一、猪传染性胸膜肺炎的诊断和防制（论文文献综述）
朱岩昆[1]（2013）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析》文中认为猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。该致病菌引起的主要病症为肺出血、坏死和纤维素性渗出等。该病于1957年首次报道，自报道以来该病已在世界范围内广泛流行，并给许多国家的养猪产业造成了严重的经济损失。针对该病治疗的越早，经济损失也越少的特点，建立一种快速、灵敏、高效的诊断方法已成为新的研究热点。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分别设计一对引物，可以特异性扩增出637bp和431bp的目的片段。运用多重PCR技术，建立一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。结果显示，已知的胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能扩增出特异性的目的片段。特异性检验时，血清型5a能扩增出目的片段，而其他对照细菌均未扩增出相应的目的片段；根据该多重PCR方法对临床分离的通过生理生化分析鉴定的5株疑似猪胸膜肺炎放线杆菌进行了分子鉴定，其中有4株鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。以血清5a型作为待检菌进行灵敏性验证时，发现最低检出菌量为50个。表明通过表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA建立的多重PCR方法灵敏度高，特异性强。该PCR方法的建立，为猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了一种快捷高效的方法。为了指导临床用药，筛选出合适的临床药物，对以前分离的通过生理生化分析等鉴定和本次多重PCR确认的App进行了药敏试验和最小抑菌浓度（Minimum InhibitoryConcentration, MIC）试验，确认的4株App仅对10种临床常用药物中的头孢噻呋、阿米卡星、左旋氧氟沙星敏感，其它7种药物不敏感。对敏感药物进行MIC分析发现，左旋氧氟沙星对xx-1、xx-2、xx-3、xx-5四株菌株的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/23、6.25/23，阿米卡星的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/22、6.25/23，头孢噻呋的MIC值分别为37.5/22、37.5/22、37.5/23、37.5/24。通过药敏试验和最小抑菌浓度试验给临床用药及防治提供参考。App的毒力因子主要包括外毒素（Apx）、荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（TBp）等，近年的研究热点主要集中在外毒素，所以本研究克隆并构建了pMD-ApxⅠA、pMD-ApxⅡA、pMD-OmpD15载体，为序列分析及其后续研究奠定基础。ApxⅠA和ApxⅡA蛋白结构分析发现，ApxⅠA毒素蛋白α螺旋存在于1647aa，251269aa，344358aa，530546aa，β折叠分布较均匀，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为1185aa，407979aa；ApxⅡA毒素蛋白α螺旋存在于7090aa，172190aa，248275aa，207431aa，446469aa，812834aa，β折叠除在361406aa有较大折叠外其他折叠较小，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为418918aa。毒力因子Omp D15（Omp D15）是App一个重要的的表面抗原蛋白，蛋白结构分析表明其存在的抗原表位比较多，具有一定免疫原性，适合作为抗原抗体检测的重要靶标。因此本文以构建的pMD-D15载体为基础，构建了pET32a-OmpD15表达载体并在Rostta细胞中得到了表达，重组蛋白以包涵体的形式存在，通过梯度透析法获得纯化的重组蛋白。用初步纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以破碎的App作为抗原用ELISA方法检测抗血清，结果显示抗OmpD15血清能识别App，且3号免疫小鼠效价最高；Western-blot分析发现该重组蛋白可与抗App血清型5a血清中的抗体发生特异性反应，结果表明本实验所获得的D15重组蛋白具有良好的抗原性。用最小致死量App攻毒Balb/c小鼠，以D15重组蛋白作为抗原，ELISA方法监测小鼠体内抗体水平变化，发现攻毒后第三天即可在小鼠体内检测到OmpD15抗体的存在。通过OmpD15的原核表达、纯化及抗原性分析等的研究，为以表面抗原蛋白OmpD15开发亚单位疫苗、建立猪胸膜肺炎的ELISA诊断方法提供了理论基础及实验依据。
王伟[2]（2009）在《猪传染性胸膜肺炎的检测与诊断方法》文中提出
王伟[3]（2008）在《周口市猪传染性胸膜肺炎流行病学调查与防治试验》文中研究指明猪传染性胸膜肺炎是严重危害世界养猪业的重要细菌性传染病之一,在我国各地广泛流行,造成严重的经济损失。周口市是河南省重要的养猪基地之一,为了弄清猪传染性胸膜肺炎在周口市养猪业中的流行情况,并制定有效的综合防控措施,进行了如下两方面的研究。一是对周口所有县市区的畜牧兽医站与养猪协会和38个不同规模类型的猪场的问卷调查和实地走访并对5个未免疫猪场的844份猪血清抗体进行检测,分析猪传染性胸膜肺炎在周口市养猪业中的流行与感染状况。二是选取20头怀孕母猪和110头仔猪进行了疫苗免疫、药物防治等试验,研究周口市猪传染性胸膜肺炎的综合防制措施。1.通过对兽医站、养猪协会和养猪场（户）进行的调查,结果表明周口市2005～2007年养猪中呼吸道病发病起数占传染性疾病发生起数的23.71%;对38个不同猪场检测感染猪传染性胸膜肺炎的病猪数占饲养猪总数的比例在0～64.45%范围内。猪发生传染性胸膜肺炎主要在冬春季节。猪传染性胸膜肺炎发生于3周龄以下的有343头,占12.8%;3～6周龄的有621头,占23.2%;6～15周龄的有1385头,占51.7%;15周龄以上的有329头,占12.3%。发病猪主要是外来品种,并且与引种有很大关系。当地猪场（户）使用的猪传染性胸膜肺炎疫苗主要为三价灭活苗和自家苗,用疫苗进行免疫的占18.42%,免疫后保护率为85.71%。通过血清检测,周口市猪传染性胸膜肺炎抗体平均阳性率28.2%,说明该市猪传染性胸膜肺炎感染率较高。散养猪阳性率明显低于规模化猪场,可能是流通小,接触传染源机会少。高感染率的母猪群也是猪传染性胸膜肺炎流行的主要传染源。2.猪传染性胸膜肺炎三价灭活苗免疫试验结果显示怀孕母猪在产前一个月进行免疫接种,对其产下的仔猪在50日龄免疫一次,这些仔猪至肥猪阶段未见发病;而未免疫的对照组母猪及其所产下的未免疫仔猪（仔猪阶段至肥猪）出现呼吸道疾病症状比率达到54.4%（43/79）;另外,试验组免疫母猪本身没有出现呼吸道疾病症状;而对照组未免疫母猪本身出现呼吸道疾病症状的为10%。无论母猪所产下的仔猪或母猪本身出现呼吸道疾病症状比率,试验免疫组与对照不免疫组相比,差异都很显着（P＜0.01）。商品用仔猪30日龄接种猪传染性胸膜肺炎三价灭活苗,间隔一个月再接种1次,试验期间出现呼吸道疾病症状比率和死亡率分别为12%（3/25）和4%（1/25）,而对照不免疫组的出现呼吸道疾病症状比率和死亡率分别为44%（11/25）和12%（3/25）,差异极显着（P＜0.01）。仔猪在30日龄免疫猪传染性胸膜肺炎三价灭活苗后,60日龄、80日龄和100日龄的IHA抗体平均效价分别为1:38.5、1:24.3和1:18.8,而不免疫对照组相应日龄抗体效价分别为1:5.9、1:6.3和1:9.0,免疫猪抗体效价明显高于相应日龄的非免疫仔猪,差异均极显着（P＜0.01）。主动免疫仔猪对的预防有很好的效果。此外,药物防治试验结果表明复方氟苯尼考、氟苯尼考、利高霉素和盐酸头孢噻呋对猪传染性胸膜肺炎有较好的治疗效果,以复方氟苯尼考疗效最好。加强引种检疫工作,实行全进全出制度;全方位封闭猪场,保证生产区与外界环境有良好的隔离状态;保证饲料质量,提高猪体的抗病力;严格执行兽医卫生防疫和消毒制度等一系列综合防控措施来防制本病是切实可行的。
林荔雯[4]（2007）在《胸膜肺炎放线杆菌△apxIC/△apxIIC双基因缺失株的构建及其生物学特性和免疫原性的研究》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。预防和控制该病的主要措施是利用本地主要流行的血清型进行免疫接种。目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌引起的临床症状并降低死亡率，但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变，对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说，采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择，迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。与灭活疫苗和亚单位疫苗不同，APP的自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。而且弱毒活疫苗与传统疫苗相比有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点。因此通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已成为国内外疫苗研究的热点。构建APP突变株的传统方法存在很多缺陷。利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性，遗传背景不明晰；而通过传统的同源重组方法导致靶基因突变而获得的突变株最后含有抗性标记，由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。鉴于上述背景，本研究旨在以本地分离APP-1型菌株SLW01为亲本菌，缺失ApxI和ApxⅡ的激活因子apxⅠC和apxⅡC，构建不含抗性标记的APP双基因缺失株，从而发展一个能提供有效的交叉保护效率的无外源基因的安全、廉价的APP弱毒活疫苗菌株来预防和控制猪传染性胸膜肺炎的发生与流行，主要的研究内容包括：1．基因的克隆与重组自杀性质粒的构建参照GenBank中apxⅠapxⅡ基因的序列，从SLW01中扩增了apxⅠC和apxⅡC基因的上下游片段。