一、Recombinant human zona pellucida proteins ZP1, ZP2 and ZP3 co-expressed in a human cell line（论文文献综述）
相立峰[1]（2020）在《人胚胎原肠前动态发育研究》文中研究表明伴随工业水平的进步和生活水平的提高,不良的生活环境、不健康的饮食习惯和日益增加的生存压力等导致育龄夫妇的精子与卵子质量急速下降,不孕不育已成为威胁生殖健康的一个重要问题。当胚胎发育至第7天,人胚胎需植入母体的子宫中才能继续存活和发育。这个阶段胚胎在子宫体内发生的变化以及导致这些变化的关键细胞和分子事件,由于材料的无法获得以及缺乏相应技术导致这些问题仍处在黑匣子状态。胚胎植入失败以及在此阶段的发育异常是导致早期流产的主要原因。因此,对人胚胎原肠前发育过程的研究将为我们理解生命起源、探索早期胚胎发育动态变化过程和分子调控机制提供重要的理论依据。2016年的两篇报道在小鼠胚胎体外培养的基础上,建立了着床后人胚胎体外2D培养体系,该体系能够将胚胎在体外培养至13天,并观察到一些谱系分离的现象。然而2D条件下胚胎存在一些重要缺陷,如2D培养的胚胎是扁平的,缺乏体内3D的拓扑结构;虽然2D培养胚胎的滋养外胚层12天后仍在继续存活,但整个胚胎结构发生了坍塌和出现了发育的紊乱,导致很多细胞类型（羊膜上皮）、腔（羊膜腔、卵黄囊）和结构（基底膜、前后轴、原条）无法在2D培养的胚胎中清楚地观测到。因此,这些缺陷限制了2D体系很难真正模拟体内胚胎的发育,无法揭示胚胎在该阶段的发育事件和机制。为了克服以上这些缺陷,我们开展了本论文的研究。我们在获得严格的伦理允许和病人知情同意的条件下,利用临床上捐献的胚胎,通过改善培养基和培养方法,开发了一个三维（3D）人囊胚培养体系,并采用该体系首次将人囊胚在3D条件下培养到原条原基阶段。这些3D胚胎能高度地模拟体内胚胎的发育,经历不同形态的发育并自发组装成2D条件下无法产生的3D结构,包括胚胎双层胚盘、羊膜（amnion）、基底膜（basal membrane）、初级和灵长类独特的次级卵黄囊、前后轴和原条前体。利用这个体系,我们揭示了人原肠前胚胎的关键发育事件:（1）通过单细胞转录表达谱的分析,揭示了上胚层细胞、下胚层细胞和滋养层细胞谱系分化和发育的动态和分子调控网络。（2）羊膜上皮细胞（AME）是上胚层细胞分离出来的第一类细胞系,不同于啮齿类动物,人AME发生于原条形成之前,但其特性和分子机制不清楚。我们发现:与上胚层细胞相比,AME显着地下调多能性基因,其形成与基底膜的缺失显着相关,并有独特的分子表达谱。（3）首次阐明细胞滋养层（cytotrophoblast）、绒毛外细胞滋养层（extravillous cytotrophoblast）和合胞体滋养细胞（syncytiotrophoblast）在胚胎着床后的分化以及引起分化的信号和转录因子,揭示了绒毛外细胞滋养层在早期胚胎中不同于中、后期胎盘的功能。（4）揭示了上胚层细胞（PSCs,多能干细胞）着床后将很快从naive到primed状态的转变。PSCs从着床至第14天期间保持相对的稳定状态,而其发育和转化是由不同的多能因子协调作用所决定的。（5）通过人和非人灵长类胚胎的转录组分析,发现非人灵长类和人上胚层细胞在代谢上具有明显差异,而在维持干细胞多能性以及发育的关键分子和信号通路上具有保守性。本论文利用独创的人胚胎体外3D培养体系详细阐述了胚胎在发育过程中谱系的分离、羊膜腔的形成、羊膜上皮的分离、卵黄囊的形成、胚胎极性的产生和原条的形成等发育学事件。本论文回答了EPI多能性的维持和转化、羊膜上皮的形成机制、滋养层分化发育的机制等科学问题。本研究成果为胚胎的早期发育和干细胞的相关研究提供了新的模型,为组织再生和器官再生提供了研究的理论基础,为研究胚胎因素的着床失败和早期流产提供了理论支持,为不孕症治疗和辅助生殖技术中现存问题的解决提供了研究思路和研究方向。
