 硕士期间已发表的论文和参加的会议 |
| 致谢 |
（10）抗对虾白斑症病毒（WSSV）囊膜蛋白VP28独特型单克隆抗体的研制与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 对虾白斑症病毒 |
| 1.2 中和抗体 |
| 1.3 抗独特型抗体 |
| 2 抗VP28独特型单克隆抗体的抗原制备 |
| 2.1 兔抗VP28抗体的制备与纯化 |
| 2.2 抗VP28中和单克隆抗体(Ab1)的纯化 |
| 3 抗VP28独特型单克隆抗体的研制 |
| 3.1 抗VP28独特型单克隆抗体(Ab2)杂交瘤细胞的研制 |
| 3.2 抗VP28独特型单克隆抗体的筛选 |
| 4 以抗-抗VP28独特型抗体分析抗VP28独特型单克隆抗体的特性 |
| 4.1 抗-抗VP28独特型抗体(Ab3)的制备 |
| 4.2 以Ab3分析抗VP28独特型单克隆抗体特性 |
| 5 抗VP28独特型单克隆抗体的应用 |
| 5.1 模拟VP28阻断WSSV与中国对虾血细胞的结合 |
| 5.2 模拟VP28与中国对虾组织的结合 |
| 5.3 鉴定VP28在中国对虾血细胞上的结合蛋白 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
四、聚合酶链反应(PCR)检测养殖对虾的白斑症病毒(WSSV)感染（论文参考文献）
- [1]传染性皮下及造血组织坏死病毒对不同发育阶段南美白对虾的感染差异研究[D]. 王静静. 鲁东大学, 2021(12)
- [2]金纳米探针结合暗场显微镜快速检测对虾白斑综合征病毒的研究[D]. 白亚南. 扬州大学, 2021(02)
- [3]罗氏沼虾两种病毒、两种细菌及虾肝肠胞虫检测与鉴定方法的建立[D]. 郭莹. 华中农业大学, 2020(02)
- [4]日本沼虾白斑综合症病毒（WSSV）不同地区感染情况调查及其在不同组织中的分布[D]. 钱珺. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]养殖对虾五种常见病原的MNPCR检测法的构建优化[D]. 孙卫芳. 浙江海洋大学, 2019
- [6]HD-3复方中草药对凡纳滨对虾免疫酶影响和抗WSSV感染分析[D]. 景亚运. 大连海洋大学, 2016(12)
- [7]中国对虾整合素β亚基与对虾白斑症病毒（WSSV）感染的相互关系研究[D]. 钟汝杰. 中国海洋大学, 2013(01)
- [8]对虾白斑综合征病毒（WSSV）双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立与应用[D]. 刘鹿山. 中国海洋大学, 2013(03)
- [9]斑节对虾抗WSSV家系筛选[D]. 张涛. 上海海洋大学, 2012(03)
- [10]抗对虾白斑症病毒（WSSV）囊膜蛋白VP28独特型单克隆抗体的研制与应用[D]. 韦秀梅. 中国海洋大学, 2010(06)