将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因（SacB）的自杀性质粒pEMOC2上，构建缺失了385 bp的apxⅠC基因的重组自杀性质粒pEM△ⅠC和缺失了340 bp的apxⅡC基因的重组自杀性质粒pEM△ⅡC。2．接合转移与缺失株SLW02、SLW03的筛选鉴定以转化了重组自杀性质粒pEM△ⅠC的大肠杆菌β2155为供体菌，APP-1型菌株SLW01为受体菌进行接合转移。涂布氯霉素（Cm）抗性平皿并转印到含10％蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性（CmR）蔗糖敏感（Surs）的接合子，进一步用PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中。鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生。涂布含10％蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感（Cms）蔗糖抗性（SurR）的克隆，用进行PCR鉴定，以确定发生了第二次交换，重组自杀性质粒已经丢失。从而构建单基因缺失株SLW02。在单基因缺失株SLW02（△apxⅠC）的基础上，用转化了质粒pEM△ⅡC的大肠杆菌β2155作为供体菌，单基因缺失株SLW02（△apxⅠC）作为受体菌进行接合转移，用同样的方法构建双基因缺失株SLW03（△apxⅠC/△apxⅡC）。3．缺失株生物学特性的研究在绵羊血平皿上测定SLW01、SLW02和SLW03的溶血活性，结果显示SLW01具有极强的溶血活性，单基因缺失株SLW02（△apxⅠC）具有较弱的溶血活性，而双基因缺失株SLW03（△apxⅠC/AapxⅡC）则失去了溶血活性。用Western blot检测双缺失株SLW03和亲本菌SLW01中毒素的分泌情况，结果表明SLW01和SLW03都能够分泌毒素Ⅰ和毒素Ⅱ，说明apxⅠC和apxⅡC基因缺失后，SLW03仍然可以分泌无毒力的毒素。将缺失株和亲本株都进行活菌计数，绘制生长曲线，结果表明，缺失株SLW02和SLW03与亲本菌比较，生长速度没有明显的变化，说明apxⅠC和apxⅡC的缺失对SLW01的生长无影响。测定亲本菌和缺失菌在Balb/C小鼠体内的毒力，计算LD50的值。结果显示，与亲本菌SLW01比较，单基因缺失株SLW02（△apxⅠC）的毒力降低了约200倍，双基因缺失株SLW03（△apxⅠC/AapxⅡC）的毒力降低了约2000倍。4．双基因缺失株SLW03（△apxⅠC/AapxⅡC）对小鼠的免疫试验及攻毒保护试验将SLW03和1、2、7型三价灭活疫苗分别免疫Balb/C雌鼠，免疫2次，间隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分别检测了APP-1 IHA抗体和毒素ELISA抗体水平。结果表明，未免疫组的小鼠在整个试验过程血清抗体均呈阴性。结果显示，SLW03免疫小鼠后不但能够刺激机体产生较高的菌体抗体，而且能够产生较高的毒素抗体。灭活苗免疫组只能产生IHA抗体，不能产生毒素抗体。二免两周后，分别用低剂量(10 LD50)和高剂量(100 LD50)的同源血清型1型（SLW01）和异源血清型7型（XFNZ）攻毒。对于低剂量的攻毒，SLW03免疫组和灭活疫苗免疫组的小鼠都得到了100％的保护。对于高剂量的攻毒，SLW03对1型的保护率是100％，7型是75％。而灭活疫苗免疫组对1型和7型的高剂量的攻毒的保护率分别为25％和37.5％。所以弱毒菌株SLW03在小鼠中的免疫效力优于传统灭活疫苗。5．SLW03（△apxⅠC/△apxⅡC）对断奶仔猪的免疫试验及攻毒保护试验将SLW03分别通过肌肉免疫和鼻内免疫两种途径免疫断奶仔猪，免疫2次，间隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分别检测了APP-1 IHA抗体和毒素ELISA抗体水平。结果表明．两个免疫组的IHA抗体和ELISA抗体都显着高于对照组。但第28天，鼻内免疫组的ELISA抗体水平显着高于肌肉免疫组。二免两周后分别用同源血清型（1型）和异源血清型（9型）进行攻毒。结果表明，所有免疫组的猪都得到了100％的保护，对照组的猪并没有产生任何保护。免疫组的猪肺损伤指数和临床症状指数都显着低于未免疫组，相同血清型攻毒的鼻内免疫组的肺损伤指数显着低于肌肉免疫组。所以鼻内免疫途径比肌肉免疫途径好。
刘军发[5]（2005）在《胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。 该病由Pattison等于1957年首次报道，目前流行于世界各地。胸膜肺炎放线杆菌目前已经划分了15个血清型，利用本地主要流行的血清型免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防猪传染性胸膜肺炎的主要疫苗是灭活疫苗，对全国各地的流行情况进行调查，分离各地优势流行胸膜肺炎放线杆菌血清型，有助于有效的控制该病在我国的流行和爆发；但这种由优势血清型制备的灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率，不能阻止肺部病变和慢性感染，更不能对异型菌的感染提供有效的交叉保护，这就迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。 要研制有效的新型疫苗，就必须对该菌的致病机理进行研究，着就需要有效的研究工具，能够高效精确的对胸膜肺炎放线杆菌的致病机理进行研究，能够成功的克服胸膜肺炎放线杆菌比较强的修饰限制系统，从而为弱毒菌及其它新型疫苗的的研制打下坚实的基础。 胸膜肺炎放线杆菌目前发现的毒素共有四种，分别是毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和毒素Ⅳ，毒素毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构及功能已经基本上研究的比较清晰，但毒素Ⅳ的功能还没有完全研究清楚，特别是毒素Ⅳ的激活基因、作用方式、结构组成都还不是非常清晰。所以非常有必要对其功能进行更为彻底的研究。 鉴于上述背景，本研究从临床上分离了胸膜肺炎放线杆菌XT0404株，通过动物回归试验复制了猪的传染性胸膜肺炎；由于临床了检测的阳性率很高而细菌的分离率却很低，为了研究其原因，研究了链球菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、变形杆菌和大肠杆菌对胸膜肺炎放线杆菌血清学检测的干扰；为提高检测的准确度，建立了基于融合表达的外膜脂蛋白上的ELISA检测方法；同时改进了链霉菌中的PCR定向突变系统，并将改进后的PCR定向突变系统应用的到胸膜肺炎放线杆菌中来失活毒素Ⅳ的ORF1，主要研究内容包括： 1．XT0404株的分离鉴定及动物回归试验 利用TSA培养基，从湖南湘潭一猪场的病料上分离出了胸膜肺炎放线杆菌，经鉴定为血清型2，命名为XT0404，研究了该菌的药物敏感性及小白鼠的半数致死量；还利用该菌人工感染胸膜肺炎放线杆菌抗体阴性的猪，复制出了典型的传染性胸膜肺炎，观测了发病猪的临床症状，制备了病理切片及电镜切片来观测其病理变化；对耐过胸膜肺炎放线杆菌XT0404株感染的猪又进行了其它血清型的人工感染试验。 2．PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌中的建立 PCR定向突变系统是一个比较新的突变系统，主要是利用了PCR引物两端的缺
刁有祥[6]（2005）在《猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究》文中研究表明猪传染性胸膜肺炎（Porcine pleuropneumonia）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种高度传染性、致死性呼吸道病,以急性出血和慢性的纤维素性坏死性胸膜炎病变为主要特征。本病对各种猪均易感,在新引进猪群多呈急性爆发,其发病率和死亡率常在20%以上,最急性型的死亡率可高达80%～100%。该病在我国的发生呈逐年上升趋势,已成为危害养猪业最严重的疾病之一,给我国养猪业造成严重的经济损失。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计一对引物,扩增特异的650bp 核酸片段,建立了PCR 检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明,12 个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp 特异性的核酸片段,而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR 的最低检出限量为500 个放线杆菌,表明我们建立的PCR 检测方法敏感性高、特异性强。利用建立的PCR 检测方法对22 株从山东省不同地区分离的疑似放线杆菌菌株进行检测,结果14 株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明,病变部位不同,胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同,其中以扁桃体的检出率最高。该方法的建立为胸膜肺炎放线杆菌的诊断和鉴定提供了良好的方法。利用PCR 反应扩增出胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因650bp 的DNA,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与不同血清型的胸膜肺炎放线杆菌均能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌等细菌的核酸杂交均为阴性。对胸膜肺炎放线杆菌的最低检出限量为10×102个放线杆菌。对疑似胸膜肺炎放线杆菌感染病变组织DNA 检测结果表明,在扁桃体、鼻腔、气管、肺脏均可检测出胸膜肺炎放线杆菌,以扁桃体的检出率最高。该研究为猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。猪胸膜肺炎放线杆菌有12个血清型,不同国家和地区流行的APP 血清型不同,而不同血清型的APP 所产生的Apx 毒素不同。本研究从山东省不同地区采集的85 份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌（APP）的分离鉴定,采用凝集试验和PCR 方法对分离菌株进行血清型和Apx 毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20 株分属5 个血清型的胸膜肺炎放线杆菌。其中,血清7 型6