王宁[2]（2019）在《人多能干细胞向雌性生殖细胞诱导分化的研究》文中提出在体外条件下,研究人雌性生殖细胞产生和成熟的诱导方法,有助于进一步解析生殖细胞发育和卵子发生机制。已有文献报道,在特定诱导条件下,人多能干细胞能够在体外诱导分化为特定的细胞类型和类器官。但是,通过体外诱导得到人卵泡结构和成熟的卵子仍是当前生殖领域的巨大挑战。因此,本研究利用人胚胎多能干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）和人诱导多能干细胞（induced Pluripotent stem cells,iPSCs）,通过添加生长因子（hLIF、hSCF、EGF、BMP4）和牛卵泡液（bovine Follicle Fluid,bFF）的三步诱导方法（三步法）,体外实现了人多能干细胞经原始生殖细胞样细胞（Primordial germ cell-like cells,PGCLCs）阶段,向卵泡样结构（Follicle-like structures,FLs）分化完成减数分裂的过程,并获得了人卵母样细胞（Oocyte-like cells,OLCs）。具体研究内容和结果如下:1.人多能干细胞的培养及诱导多能干细胞向原始生殖样细胞的诱导分化采用无饲养层培养体系,对人多能干细胞iPSC系TAC153（46,XX）和ESC系H9（46,XX）进行培养。经质量检测,hiPSCs和hESCs多能性和自我更新能力良好。第一阶段,利用原始生殖细胞诱导培养液（primordial germ cell medium,PGC-m）,对hiPSCs进行10天的诱导,使其定向分化为PGCLCs,获得诱导的原始生殖细胞（induced PGCs,iPGCs）。在诱导过程中,iPGCs形态逐渐接近于PGCs,并表达原始生殖细胞特异性基因。全转录组测序结果显示,iPGCs中卵泡发育相关基因出现上调。2.原始生殖样细胞向卵泡样结构的诱导分化在第二阶段,将iPGCs置于卵泡诱导培养液（Follicle-like cell medium,FLC-m）继续分化5天。在这一阶段,iPGCs聚集体中形成了诱导的卵泡样结构（induced FLs,iFLs）,即原始卵母细胞样和颗粒样细胞。且能够检测到减数分裂基因SCP3和颗粒细胞特异性基因FOXL2的定位表达。3.卵泡样结构向卵母样细胞诱导分化以及三步法诱导体系验证在第三阶段,将收集的iFLs在卵母细胞诱导培养液（Oocyte-like cell medium,OLC-m）中继续诱导10-15天。在诱导过程中,能发现直径50-150μm大小不同的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-oocyte complexes,COCs）和OLCs等。并且检测到了透明带基因ZP2和ZP3的表达。诱导后期,能观察到具有第一极体和透明带的OLCs。此外,本研究利用hESC系H9对三步法体系进行了验证。有趣的是,部分OLCs出现自发发育至多细胞结构的现象,形态类似于植入前胚胎,且呈DDX4和c-KIT阳性。综上所述,本研究建立了hPSCs体外分化为OLCs的三步法体系,为研究人类雌性生殖细胞的发生机理提供了良好的模型。
胡文萍,汤继顺,张壮彪,喇永富,刘秋月,狄冉,王翔宇,储明星[3]（2019）在《Izumo1和Juno在哺乳动物受精过程中的研究进展》文中指出受精是哺乳动物一个精确而且高度协调的生理过程。精子与卵子的融合是其中最关键的一步。两个高度分化的单倍体生殖细胞,精子和卵子,通过融合形成一个全新的受精卵,并发育为胚胎。Izumo1和Juno是目前发现的第一个精子和卵子质膜上的配体-受体蛋白对,它们的相互作用是精卵识别所必须的。本文综述了这两种重要蛋白的发现及它们在精卵融合过程中的相互作用,同时阐述了哺乳动物受精过程的最新研究进展。
尚璇[4]（2019）在《睾丸特异性丝氨酸蛋白酶PRSS55在雄性生殖中的作用及分子机制研究》文中指出PRSS（蛋白酶/丝氨酸）家族成员编码丝氨酸蛋白酶,在睾丸特异性表达的成员多数定位在雄性生殖细胞质膜,在雄性生殖中发挥着重要作用。PRSS41、PRSS42和PRSS43通过调控精母细胞减数分裂参与小鼠睾丸发育和精子发生;精子质膜GPI锚定蛋白PRSS21缺失导致精子体外穿过透明带能力下降;PRSS37在小鼠中通过影响精子在雌性生殖道内迁移和体外精卵识别/结合参与雄性生殖;PRSS37在人类精子中的低表达与不明原因男性不育直接相关。利用基因打靶小鼠模型是研究未知基因生物学功能的重要有效手段。本课题组利用基因敲除小鼠,对Prss55基因在小鼠生殖过程中的作用进行研究。PRSS55,又名testis serine protease（T-SP1）,编码睾丸特异性胰酶样的丝氨酸蛋白酶。Prss55在小鼠中是一个功能未知的基因,组织表达谱分析表明Prss55在睾丸特异性表达。进一步分析发现,Prss55基因在小鼠出生后28天开始出现转录和翻译活动,即在延长期精子中开始表达。PRSS55在雄性生殖细胞中是一个GPI锚定蛋白,且具有丝氨酸蛋白酶的活性。Prss55敲除小鼠雄鼠不育,但睾丸发育、精子发生、精子数量、精子活力、顶体反应、顶体酶活性以及交配能力都不受影响。体内受精实验表明,Prss55-/-精子体内受精率与野生小鼠相比显着下降（4.1%vs 82.9%）,同时伴随着在雌性生殖道内UTJ结迁移障碍。体外受精实验表明精卵识别结合障碍,但体外受精率不受影响。因此,精子雌性体内UTJ结迁移障碍是导致Prss55-/-雄鼠不育的主要原因。进一步分析发现,ADAM3成熟体在Prss55-/-精子中完全消失,而其在睾丸中的前体不受影响,并且PRSS55与ADAM3在睾丸组织未检测到直接的相互作用。ADAM家族编码生殖细胞表面蛋白,参与精子与雌性生殖道内细胞外基质复合物的相互作用。目前有15种基因,包括Calr3-/-,Clgn-/-,Ace-/-,Adam6-/-,Adam3-/-,Adam2-/-,Adam1a-/-,Tpst2-/-,Pdilt-/-,Pmis2-/-,Prss37-/-,Tex101-/-,Ly6k-/-,RNase10-/-,Pgap1-/-,敲除小鼠精子雌性生殖道内UTJ结迁移障碍并伴随着ADAM3成熟体消失或异位。可见,ADAM3是调控精子穿过UTJ结的靶点分子。PRSS55作为ADAM3的一个新的调控因子,通过参与ADAM3的加工成熟影响小鼠雄性生殖。综上所述,本研究证实了Prss55基因在雄性生殖过程中发挥着不可或缺的作用。PRSS55蛋白结构和生物学功能的阐明加深了对精子表面GPI锚定蛋白的功能认知,拓展了丝氨酸蛋白酶家族成员在雄性生殖过程中的作用范围。Prss55-/-雄鼠的表型符合临床上不明原因不育（UMI）患者病理特征。PRSS55蛋白序列在不同物种间高度保守,PRSS55在人类睾丸组织特异性表达,其在人类生殖中可能发挥相似的功能。因此,对PRSS55功能和分子机制的探索将为临床上UMI患者提供诊断和治疗的潜在靶点,同时也为新型避孕药的研发提供理论基础。
杨新瑞[5]（2019）在《重组人卵膜糖蛋白2与精子体外结合的研究及四个DNA遗传标记的多态性调查》文中提出研究目的:哺乳动物卵膜糖蛋白（zona pellucida,ZP）是由卵母细胞及颗粒细胞分泌的一种糖蛋白基质,与精子之间存在特定分子上的受体配体识别作用。人ZP分为ZP1,ZP2,ZP3和ZP4,其中ZP2是参与精卵识别过程的二级受体。目前大多数生殖领域方面的研究多集中在ZP2蛋白与获能精子结合的探究上,对与未获能精子结合情况少有研究,且结合环境多比较单一。本实验利用体外受体和配体存在的亲和作用,探讨真核系统表达的重组hZP2蛋白在不同的体外结合环境中与未获能精子的结合情况,期望达到重组蛋白与精子的高效结合,进行法医学方面的应用,为本课题组后续研究中对法医学混合斑中精子的提取及个人识别提供基础。