贝为成[7]（2005）在《猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究》文中提出猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种猪传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。 目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌感染猪引起的临床症状并降低死亡率,但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变,对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说,目前采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。 与灭活疫苗和亚单位疫苗不同,自然感染或试验感染能够诱导抗任何异源血清型的保护。这样,弱毒活疫苗也许是解决当前商品化疫苗不足的一种可行方法。构建胸膜肺炎放线杆菌突变株的传统方法存在很多缺陷。如利用化学或转座子介导的突变方法存在随机性,只适合于表型发生明显变化突变子的筛选,而不导致明显表型变化的突变株就不能够通过这些方法获得;而通过同源重组导致靶基因突变方法获得的突变株最后含有抗性标记,由于不符合生物安全性要求不能作为疫苗株用于疫苗生产。鉴于上述背景,本研究通过使用同源重组技术和负向选择方法（counterselection strategy）构建了不含抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因工程突变株,随后对其生物学特性进行了研究,主要研究内容包括: 1.外膜脂蛋白（omlA）基因启动子序列验证及作为启动子启动绿色荧光蛋白（GFP）基因的功能特性研究 由于胸膜肺炎放线杆菌血清1型（S4074）外膜脂蛋白基因转录起始位点已经得到证实,本研究以APP血清1型基因组DNA为模板,采用PCR扩增157 bp omlA基因启动子序列,序列测定证实无误后以正向的方式将其连接到不带启动子的绿色荧光蛋白基因（GFP）上游,构建质粒pMSKOGFP。通过电穿孔将质粒pMSKOGFP电转化到APP,在荧光显微镜下观察转化子发荧光的情况。结果含有质粒pMSKOGFP的APP转化子能够表达GFP,表明157 bp omlA基因启动子序列能够启动GFP基因在APP中表达。 2.sacB基因在APP中表达特性研究 枯草杆菌sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,表达sacB基因的革兰氏阴性细菌在含有5%蔗糖的培养基上不能生长。为了描述sacB基因在胸膜肺炎放线杆菌的表达特性,本研究采用PCR从质粒PGS284中扩增sacB基因,将它按照omlA基因启动子序列相同的方向克隆到质粒pMSK-omlA中获得重组质粒pMSKOS。同时,将单独
黄红亮[8]（2005）在《猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究》文中指出猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病。该病给集约化养殖业造成严重的经济损失。胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,目前已分离鉴定了15种血清型的APP,其毒力因子非常复杂,型间交叉免疫保护率低,因而该病的诊断与防制相当困难。APP的Apx外毒素是其主要的毒力因子。已证实了ApxⅠ、ApxⅡ与ApxⅢ的溶血活性及对巨噬细胞与嗜中性粒细胞的毒性作用,且ApxⅢ被证实有诱导细胞凋亡的活性,而ApxⅣ仅具有微弱的溶血活性,其它作用尚不清楚。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的控制。目前我国普遍应用的诊断方法为间接血凝试验（IHA）,该方法具有血清型特异性,不适合于对APP的普查。最近发现的ApxⅣ存在于所有血清型APP中,且具有种特异性,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。ApxⅣ的另一特点为体内诱导的毒素,而目前市面上用体外培养方法制备的疫苗中均不存在ApxⅣ,因此基于ApxⅣ的诊断方法可以鉴别诊断自然感染猪与疫苗免疫猪。为了建立有效的诊断方法及对APP外毒素作用机制进行深入研究提供特异性单克隆抗体,我们开展了以下工作: 1 apxⅣ基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达 依据APP血清1型的apxⅣ基因序列（GeneBank登陆号:AF021919）合成特异性引物,分三段从APP 0306SYML中分别扩增了apxⅣ基因的5′-端3.6Kb、5′-端2.5Kb和3′-端3.0Kb片断,分别克隆到pMD-18T,获得重组质粒pT apxⅣ3.6、pT apxⅣA5与pT apxⅣA3,并进行了测序:将apxⅣA5与apxⅣA3分别克隆到质粒pET-28b的T7启动子下游,构建了重组原核表达质粒pET apxⅣA5与pET apxⅣA3,分别用于表达ApxⅣ N-端与C-端蛋白,转化E. coli BL21（DE3）后经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白的分子量分别为90kDa与115kDa,分别命名为rApxⅣAN与rApxⅣAC,表达产物主要以包涵体形式存在,Western blot证实表达产物具有良好的反应原性。 2 鉴别诊断方法的建立 用大肠杆菌表达的重组蛋白rApxⅣAN建立了ApxⅣ-ELISA方法。用方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为2.97μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:80。通过检测53份猪传染性胸膜肺炎阴性血清,确定该方法的临界值为0.336。该方法的重复性良好。用该方法从副猪嗜血杆菌（HPS）、产毒素巴氏杆菌（DNT+Pm）、大肠杆菌（E. coli）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪衣原体（CP）的标准阳性血清及APP全菌灭活苗与类毒素菌苗免疫猪血清中检测不到ApxⅣ抗体,而从APP活菌感染的动物血清中能检测到ApxⅣ抗体,说明该方法不仅具有种特异性,只能用于APP感染的检测,还可以鉴别诊断全菌灭活疫苗或亚
刘建杰[9]（2004）在《猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究》文中认为猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养殖业造成了巨大的经济损失。该病急性以肺部广泛出血为特征，慢性以肺部局灶性坏死和胸膜炎由为特征。由Pattison等于1957年首次报道，目前遍及世界各地。免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防PCP的主要疫苗是灭活疫苗。这种灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率和慢性感染，不能阻止肿部病变，更不能对异型菌提供交叉保护，临床上迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。通过对胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究，证实分泌毒素为其最重要的毒力因子，同时也是其最重要的免疫原性因子，加有类毒素的灭活疫苗保护力大为提高。鉴于此，本研究开展了APP类毒素菌苗的研究，旨在提高灭活疫苗的保护效力。主要研究内容包括： 1．APP7型菌生长曲线的测定 通过对比国内外培养胸膜肺炎放线杆菌常用的三种培养基，发现胰蛋白酶大豆汤（TSB）最有利于APP的培养。利用浊度测定和细菌计数对APP 7型菌在TSB中的生长周期进行测定，发现其在7h～10h进入稳定期，世代间隔约为30min。而且，APP 7型菌在TSB中的生长具有明显的对数生长期（1h-4h），在对数生长期其浊度和活菌量具有对应关系，可用于APP的攻毒试验。 2．Apx Ⅰ结构基因在大肠杆菌中的高效表达 根据Apx Ⅰ的结构特点，我们构建了原核表达Apx Ⅰ的质粒pET-Ⅰ CA和pET-Ⅰ A，在IPTG诱导下两种质粒均获得高效表达，表达的融合蛋白分子量均为110kDa，主要以包涵体形式存在。其中质粒pET-Ⅰ CA表达的Apx Ⅰ具有很好的溶血活性，Western blot检测证实表达产物具有良好的反应原性。 3．Apx Ⅰ表达产物免疫原性的研究 将大肠杆菌中表达的包涵体进行纯化与复性，和等量弗氏不完全佐剂乳化后免疫小鼠，同时免疫的还有天然毒素作和不经过纯化与复性的粗提包涵体。用APP 10型10×LD50进行攻毒的结果显示，经过复性的表达产物和粗提包涵体都具有良好的免疫原性，可以取代天然毒素作为疫苗的添加成分。 4．基因工程类毒素菌苗对小鼠的保护效力研究 利用Apx Ⅰ、Apx Ⅱ和Apx Ⅲ的表达产物和我国最为流行的7型菌，和等量弗氏不完全佐剂乳化后制成类毒素菌苗免疫小鼠。利用天然毒素建立三种毒素的ELISA检测方法，对小鼠抗体的检测发现，二次免疫后三种毒素的抗体效价均显着升高。用5×LD50的1型菌和7型菌进行攻毒，免疫小鼠对1型菌的保护力为83.3华中农业大学博士学位论文%（10/l2），对7型菌的保护力为91.7%（11/12）。小鼠攻毒结果初步显示类毒素菌苗对于同型菌和异型菌都有很好的的保护效果，显示了良好的应用前景。5.类毒素菌苗对仔猪的效力研究 利用Apxl、ApxH和Apxln的表达产物和我国最为流行的7型菌，混合后和油佐剂乳化制成类毒素菌苗，间隔三周两次免疫断奶仔猪，同时设三价细菌灭活苗组和空白对照组。利用EUSA检测三种毒素的抗体，利用间接血凝检测7型菌抗体。二次免疫两周后用3.2xl夕cFu的APPI型进行气管攻毒。类毒素菌苗组具有较高的毒素抗体和间接血凝抗体，但三价细菌灭活苗只有间接血凝抗体。类毒素菌苗组攻毒后基本没有表现出临床症状，剖检肺部病变轻微;三价细菌灭活苗组攻毒后体温升高，剖检肺部病变明显;空白对照组临床症状明显，剖检呈现典型的胸膜肺炎病变。抗体检测和攻毒结果显示类毒素菌苗对于强毒APP的感染保护效果优于三价细菌灭活苗，能显着降低临床发病，减轻肺部病变，可以取代细菌灭活苗用于胸膜肺炎的免疫预防。攻毒结果还显示毒素抗体和保护力呈正相关。
陈小玲,杨旭夫,朱士盛[10]（2001）在《猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施》文中认为
二、猪传染性胸膜肺炎的诊断和防制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪传染性胸膜肺炎的诊断和防制（论文提纲范文）
（1）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 致病机理及其危害 |
| 1.4.1 致病机理 |
| 1.4.2 猪传染性胸膜肺炎的危害 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子 |
| 1.5.1 溶血毒素（Apx） |
| 1.5.2 外膜蛋白（Omp） |
| 1.5.3 荚膜多糖（CPS） |
| 1.5.4 脂多糖（LPS） |
| 1.5.5 其他毒力因子 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 病原学方法 |
| 1.6.2 血清型方法 |
| 1.6.3 分子学诊断方法 |
| 1.7 猪传染性胸膜肺炎的防制 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR 检测方法的建立、药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.1.1 培养基及菌株 |
| 2.1.2 酶类及主要试剂 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 App 基因组提取 |
| 2.1.5 PCR 扩增 |
| 2.1.6 App PCR 特异性检测 |
| 2.1.7 App PCR 敏感性检测 |
| 2.1.8 重复性试验 |
| 2.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.2.1 培养基及实验菌株 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 试验用药及药敏片制备 |
| 2.2.4 药品原液制备及保存 |
| 2.2.5 菌株的活化及菌液制备 |
| 2.2.6 药敏试验 |
| 2.2.7 MIC 的测定 |
| 2.2.8 结果判定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 App 标准菌株 PCR 扩增 |
| 2.3.2 App PCR 扩增特异性试验 |
| 2.3.3 App 的敏感性试验 |
| 2.3.4 重复性试验 |
| 2.3.5 建立的 PCR 方法对临床分离菌株的鉴定 |
| 2.3.6 药敏试验 |
| 2.3.7 MIC 的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.4.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 第三章 毒力因子 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 基因片段的克隆 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 仪器及试剂 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂配制 |
| 3.2 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 片段的扩增与克隆 |
| 3.2.1 基因组 DNA 的提取 |
| 3.2.2 基因的扩增 |
| 3.2.3 PCR 产物电泳及纯化 |
| 3.2.4 PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接 |
| 3.2.5 感受态细胞制备 |
| 3.2.6 连接产物的转化和阳性菌落的鉴定 |
| 3.2.7 阳性克隆质粒的提取 |
| 3.2.8 阳性克隆质粒序列测定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 ApxⅠC、ApxⅡA、 OmpD15 基因片段的克隆结果 |
| 3.4.2 测序结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 OmpD15 的原核表达及其抗原性分析 |
| 4.1 OmpD15 基因的原核表达 |
| 4.1.1 工具酶及主要试剂配制 |
| 4.1.2 OmpD15 的基因扩增 |
| 4.1.3 目的片段和载体的酶切、电泳及回收 |
| 4.1.4 基因 OmpD15 的连接与转化 |
| 4.1.5 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.1.6 pET32a-OmpD15 重组表达质粒的诱导表达 |
| 4.1.7 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.1.8 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.1.9 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.2 动物实验 |
| 4.2.1 实验材料及实验动物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.2.4 抗体的监测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 OmpD15 基因的扩增 |
| 4.3.2 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.3.3 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.3.4 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.3.5 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.3.6 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.3.7 抗体的监测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（3）周口市猪传染性胸膜肺炎流行病学调查与防治试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(ABBREVIATION) |
| 1.文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎的发现 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的病原学 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎的流行病学 |
| 1.4 猪传染性胸膜肺炎的检测与诊断方法 |
| 1.4.1 胸膜肺炎放线杆菌的致病性和毒力因子 |
| 1.4.2 猪传染性胸膜肺炎的临床症状及病理变化 |
| 1.4.3 猪传染性胸膜肺炎的实验室诊断及检测 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎的综合防制研究进展 |
| 2.研究的目的和意义 |
| 3.周口市猪传染性胸膜肺炎的流行病学调查 |
| 3.1 临床流行病学调查 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 调查主要内容 |
| 3.1.4 结果 |
| 3.1.5 分析与讨论 |
| 3.2 猪传染性胸膜肺炎血清流行病学调查 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 结果 |
| 3.2.3 讨论和分析 |
| 4.周口市猪传染性胸膜肺炎的综合防制研究 |
| 4.1 猪传染性胸膜肺炎三价灭活苗预防效果试验 |
| 4.1.1 材料与方法 |
| 4.1.2 结果 |
| 4.1.3 分析与讨论 |
| 4.2 猪传染性胸膜肺炎药物治疗效果试验 |
| 4.2.1 材料与方法 |
| 4.2.2 结果 |
| 4.2.3 分析与讨论 |
| 4.3 猪传染性胸膜肺炎的饲养管理防控措施 |
| 4.3.1 猪胸膜肺炎在饲管方面的可能致病原因 |
| 4.3.2 采取的应对预防措施 |
| 4.3.3 效果 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）胸膜肺炎放线杆菌△apxIC/△apxIIC双基因缺失株的构建及其生物学特性和免疫原性的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎的概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行现状及危害 |
| 1.1.3 猪传染性胸膜肺炎的发病机制 |
| 1.1.4 猪传染性胸膜肺炎的临床症状和病理变化 |
| 1.1.5 猪传染性胸膜肺炎的诊断 |
| 1.1.6 猪传染性胸膜肺炎的防制 |
| 1.2 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究进展 |
| 1.2.1 荚膜(capsule,CP) |
| 1.2.2 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) |
| 1.2.3 外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP) |
| 1.2.4 转铁结合蛋白(transferrin binding proteins,Tbp) |
| 1.2.5 酶类(enzymes) |
| 1.2.6 粘附因子(adherence factor) |
| 1.2.7 外毒素(RTX-toxins,Apx) |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 灭活苗 |
| 1.3.2 亚单位苗 |
| 1.3.3 ghosts疫苗 |
| 1.3.4 口服疫苗 |
| 1.3.5 弱毒活疫苗 |
| 1.4 APP突变株构建方法的研究进展 |
| 1.4.1 自然突变 |
| 1.4.2 人工化学诱变 |
| 1.4.3 分子生物学方法 |
| 1.5 负向选择标记:细菌遗传学和病原学研究中的新工具 |
| 1.5.1 负向选择标记在细菌遗传学和病原学研究的作用 |
| 1.5.2 负向选择标记的种类 |
| 1.5.3 负向选择标记的正负双向筛选系统的重组机制 |
| 第2章 研究的目的和意义 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和培养条件 |
| 3.1.2 酶、抗生素及试剂盒 |
| 3.1.3 培养基及抗生素的配制 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细菌的增殖及胸膜肺炎放线杆菌基因组的提取 |
| 3.2.2 PCR产物和酶切产物的回收与纯化 |