调查中国北方人群DLG2,RBMS3和NAP5基因的三个单核苷酸多态性（SNPs）（rs7479949,rs2053288和rs12612615）以及NAP5基因的一个插入缺失标记（InDel）（rs778533301）频率分布,为法医学个人识别和亲权鉴定提供新的遗传标记,同时探讨其与帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的关联性。研究方法:构建pCDNA3.1（+）-ZP2真核重组质粒,转染HEK293细胞表达出重组hZP2蛋白;利用Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析纯化出目的蛋白;利用ELISA对纯化后的重组hZP2蛋白进行鉴定;通过改变精子数,Ca2+浓度及重组hZP2蛋白与精子的孵育时间三种结合条件,进行纯化后的重组hZP2蛋白与未获能精子体外结合实验,通过免疫荧光技术检测重组hZP2蛋白与精子共定位,采取抑制实验探究重组hZP2蛋白与精子的结合情况。本研究以332名中国北方地区汉族健康个体和331名PD患者为研究对象,借助聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析技术,对上述三个SNPs和一个InDel位点进行遗传多态性调查,计算遗传学和法医学相关参数,并将获得的对照及病例组数据进行相关统计分析。结果:1、在真核系统HEK293细胞中成功表达重组hZP2蛋白,纯化得到重组hZP2目的蛋白。2、免疫荧光结果未发现重组hZP2蛋白在体外与未获能精子结合,抑制实验结果显示重组hZP2蛋白与未获能精子在结合前和结合后的曲线相近,蛋白与精子结合现象不明显;通过改变精子数,Ca2+浓度及重组hZP2蛋白与精子的孵育时间三种结合条件,未发现未获能精子与重组hZP2蛋白的结合效率与这三种条件的改变存在相关性。3、PCR-RFLP法成功对三个SNPs及一个InDel位点进行了基因型分型,除了InDel位点未观察到多态性外,其它三个SNPs位点在PD患者和对照组均显示出明显的遗传多态性分布,三个位点的DP值都大于0.5,符合较高鉴别能力的遗传标记,但比较基因型频率和等位基因频率两组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1、成功得到真核系统表达的重组hZP2蛋白。2、改变不同体外结合条件后,未发现真核表达的重组hZP2蛋白与未获能精子有结合现象。3、在中国北方地区汉族群体中DLG2基因的rs7479949,RBMS3基因的rs2053288以及NAP5基因的rs12612615和rs778533301位点基因频率分布与PD无关联性,且在法医学中属于较高鉴别能力的遗传标记。
于裴夫[6]（2018）在《人卵膜糖蛋白4的表达、抗体的制备及与精子体外结合的研究》文中进行了进一步梳理目的:透明带（zona pellucida,ZP）是围绕在哺乳动物卵母细胞周围的一层包外基质,在精卵结合、诱导顶体反应及阻止多精入卵中起着关键作用。人的透明带主要由4种卵膜糖蛋白（ZPl、ZP2、ZP3和ZP4）组成,其中ZP4在精卵特异性识别与结合、防止多精入卵、诱发顶体反应、保证ZP完整性以及保护卵细胞和着床前的胚胎等发挥重要作用。人类ZP4因其在精卵结合的起始过程和诱导精子顶体反应中起着重要的作用,被定义为结合精子的起始受体。然而,尚未有关于原核细胞中表达的hZP4与非获能精子于体外结合的相关研究报道,同时国内对于制备抗hZP4的多克隆抗体的研究也较少。因此,依据ZP4和精子的生物学特点及两者组成的配体-受体相互作用特性,本研究通过原核细胞表达重组人ZP4,探究ZP4与未获能精子的体外结合效率,为本课题组的后续研究中对法医学混合斑的鉴定提供基础;本研究也将利用纯化的重组人ZP4免疫新西兰兔,制备抗血清,为后续研究提供实验基础。