| 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.4 连接产物的转化 |
| 3.2.5 质粒的制备 |
| 3.2.6 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.7 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳 |
| 3.2.8 Western blot |
| 3.2.9 胸膜肺炎放线杆菌的PCR鉴定 |
| 3.2.10 胸膜肺炎放线杆菌SLW01株apxⅠC及apxⅡC基因前后臂片段的克隆与鉴定 |
| 3.2.11 重组自杀性质粒pEMΔⅠC、pEMΔAⅡC的构建 |
| 3.2.12 接合转移与胸膜肺炎放线杆菌双基因缺失株的构建 |
| 3.2.13 缺失菌株生物学特性的研究 |
| 3.2.14 缺失菌株对小鼠的毒力试验及LD_(50)的测定 |
| 3.2.15 缺失菌株对小鼠的免疫保护试验 |
| 3.2.16 血清的检测方法 |
| 3.2.17 缺失菌株对断奶仔猪的安全性试验 |
| 3.2.18 缺失菌株对断奶仔猪的免疫保护试验 |
| 3.2.19 统计分析 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 重组自杀性质粒pEMΔⅠC和pEMΔⅡC的构建 |
| 4.1.1 重组自杀性质粒pEMΔⅠC的构建 |
| 4.1.2 重组自杀性质粒pEMΔⅡC的构建 |
| 4.2 缺失株的筛选和鉴定 |
| 4.2.1 缺失株SLW02(ΔapxⅠC)的筛选和鉴定 |
| 4.2.2 缺失株SLW03(ΔapxⅠC/ΔapxⅡC)的筛选和鉴定 |
| 4.3 突变株生物学特性的研究 |
| 4.3.1 Western blot检测突变株毒素的分泌 |
| 4.3.2 突变株生长特性的研究 |
| 4.3.3 溶血活性的检测 |
| 4.4 缺失菌株对小鼠的毒力试验及LD_(50)的测定 |
| 4.5 双缺失株SLW03对BALB/C小鼠的免疫效力试验 |
| 4.5.1 双缺失株SLW03对Balb/C小鼠的保护试验 |
| 4.5.2 免疫小鼠的血清检测结果 |
| 4.6 双缺失株SLW03对断奶仔猪的安全性和免疫效力试验 |
| 4.6.1 双缺失株SLW03对断奶仔猪的安全性试验 |
| 4.6.2 双缺失株SLW03对断奶仔猪的保护试验 |
| 4.6.3 免疫仔猪血清检测结果 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 对亲本菌株的选择 |
| 5.2 负向筛选系统的选择 |
| 5.3 重组自杀性质粒的构建 |
| 5.4 双基因缺失株的筛选鉴定 |
| 5.5 双基因缺失株的毒力 |
| 5.6 双基因缺失株的免疫保护性试验 |
| 第6章 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 胸膜肺炎放线杆菌发现历史 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行现状及其危害 |
| 1.2.1 猪传染性胸膜肺炎的流行现状 |
| 1.2.2 猪传染性胸膜肺炎的危害 |
| 1.3 胸膜肺炎放线杆菌的检测和防制 |
| 1.3.1 胸膜肺炎放线杆菌的检测方法的研究进展 |
| 1.3.2 猪传染性胸膜肺炎的防制 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子研究进展 |
| 1.4.1 荚膜(capsule,CP) |
| 1.4.2 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) |
| 1.4.3 外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP) |
| 1.4.4 转铁结合蛋白(transferrin binding proteins,Tbp) |
| 1.4.5 酶类(Enzymes) |
| 1.4.6 粘附因子(adherence factor) |
| 1.4.7 外毒素(RTX-toxins,Apx) |
| 1.5 胸膜肺炎放线杆菌突变株构建方法的研究进展 |
| 1.5.1 自然突变 |
| 1.5.2 人工常规诱变 |
| 1.5.3 分子生物学方法 |
| 1.6 PCR定向突变系统的研究进展 |
| 1.6.1 PCR定向突变系统在酿酒酵母中的首次建立 |
| 1.6.2 PCR定向突变系统在假丝酵母中的改进 |
| 1.6.3 λ噬菌体Red重组酶在PCR定向突变系统中的应用 |
| 1.6.4 FLP重组酶在PCR定向突变系统中的应用 |
| 1.6.5 结合转移起始位点oriTRK2在PCR定向突变系统中的应用 |
| 1.6.6 PCR定向突变系统的优点 |
| 1.6.7 PCR定向突变系统的缺点及发展趋势 |
| 第2章 胸膜肺炎放线杆菌XT0404株的分离鉴定及耐药性研究 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验动物及病料 |
| 2.2.2 主要药品及试剂配制 |
| 2.2.3 细菌的分离和鉴定 |
| 2.2.4 分离株与血清型2参考菌株S1536的对比 |
| 2.2.5 药敏试验 |
| 2.2.6 动物回归试验 |
| 2.2.7 对耐过动物的人工感染试验 |
| 2.2.8 小鼠半数致死量(LD_(50))的确定(寇氏(Korbor)法) |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 细菌的分离与鉴定 |
| 2.3.2 分离株XT0404与参考菌株S1536的对比 |
| 2.3.3 分离株XT0404的药敏试验 |
| 2.3.4 动物回归试验 |
| 2.3.5 对耐过动物的人工感染试验 |
| 2.3.6 小鼠半数致死量(LD_(50))的测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统建立及应用该系统失活apx ⅣA的ORF1基因 |
| 3.1 研究目的和意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 质粒和菌株 |
| 3.2.2 主要药品及试剂配制 |
| 3.2.3 PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌中的建立 |
| 3.2.4 用PCR定向突变系统失活胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ的ORF1基因 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 中断盒的改进 |
| 3.3.2 apxⅣ基因的ORF1大片段的克隆 |
| 3.3.3 在大肠杆菌中用中断盒置换ORF1 |
| 3.3.4 FLP重组酶介导的中断盒的敲除 |
| 3.3.5 质粒pT-ORF1genoW△ORF1：：FRT：：cassette的构建 |
| 3.3.6 有选择性标记的胸膜肺炎放线杆菌突变体的产生 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 PCR定向突变系统的选择 |
| 3.4.2 中断盒的改进 |
| 3.4.3 同源重组方式的改进 |
| 3.4.4 供体菌的更换 |
| 3.4.5 胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ的OFR1的失活 |
| 3.4.6 改进后的PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌突变株构建中的优势 |
| 3.4.7 在胸膜肺炎放线杆菌建立的PCR定向突变系统的不足之处 |
| 第4章 胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白(OmlA)ELISA检测方法的建立 |
| 4.1 研究目的和意义 |
| 4.2.材料和方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒和试验动物 |
| 4.2.2 培养基及试剂 |
| 4.2.3 血清 |
| 4.2.4 检测抗原的制备 |
| 4.2.5 抗血清的制备 |
| 4.2.6 制备的抗血清与胸膜肺炎放线杆菌标准抗原交叉反应的测定 |
| 4.2.7 融合表达质粒的构建 |
| 4.2.8 融合蛋白的表达、纯化和鉴定 |
| 4.2.9 OmlA-ELISA方法的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 制备的抗血清的效价检测 |
| 4.3.2 抗血清与14种血清型胸膜肺炎放线杆菌标准抗原的凝集反应 |
| 4.3.3 omlA基因的克隆与表达 |
| 4.3.4 OmlA-ELISA方法的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前 言 |
| 1 胸膜肺炎放线杆菌病原分子生物学研究 |
| 2.猪胸膜肺炎流行病学研究 |
| 3.猪胸膜肺炎放线杆菌诊断方法的研究 |
| 4.猪传染性胸膜肺炎免疫预防研究 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR 诊断方法的建立与应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 PCR 引物 |
| 1.4 细菌培养基 |
| 1.5 病料 |
| 1.6 模板的制备 |
| 1.7 PCR 反应条件 |
| 1.8 PCR 扩增产物的检测 |
| 1.9 PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.9.1 PCR 产物的回收 |
| 1.9.2 PCR 产物的连接 |
| 1.9.3 BL21 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 1.9.4 连接产物的转化 |
| 1.9.5 质粒 DNA 的提取 |
| 1.9.6 质粒 DNA 的酶切鉴定 |
| 1.9.7 阳性克隆序列测定 |
| 1.10 PCR 检测的特异性试验 |
| 1.11 PCR 检测的敏感性试验 |
| 1.12 PCR 对分离菌株的检测 |
| 1.13 PCR 对感染猪病变组织的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 检测的特异性试验 |
| 2.2 PCR 检测的敏感性试验 |
| 2.3 PCR 产物的克隆和序列测定 |
| 2.4 PCR 对分离菌株的检测 |
| 2.5 PCR 对感染病变组织的检测 |
| 3 讨论 |
| 第三章 地高辛标记探针检测猪胸膜肺炎放线杆菌的研究与应用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 仪器和试剂 |
| 1.1.2 菌株 |
| 1.1.3 PCR 引物 |
| 1.1.4 细菌培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 ApxⅣ基因的克隆和序列测定 |
| 1.2.1.1 APP 基因组的提取及模板的制备 |
| 1.2.1.2 PCR 反应 |
| 1.2.1.3 PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.2.2 探针的标记 |
| 1.2.3 杂交检测程序 |
| 1.2.4 标记探针的特异性试验 |
| 1.2.5 标记探针的敏感性试验 |
| 1.2.6 标记探针对分离菌株的检测 |
| 1.2.7 标记探针对临床病例病变组织的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR 结果 |
| 2.2 PCR 产物的克隆和序列测定 |
| 2.3 标记探针的特异性试验 |
| 2.4 标记探针的敏感性试验 |
| 2.5 标记探针对分离菌株的检测 |
| 2.6 标记探针对感染病变组织的检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 仪器和试剂 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 细菌培养基 |
| 1.1.5 病料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病原的分离鉴定 |
| 1.2.2 生化特性 |
| 1.2.3 PCR 检测 |
| 1.2.4 药敏试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病理变化 |
| 2.2 培养特性 |
| 2.3 染色镜检 |
| 2.4 生化试验结果 |
| 2.5 PCR 鉴定结果 |
| 2.6 药敏试验结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与 APX 毒素型研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 仪器和试剂 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 不同血清型胸膜肺炎放线杆菌阳性血清 |
| 1.1.5 PCR 引物 |
| 1.1.6 细菌培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 血清型鉴定 |
| 1.2.2 Apx 毒素型鉴定 |
| 1.2.2.1 APP 基因组的提取及模板的制备 |
| 1.2.2.2 PCR 反应 |
| 1.2.2.3 PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.2.3 致病性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 血清型鉴定结果 |
| 2.2 分离菌株毒素型鉴定结果 |
| 2.3 分离菌株毒素基因测序结果 |
| 2.4 致病性试验结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 猪传染性胸膜肺炎病料中 PCV-2 和 PRRSV 的 PCR 检测 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病料 |
| 1.2 仪器和试剂 |
| 1.3 PCR 引物 |
| 1.4 猪传染性胸膜肺炎肺脏中 PCV-2 的 PCR 检测 |
| 1.4.1 样品总 DNA 的提取 |
| 1.4.2 PCR 检测 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎肺脏中 PRRSV 的 RT-PCR 检测 |
| 1.5.1 样品总 RNA 的提取 |
| 1.5.2 RT-PCR 检测 |
| 1.6 PCR 产物的克隆及序列测定 |
| 1.7 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 病料检测结果 |
| 2.2 PCR 产物的克隆和序列测定 |
| 2.3 不同地区猪传染性胸膜肺炎病料中 PCV-2、PRRSV 及 PCV-2、PRRSV 共感染的检测 |
| 2.4 不同地区临床健康猪组织中 PCV-2 和 PRRSV 的检测 |
| 2.5 数据处理结果 |
| 3 讨论 |
| 第七章 猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxIVA的克隆与表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 仪器和试剂 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 PCR 引物 |
| 1.4 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 基因的扩增和克隆 |
| 1.5 目的片断和载体的酶切、电泳及回收 |
| 1.5.1 目的片断的酶切 |
| 1.5.2 pGEX-5X-3 酶切 |
| 1.5.3 酶切产物的电泳及回收 |
| 1.6 DNA 的连接与转化 |
| 1.7 质粒 DNA 的提取与酶切 |
| 1.8 重组质粒的诱导表达 |
| 1.9 电泳样品制备 |
| 1.10 表达产物的 SDS-PAGE |
| 1.11 表达产物的 Western-blotting 检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 基因 PCR 扩增结果 |
| 2.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 2.3 血清3 型分离菌株 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 基因序列分析 |
| 2.4 血清3 型分离菌株 ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA 核酸片段的表达及检测 |
| 2.5 重组菌裂解产物 Western-blotting 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的主要论文 |
（7）猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎流行及其危害 |
| 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎流行现状 |
| 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎传播途径 |
| 1.1.3 猪传染性胸膜肺炎危害 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎病原学 |
| 1.2.1 胸膜肺炎放线杆菌分类、理化性质及生长特性 |
| 1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌抗原与血清型 |
| 1.2.3 胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子致病性及免疫原性研究进展 |
| 1.2.3.1 荚膜 |
| 1.2.3.2 脂多糖 |
| 1.2.3.3 外膜蛋白 |
| 1.2.3.4 转铁结合蛋白 |
| 1.2.3.5 蛋白酶 |
| 1.2.3.6 外毒素 |
| 1.2.3.7 黏附因子 |
| 1.2.4 胸膜肺炎放线杆菌致病机理 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎临床症状 |
| 1.4 猪传染性胸膜肺炎病理学特征 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎诊断方法研究进展 |
| 1.5.1 病原学诊断方法 |
| 1.5.2 血清学诊断方法 |
| 1.5.2.1 补体结合试验 |
| 1.5.2.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.5.2.3 凝集试验 |
| 1.5.2.4 环状沉淀试验 |
| 1.5.2.5 间接血凝试验 |
| 1.5.2.6 间接荧光抗体试验 |
| 1.5.2.7 乳胶凝集试验 |
| 1.5.2.8 免疫扩散试验 |
| 1.6 猪传染性胸膜肺炎防制 |
| 1.7 胸膜肺炎放线杆菌毒素研究进展 |
| 1.7.1 毒素名称和种类 |
| 1.7.2 毒素分泌、基因结构、表达与调控及其作用 |
| 1.8 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展 |
| 1.8.1 传统疫苗 |
| 1.8.1.1 灭活疫苗 |
| 1.8.1.2 亚单位疫苗 |
| 1.8.2 猪传染性胸膜肺炎新型疫苗研究现状 |
| 1.8.2.1 ghosts疫苗 |
| 1.8.2.2 口服疫苗 |
| 1.8.2.3 弱毒疫苗 |
| 1.9 负向选择方法 |
| 1.9.1 负向选择标记在细菌遗传学和病原学研究的作用 |
| 1.9.2 负向选择标记种类 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细菌菌株 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 主要药品和试剂 |
| 3.1.4 主要培养基和抗生素 |
| 3.1.5 本研究中所用的寡核苷酸引物 |
| 3.1.6 缓冲液 |
| 3.1.6.1 质粒提取用缓冲液 |
| 3.1.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液 |
| 3.1.6.3 Western blot缓冲液 |
| 3.1.6.4 ELISA缓冲液 |
| 3.1.6.5 Southern blot缓冲液 |
| 3.1.7 细菌基因组DNA提取试剂 |
| 3.1.8 大肠杆菌感受态制备用试剂 |
| 3.1.9 其它缓冲液及试剂 |
| 3.1.10 实验动物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细菌活化 |
| 3.2.2 细菌基因组DNA提取 |