研究方法:构建pGEX-4T-1-ZP4-His原核表达质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达GST-ZP4-His融合蛋白,利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析纯化GST-ZP4-His融合蛋白,纯化后的ZP4蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,分别采用ELISA和Western blot检测血清效价及特异性。纯化的ZP4融合蛋白与未获能精子进行体外结合,荧光显微镜下观察ZP4与精子共定位,利用抑制实验验证ZP4与精子的结合效率。结果:1、在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达GST-ZP4-His融合蛋白,纯化得到重组hZP4目的蛋白。2、以该融合蛋白免疫新西兰兔获得粗制多克隆抗ZP4的抗血清。3、免疫荧光结果未发现原核表达的重组人ZP4蛋白在体外与未获能精子结合,抑制实验结果显示ZP4蛋白与未获能精子在结合前和结合后的曲线相近,差别较小。结论:1、成功获得原核表达的GST-ZP4-His融合蛋白。2、制备的兔抗人ZP4抗血清效价较高,但特异性较差。3、未发现原核表达的重组人ZP4蛋白与未获能精子在体外结合。
朱文清[7]（2018）在《重组人卵膜糖蛋白3的表达、抗体制备及与精子体外结合的研究》文中认为研究目的:哺乳动物配子间的识别始于卵透明带（zona pellucida,ZP）与精子之间的结合。人类的ZP主要由四种糖蛋白组成,分别是ZP1,ZP2,ZP3和ZP4。其中,人卵膜糖蛋白3（h ZP3）作为精卵结合的初始受体,在诱导精子顶体反应的同时也表现出与精子较强的结合能力。由于天然h ZP3较难获取,目前大多数研究集中在重组h ZP3体外与获能精子的结合,但尚未有关于原核表达h ZP3体外与未获能精子结合的相关研究报道,同时,国内针对抗h ZP3全长特异性抗体的研究较少。因此,依据精卵结合的特性以及精卵受体配体间的相互作用,本研究欲通过原核表达的重组h ZP3体外与未获能精子的结合,为本课题组后续在法医学领域从混合斑中提取精子细胞提供应用基础;以及利用纯化后的重组h ZP3为抗原,制备抗h ZP3抗血清,为后续实验提供材料基础。研究方法:利用构建的p GEX-4T-1-h ZP3-His原核表达质粒,通过大肠杆菌诱导表达出h ZP3-GST-His融合蛋白;利用谷胱甘肽琼脂糖树脂（GST Resin）亲和层析纯化该蛋白。利用纯化后的h ZP3免疫新西兰白兔制备抗血清,分别采用ELISA和蛋白免疫印迹分析检测兔抗血清效价及特异性。纯化后的h ZP3与未获能精子体外结合,通过免疫荧光技术检测h ZP3与精子共定位,利用抑制实验检测h ZP3与精子的结合效率。实验结果:1、在大肠杆菌中成功表达出h ZP3-GST-His融合蛋白;纯化得到分子质量约为73 k Da的特异性的重组h ZP3;2、以纯化后重组h ZP3免疫新西兰白兔获得抗h ZP3的高效价粗制多克隆抗血清,但特异性较差;3、免疫荧光结果未发现原核表达的重组h ZP3在体外与未获能精子进行结合;抑制实验结果显示重组h ZP3与精子呈现出一定程度的结合趋势。结论:成功表达并纯化出重组hZP3;制备的兔抗hZP3的抗血清抗体效价较高,但特异性较差;重组h ZP3在体外与未获能人精子显示出较弱的结合。