| 3.2.3 PCR或酶切产物的回收与纯化 |
| 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.5 连接产物及质粒的转化 |
| 3.2.6 重组质粒快速鉴定 |
| 3.2.7 重组质粒酶切鉴定 |
| 3.2.8 质粒的小量制备 |
| 3.2.9 质粒的大量制备 |
| 3.2.10 连接产物及质粒的转化 |
| 3.2.11 胸膜肺炎放线杆菌电转化 |
| 3.2.12 负向选择 |
| 3.2.13 溶血性试验 |
| 3.2.14 生长特性试验 |
| 3.2.15 Southern-blot |
| 3.2.16 Western-blot |
| 3.2.17 细菌计数和半数致死量(LD_(50)) |
| 3.2.18 ApxⅡ-ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.18.1 天然毒素ApxⅡ的提取 |
| 3.2.18.2 ApxⅡ抗原最佳包被浓度的选择 |
| 3.2.18.3 ELISA阴阳性判定标准的确定 |
| 3.2.19 全菌抗体检测 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白(omlA)基因启动子序列鉴定 |
| 4.1.1 omlA启动子序列PCR扩增 |
| 4.1.2 绿色荧光蛋白(GFP)基因PCR扩增和重组质粒pSKOGFP构建 |
| 4.1.3 通过GFP基因表达对omlA基因启动子序列功能特性研究 |
| 4.2 枯草芽苞杆菌sacB基因在胸膜肺炎放线杆菌中表达特性研究 |
| 4.2.1 sacB基因的PCR扩增及中间转移质粒pSKOS的构建 |
| 4.2.2 编码果聚糖蔗糖酶sacB基因的表达特性研究 |
| 4.3 胸膜肺炎放线杆菌基因工程突变株HBC~-／GFP~+的构建 |
| 4.3.1 含缺失apxⅡCA基因的转移质粒pSK-xⅡCA~-／GSA~+的构建 |
| 4.3.1.1 胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxⅡCA基因DNA扩增与克隆 |
| 4.3.1.2 重组中间质粒pSK-XⅡCA~-／GFP~+的构建 |
| 4.3.1.3 氨苄青霉素基因的PCR扩增及中间质粒pSKOSA的构建 |
| 4.3.1.4 重组转移质粒pSK-xⅡCA~-／GSA~+的构建 |
| 4.3.2 重组转移质粒pSK-xⅡCA~-／GSA~+电转化及基因工程突变株HBC~-／GFP~+筛选 |
| 4.3.3 基因工程突变株HBC~-／GFP~+鉴定及生物学特性 |
| 4.3.3.1 PCR鉴定 |
| 4.3.3.2 Southern blot鉴定 |
| 4.3.3.3 Western blot检测 |
| 4.3.3.4 溶血性试验 |
| 4.3.3.5 生长特性试验 |
| 4.3.3.6 GFP基因的遗传稳定性试验 |
| 4.4 基因工程突变株HBC~-／GFP~+对Bab／C小鼠的安全性和免疫效力试验 |
| 4.4.1 基因工程突变株HBC~-／GFP~+对Bab／C小鼠的安全性试验 |
| 4.4.2 基因工程突变株HBC~-／GFP~+Bab／C小鼠的免疫效力试验 |
| 4.4.2.1 免疫Bab／c小鼠抗ApxⅡ的ELISA抗体检测 |
| 4.4.2.2 免疫Bab／c小鼠抗全菌的间接血凝抗体水平检测 |
| 4.4.2.3 小鼠攻毒后保护效力试验 |
| 4.5 基因工程突变株HBC~-／GFP~+对仔猪的安全性和免疫效力试验 |
| 4.5.1 仔猪的安全性试验 |
| 4.5.2 仔猪的免疫效力试验 |
| 4.5.2.1 试验分组、免疫途径和免疫剂量 |
| 4.5.2.2 免疫仔猪ApxⅡ-ELISA抗体检测 |
| 4.5.2.3 免疫仔猪间接血凝抗体检测 |
| 4.5.2.4 免疫仔猪攻毒保护效果试验 |
| 4.5.2.4.1 临床症状 |
| 4.5.2.4.2 体温变化 |
| 4.5.2.4.3 攻毒后的保护效果 |
| 4.5.2.4.4 攻毒后的肺部病变情况 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 负向选择方法的选择 |
| 5.2 外膜脂蛋白基因启动子序列功能和sacB基因表达特性研究 |
| 5.3 apxⅡCA基因的选择及克隆 |
| 5.4 重组转移质粒pSK-xⅡCA~-/GSA~+的构建 |
| 5.5 基因缺失疫苗株HBC~-/GFP~+的毒力 |
| 5.6 基因缺失疫苗株HBC~-/GFP~+诱导动物的免疫效力 |
| 5.7 基因缺失疫苗HBC~-/GFP~+诱导动物的免疫保护 |
| 5.7.1 仔猪的安全性试验 |
| 5.7.2 仔猪的安全性试验 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎的病原学 |
| 1.1.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现 |
| 1.1.2 胸膜肺炎放线杆菌的特征 |
| 1.1.3 胸膜肺炎放线杆菌的毒力 |
| 1.1.3.1 荚膜 |
| 1.1.3.2 脂多糖 |
| 1.1.3.3 外膜蛋白 |
| 1.1.3.4 溶血外毒素 |
| 1.1.3.5 转铁结合蛋白 |
| 1.1.3.6 酶类 |
| 1.1.3.7 菌毛和鞭毛 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行病学及危害 |
| 1.2.1 猪传染性胸膜肺炎的发生和传播 |
| 1.2.2 猪传染性胸膜肺炎的流行现状 |
| 1.2.3 猪传染性胸膜肺炎的危害 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎的临床症状 |
| 1.4 猪传染性胸膜肺炎的病理学 |
| 1.4.1 猪传染性胸膜肺炎的病理变化 |
| 1.4.2 猪传染性胸膜肺炎致病机理 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎的诊断 |
| 1.5.1 细菌分离鉴定 |
| 1.5.2 补体结合试验 |
| 1.5.3 酶联免疫吸附试验 |
| 1.5.4 凝集试验 |
| 1.5.5 间接血凝试验 |
| 1.5.6 间接荧光抗体试验 |
| 1.5.7 乳胶凝集试验 |
| 1.5.8 免疫扩散试验 |
| 1.5.9 沉淀试验 |
| 1.5.10 聚合酶链式反应 |
| 1.6 猪传染性胸膜肺炎的免疫预防 |
| 1.6.1 全细菌灭活疫苗 |
| 1.6.2 亚单位疫苗 |
| 1.6.3 弱毒疫苗 |
| 1.6.4 ghosts疫苗 |
| 1.6.5 口服疫苗 |
| 第2章 胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ基因的克隆、测序及表达 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 质粒及菌株 |
| 2.2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.2.1.3 抗生素的配制 |
| 2.2.1.4 细菌培养基的配制 |
| 2.2.1.5 质粒抽提与鉴定试剂的配制 |
| 2.2.1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液的配制 |
| 2.2.1.7 Western blot缓冲液的配制 |
| 2.2.1.8 其它试剂的配制 |
| 2.2.1.9 本研究中所用的寡核苷酸引物 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 细菌的增殖及基因组的提取 |
| 2.2.2.2 apxⅣ3.6片段的扩增 |
| 2.2.2.3 apxⅣA5、apxⅣA3片段的扩增 |
| 2.2.2.4 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.2.2.5 PCR产物的克隆与测序 |
| 2.2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制各(氯化钙法) |
| 2.2.2.7 连接产物及质粒的转化 |
| 2.2.2.8 质粒的提取 |
| 2.2.2.9 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.2.10 重组表达质粒pETapxⅣA5和pETapxⅣA3的构建 |
| 2.2.2.11 诱导表达 |
| 2.2.2.12 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2.2.13 Western blot |
| 2.2.2.14 APP感染小鼠血清的制备 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 apxⅣ3.6、apxⅣA5与apxⅣA3的克隆与测序 |
| 2.3.2 pETapxⅣA5与pETapxⅣA3表达载体的构建 |
| 2.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.4 表达产物的Western-blot检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 apxⅣ基因的克隆与表达 |
| 2.4.2 ApxⅣ的作用 |
| 2.4.3 ApxⅣ的应用 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法研究 |
| 3.1 研究目的和意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 主要试剂及材料 |
| 3.2.1.2 血清 |
| 3.2.1.3 包涵体提取用缓冲液的配制 |
| 3.2.1.4 ELISA及IHA缓冲液的配制 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 包涵体提取 |
| 3.2.2.2 不可溶性表达产物(包涵体)的溶解和复性 |
| 3.2.2.3 猪胸膜肺炎疫苗免疫血清的制备 |
| 3.2.2.4 ApxⅣ-ELISA操作程序 |
| 3.2.2.5 ApxⅣ-ELISA最佳抗原包被量和血清稀释度的选择 |
| 3.2.2.6 ApxⅣ-ELISA判断标准的确定 |
| 3.2.2.7 ApxⅣ-ELISA重复性检测 |
| 3.2.2.8 ApxⅣ-ELISA分析特异性检测 |
| 3.2.2.9 ApxⅣ-ELISA与间接血凝试验(IHA)对比试验 |
| 3.2.2.10 包被抗原保存期的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 rApxⅣAN抗原最佳包被量和血清最佳稀释度的确定 |
| 3.3.2 ApxⅣ-ELISA判断标准 |
| 3.3.3 ApxⅣ-ELISA重复性 |
| 3.3.4 ApxⅣ-ELISA分析特异性 |
| 3.3.5 ApxⅣ-ELISA与IHA对比试验 |
| 3.3.6 疫苗免疫动物和活菌感染动物中Apx毒素抗体的检测 |
| 3.3.7 包被抗原保存期的测定 |
| 3.3.8 猪传染性胸膜肺炎的血清学调查 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 细菌裂解 |
| 3.4.2 包涵体的溶解及复性 |
| 3.4.3 ApxⅣ-ELISA非特异性的消除 |
| 3.4.4 ApxⅣ-ELISA的种特异性 |
| 3.4.5 猪传染性胸膜肺炎的鉴别诊断 |
| 3.4.6 ApxⅣ-ELISA的临床应用 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究 |
| 4.1 研究目的意义 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 细胞、菌株、载体、动物 |
| 4.2.1.2 培养基及主要试剂 |
| 4.2.1.3 培养基及主要试剂的配制 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 单克隆抗体制备的技术路线 |
| 4.2.2.2 抗原的制备 |
| 4.2.2.3 动物免疫 |
| 4.2.2.4 SP2／O骨髓瘤细胞的活化 |
| 4.2.2.5 SP2／O骨髓瘤细胞的制备 |
| 4.2.2.6 免疫脾细胞的制备 |
| 4.2.2.7 饲养细胞的制备 |
| 4.2.2.8 细胞融合 |
| 4.2.2.9 间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清 |
| 4.2.2.10 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法) |
| 4.2.2.11 杂交瘤细胞染色体数的检测 |
| 4.2.2.12 单克隆抗体的生产和效价测定 |
| 4.2.2.13 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 4.2.2.14 单克隆抗体的结合活性及特异性鉴定 |
| 4.2.2.15 单克隆抗体识别表位分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 抗原的制备 |
| 4.3.2 细胞融合 |
| 4.3.3 杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.3.4 单克隆抗体的生产和效价测定 |
| 4.3.5 杂交瘤细胞染色体数的检测 |
| 4.3.6 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 4.3.7 ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ单克隆抗体的结合活性与特异性 |
| 4.3.8 ApxⅣ单克隆抗体的特异性 |
| 4.3.9 单克隆抗体识别表位分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 免疫用抗原 |
| 4.4.2 动物的免疫 |
| 4.4.3 细胞融合 |
| 4.4.4 杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.4.5 杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.4.6 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 4.4.7 污染和控制 |
| 4.4.8 ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ单克隆抗体的结合活性与特异性 |
| 4.4.9 ApxⅣ单克隆抗体的特异性 |
| 4.4.10 ApxⅣ单克隆抗体识别表位分析 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎的流行现状及其危害 |
| 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎的流行现状 |
| 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎的危害 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的病原学 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎的流行病学 |
| 1.3.1 疾病的发生和传播 |
| 1.3.2 临床症状 |
| 1.3.3 病理变化 |
| 1.3.4 诊断 |
| 1.3.5 治疗 |
| 1.3.6 预防 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌的诊断方法研究进展 |
| 1.4.1 血清学诊断方法 |
| 1.4.2 病原学诊断方法 |
| 1.5 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子研究进展 |
| 1.6 胸膜肺炎疫苗研究进展 |
| 第2章 胸膜肺炎放线杆菌生长培养基的选择及生长曲线的测定 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 细菌的活化 |
| 2.2.2.2 三种培养基生长情况的比较 |
| 2.2.2.3 TSB培养基生长曲线的测定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ的克隆、表达及中间载体pSK-Ⅰ CKA的构建 |
| 3.1 研究目的和意义 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 细菌的增殖及基因组的提取 |
| 3.2.2.2 apx Ⅰ CA及apx Ⅰ A片段的扩增 |
| 3.2.2.3 apx Ⅰ XC、Kan及apx Ⅰ DA片段的扩增 |
| 3.2.2.4 PCR产物的电泳检测 |
| 3.2.2.5 PCR产物的回收与纯化 |
| 3.2.2.6 PCR产物的克隆 |
| 3.2.2.7 感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.2.8 连接产物的转化 |
| 3.2.2.9 质粒的提取 |
| 3.2.2.10 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.2.11 apx Ⅰ CA的测序 |
| 3.2.2.12 中间质粒pSK Ⅰ CKA构建及序列测定 |
| 3.2.2.13 重组表达质粒pET-Ⅰ CA和pET-Ⅰ A的构建 |
| 3.2.2.14 诱导表达 |
| 3.2.2.15 表达产物的SDS-PAGE检测和Western-blot分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ免疫原性的研究 |
| 4.1 研究目的和意义 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 间接ELISA操作步骤 |
| 4.2.2.2 毒素基因在BL-21中的诱导表达及包涵体的制备 |
| 4.2.2.3 天然Apx Ⅰ的提取 |
| 4.2.2.4 毒素Ⅰ溶血活性的测定 |
| 4.2.2.5 疫苗的制备及免疫 |
| 4.2.2.6 10型APP半数致死量(LD_(50))的确定及攻毒剂量 |
| 4.2.2.7 Apx Ⅰ ELISA检测方法的建立及抗体的检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究 |
| 5.1 研究目的和意义 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.2.2.1 三种毒素基因在BL-21中的诱导表达及包涵体的制备 |
| 5.2.2.2 油乳剂类毒素疫苗的制备 |
| 5.2.2.3 免疫小鼠类毒素菌苗的制备及免疫 |
| 5.2.2.4 抗体的检测 |
| 5.2.2.5 攻毒剂量的确定 |
| 5.2.2.6 类毒素菌苗的安全性试验 |
| 5.2.2.7 类毒素菌苗对仔猪效力的观测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 5.6 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施（论文提纲范文）
| 1 猪传染性胸膜肺炎的流行现状 |
| 2 国内外防制App的新对策和新技术 |
| 3 国内外研究动态 |
| 4 对App防治工作的经验体会 |
| 5 2000年App发生趋势预测及防制建议 |
四、猪传染性胸膜肺炎的诊断和防制（论文参考文献）
- [1]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析[D]. 朱岩昆. 河南师范大学, 2013(S2)
- [2]猪传染性胸膜肺炎的检测与诊断方法[J]. 王伟. 上海畜牧兽医通讯, 2009(02)
- [3]周口市猪传染性胸膜肺炎流行病学调查与防治试验[D]. 王伟. 华中农业大学, 2008(10)
- [4]胸膜肺炎放线杆菌△apxIC/△apxIIC双基因缺失株的构建及其生物学特性和免疫原性的研究[D]. 林荔雯. 华中农业大学, 2007(02)
- [5]胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立[D]. 刘军发. 华中农业大学, 2005(02)
- [6]猪胸膜肺炎放线杆菌分子流行病学研究[D]. 刁有祥. 山东农业大学, 2005(07)
- [7]猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究[D]. 贝为成. 华中农业大学, 2005(03)
- [8]猪传染性胸膜肺炎鉴别诊断方法和胸膜肺炎放线杆菌外毒素单克隆抗体研究[D]. 黄红亮. 华中农业大学, 2005(03)
- [9]猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究[D]. 刘建杰. 华中农业大学, 2004(01)
- [10]猪传染性胸膜肺炎的流行现状和防制措施[J]. 陈小玲,杨旭夫,朱士盛. 中国兽医杂志, 2001(07)
标签：肺炎论文; 猪传染性胸膜肺炎论文; 胸膜论文; 肺炎疫苗论文; 抗原抗体论文;