陈泰来[8]（2017）在《ZP3基因突变引起空卵泡综合征导致女性不孕》文中研究表明第一章空卵泡综合征致病突变的定位研究研究目的:空卵泡综合征（EFS）是指在促排卵周期或自然周期中,超声监测下卵泡大小、数目及血清雌激素水平均在正常范围,但经反复抽吸、冲洗均无法获得卵母细胞。目前临床上对于反复发生EFS的患者尚无有效助孕方法,为获得妊娠,这部分不孕女性只能借助于供卵。关于EFS的发病机制至今尚未明确,有研究者认为与卵泡提早闭锁、卵巢老化等因素有关。对于EFS的遗传学发病机制,既往研究包括LHCGR基因突变和2号染色体倒位,但均为单个病人或单个小家系的研究,缺少令人信服的大家系研究。我们前期收集了一个有六个不孕症患者的大家系（家系Ⅰ）,先证者及其姐姐的各三个体外助孕周期获得的卵冠丘复合物几乎全部为空黏液团,仅极少数存在退变的卵母细胞,表现为EFS;先证者的两个姑姑与两个堂姐妹也同样为不明原因不孕症患者。本章研究拟通过此大家系,定位EFS的致病突变。研究方法:为明确EFS的致病基因,我们首先对家系Ⅰ进行全基因组连锁分析,找到连锁不平衡区域。该家系为常染色体显性遗传,致病突变由父亲传递。为进一步明确致病突变,我们选择家系Ⅰ中的三个患者、两个突变携带者和两个正常女性对照进行全外显子组测序。对全外显子组测序数据进行生物信息分析并对候选位点进行验证、常用数据库过滤和正常生育女性对照过滤。将最终筛选出的位点在另一个EFS大家系（家系Ⅱ）和EFS散发病人中验证,并追溯携带此突变的散发病人的家族史,明确变异的来源。最后综合上述结果,得到导致EFS的致病突变位点。结果:经全基因组连锁分析发现该家系的连锁不平衡区域位于7p12.3-q21.13。全外显子组测序结果经过生物信息分析及验证、常用数据库和正常生育女性对照中过滤后,得到候选位点:ZP3 c.400G>A（p.Ala134Thr）杂合错义突变。该突变位于家系Ⅰ的连锁不平衡区域中,与疾病状态共分离。在家系Ⅱ中,该突变亦与疾病状态共分离。经连锁分析证实,在这两个大家系中,此突变为独立发生,不存在同源性。在21例EFS散发病例中,有2例携带同一位点相同的突变,追溯家族史发现其中一位患者的突变为新发突变（de novo）。结论:本研究是EFS的首个大家系研究,通过两个EFS大家系和EFS散发病例研究发现ZP3 c.400 G>A（p.Ala134Thr）杂合错义突变可能为EFS的致病突变。本研究也为EFS提供了潜在的诊断靶点:对于取卵呈现空黏液团无法获卵的不孕症患者可早期进行ZP3c.400 G>A的突变筛查,若患者携带此突变,则应避免反复促排卵尝试,尽早转换助孕策略,从而减轻患者的经济负担和精神压力,获得更好的助孕结局。第二章致病突变的体外功能研究研究目的:ZP3基因编码的ZP3糖蛋白是卵母细胞透明带的重要组分。透明带是包绕卵母细胞的结构,是卵母细胞的“外衣”,在卵母细胞发育、受精及早期胚胎发育过程中起到重要的作用。p.Ala134Thr突变位于ZP3的ZP功能域,ZP功能域在透明带组装过程中发挥重要的作用。本章将通过体外实验对p.Alal34Thr进行功能研究。研究方法:首先通过卵母细胞免疫荧光染色和卵巢活检组织石蜡切片染色等方法,对空卵泡综合征患者卵母细胞的具体异常进行表征。用PyMol软件预测突变对ZP3糖蛋白分子三维结构的影响。随后通过构建野生型、突变型表达载体,并转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）中,裂解细胞获得总蛋白,利用免疫共沉淀技术探究突变型蛋白对蛋白互作的影响。结果:家系Ⅰ先证者穿刺取卵获得的绝大多数为空黏液团,极少数包含无透明带的退变卵母细胞。免疫荧光显示卵母细胞核物质完全崩解,且卵外周无ZP3信号聚集。卵巢活检石蜡切片示卵泡中的卵母细胞无透明带结构且呈退变状态。免疫共沉淀实验证实野生型ZP3可与ZP2结合,突变型ZP3不与ZP2结合,但野生型、突变型ZP3同时存在时,突变型ZP3通过与野生型ZP3结合以阻止野生型ZP3与ZP2的结合,发挥显性负效应的作用,妨碍透明带的形成。结论:p.Ala134Thr突变发挥显性负效应的作用,抑制ZP3与ZP2的结合,妨碍透明带的形成,引起卵母细胞退变,表现为空卵泡综合征。第三章致病突变的小鼠模型研究研究目的:透明带的结构在哺乳动物中具有很高的保守性。小鼠透明带由Zp1、Zp2、Zp3基因编码的糖蛋白构成,由Zp2和Zp3相互连接成纤维状结构,Zp1连接这些纤维构成三维网状结构。在既往的报道中,Zp3基因敲除小鼠完全不孕,超数排卵实验获得的卵冠丘复合物大多为空黏液团,少数取到的卵母细胞无透明带,这与本研究中空卵泡综合征患者的表型极为相似。人和小鼠的ZP3均包含424个氨基酸,氨基酸序列同源性达67%。除外小鼠、大鼠等啮齿类动物,ZP3糖蛋白的第134位氨基酸位点在各物种中均为丙氨酸（Ala）。小鼠Zp3糖蛋白在此位点为性质与丙氨酸类似的缬氨酸（Val）。因此,在构建点突变小鼠模型时,我们将小鼠Zp3基因一条链突变为苏氨酸（Thr）,另一条链保持不变,仍为缬氨酸,即获得p.Val 134Thr小鼠。本章将对p.Val 134Thr点突变小鼠进行研究,进一步验证该突变的功能。研究方法:利用CRISPR-Cas9编辑的“类精子细胞”单倍体细胞系制备p.Val134Thr点突变小鼠,与性成熟的野生型雄鼠合笼观察生育力;对21天的小鼠行超数排卵,统计获卵数;分别取21天和6周龄小鼠卵巢组织脱水、石蜡包埋,对组织切片行HE染色、ZP3免疫组织化学（IHC）和过碘酸-雪夫染色（PAS）,观察组织切片中各级卵泡中卵母细胞的形态。结果:p.Val134Thr点突变纯合小鼠完全不孕,杂合子小鼠生育力与野生型相比虽略有降低,但无统计学差异。超数排卵实验中,杂合子、纯合子小鼠获卵数与野生型小鼠相比均存在显着差异。杂合子小鼠获卵数约为野生型小鼠的1/2-2/3,卵母细胞透明带比野生型小鼠薄;纯合子小鼠绝大部分的卵冠丘复合物为空黏液团,少数获得的卵母细胞无透明带且大小不一,为退变裂解卵。卵巢切片HE、IHC、PAS染色示杂合子小鼠卵母细胞形态大致正常,但透明带相比于野生型小鼠略薄;纯合小鼠卵母细胞缺乏透明带。结论:p.Va1134Thr纯合突变小鼠不孕,超数排卵大多数为空黏液团,仅获得少数无透明带的退变卵母细胞,表型与空卵泡综合征患者一致。
杨萍[9]（2017）在《ZP基因变异与卵细胞异常的相关性研究》文中进行了进一步梳理研究背景成熟的卵细胞是保证正常受精,胚胎发育以及着床的关键,是妊娠维持及胎儿生长的重要影响及决定因素。ZP（zonapellucida,透明带）基因属于卵细胞特异性表达基因,编码ZP蛋白,人类的ZP蛋白包括ZP1,ZP2,ZP3和ZP4;小鼠的ZP仅包括ZP1,ZP2和ZP3,与人的高度同源,小鼠的ZP结构也与人的相似。ZP最早在初级卵泡中合成,在卵细胞成熟过程中,ZPmRNAs的拷贝数显着增加,ZP厚度随着卵细胞的生长增加。敲除雌鼠的任何一个ZP基因,均可导致其生育障碍和/或卵细胞形态异常,说明ZP基因在卵细胞成熟和受精过程中起着至关重要的作用。在辅助生殖实验室中,我们发现有部分较为罕见的原发性不孕患者,在不同的促排卵周期中均表现为卵细胞成熟障碍或形态异常,无法正常受精。因此我们推测:ZP基因突变是否与这部分患者卵细胞异常有关。研究目的分析ZP（ZP1,ZP2,ZP3和ZP4）基因突变是否参与卵细胞成熟阻滞或者形态异常的发病。研究方法选择多周期重复表现为卵细胞异常的辅助生殖助孕患者作为研究对象,自2011年至2015年共收集92例（属较为罕见病例）,其中卵细胞成熟阻滞（组Ⅰ）49例,表现为卵细胞成熟阻滞（GV期和/或MI期阻滞）;卵细胞形态异常（组Ⅱ）43例,表现为卵细胞胞质异常或透明带等异常。纳入的研究对象同时满足:（1）21岁≤年龄≤40岁;（2）染色体核型均为正常（46,XX）;（3）多个（不少于两个）IVF/ICSI周期中卵细胞异常（成熟阻滞或形态异常）表现一致。对照组选择行辅助生殖助孕的,卵细胞形态无异常且正常受精,并生育过至少一个正常孩子的女性,共373例。提取所有受试者的外周血DNA,对其ZP1-ZP4四个透明带编码基因的外显子及其侧翼序列进行基因突变筛查,分析ZP1-ZP4基因的外显子及其侧翼序列是否存在单个碱基的改变（点突变）、缺失、插入、重复或移码突变。结果在组Ⅰ的49例卵细胞成熟阻滞患者中,除了已知的单核苷酸多态性（SNP）位点,未发现ZP1-ZP4有新的变异。在组Ⅱ的43例卵细胞形态异常患者中,发现了四处变异,其中两处位于ZP1基因:c.247T>C（p.W83R）和c.1413G>A（P.W471X）;两处位于 ZP2 基因:c.1599G>T（p.R533S）和 c.1696T>C（p.C566R）。这四处位点共在四个不同的病例中检测到,在373例对照组中未检测到,同时在常用数据库（dbSNP、ExAC、1000 Genomes Project Database、NHLBI GO ESP）中进行筛查亦未见报道。这四处变异位点在各个物种之间高度保守;利用生物信息学软件预测,发现四处位点均为有害突变。含有ZP基因变异的病例大约占组Ⅱ的9%（4/43）,均为原发性不孕患者。其中患者#224同时携带有c.247T>C（ZP1）和c.1413G>A（ZP1）两处变异,该患者表现为两个周期卵全部退变、碎裂。患者#006携带有c.1413G>A（ZP1）,该变异为无义突变,ZP1翻译提前终止,透明带结构域（ZPD）部分缺失,该患者三个促排卵周期所获卵全部退变。患者#189携带c.1599G>T（ZP2）,在三个促排卵周期中,所获卵多数退变、碎裂。患者#198携带c.1696T>C（ZP2）,在三个不同方案的促排卵周期中,所获卵多数退变、ZP异常。结论ZP基因变异可能与卵细胞退变或透明带等异常导致的原发性不孕有关,这些变异位点所造成的功能影响需要进一步实验证实。
程静[10]（2017）在《炎性因子Interleukin-6和新型转录本环状RNA在卵巢衰老中的作用初探》文中研究表明目的:1、探讨IL-6在小鼠和人卵巢衰老过程中的表达变化,以及IL-6对小鼠卵泡发育成熟的影响,初步探究其分子机制。在此基础上,探索IL-6信号通路抑制剂托珠单抗能否提高年老小鼠卵巢对促性腺激素的反应性,改善老年小鼠的卵母细胞质量,从而为提高高龄妇女的生育结局提供新的策略和治疗方法。2、探索新型转录本环状RNA在女性颗粒细胞中的表达及其在衰老中变化,揭示与卵巢储备和卵母细胞质量下降有关的环状RNA。材料与方法:1、ELISA、免疫化学和蛋白免疫印记分析IL-6在不同年龄阶段小鼠和人卵巢组织中的表达变化;基于卵泡三维培养体系,用不同浓度的IL-6处理小鼠窦前卵泡,观察IL-6对卵泡直径增长的影响,化学发光免疫技术检测雌孕激素生成,通过qRT-PCR、免疫荧光、体外成熟以及电镜评估其对卵母细胞发育成熟的作用,TUNE和蛋白免疫印记等检测凋亡、自噬相关蛋白和信号分子表达。利用卵巢间质细胞与卵泡共培养体系,将托珠单抗加入年老小鼠卵巢间质细胞培养基中,观察其对卵泡发育成熟的影响;用不同浓度的托珠单抗处理9月龄生殖衰老小鼠,1个月后检测小鼠卵巢对促性腺激素的反应性,免疫荧光观察卵母细胞减数分裂,MitoTracker检测卵母细胞线粒体分布,ELISA检测血清AMH、雌激素和孕酮的水平,蛋白免疫印记技术检测凋亡蛋白、自噬相关蛋白及JAK/STAT3的表达。2、收集2015年1月到2015年8月期间在同济医院生殖中心进行体外受精一胚胎移植患者的颗粒细胞,共126例。通过芯片检测人颗粒细胞中环状RNA表达模式随年龄的变化,qRT-PCR在20对样品中验证差异表达的环状RNA。RNaseR消化法和Sanger测序鉴定环状RNA的稳定性及成环位点。在另一独立队列80例样品中分析候选环状RNA与卵巢储备标记物和辅助生殖技术结局的相关性,并评估其预测价值;最后利用生物信息学方法预测这些候选环状RNA参与的生物学过程和信号通路。结果:1.IL-6在小鼠和人卵巢中的表达随着增龄而显着增加,与年龄呈显着的正相关关系。高浓度的IL-6显着抑制窦前卵泡的生长和雌孕激素的生成,并降低卵母细胞特异性基因的表达,阻碍卵母细胞减数分裂能力的恢复。高浓度IL-6处理的卵泡中卵母细胞超微结构严重受损,可见受损线粒体的聚集,伴随ROS生成增加。IL-6对卵泡的负向调控可能与它激活促凋亡蛋白、降低抗凋亡蛋白、抑制自噬活性有关。有趣的是,体内实验结果表明,与老年对照组小鼠相比,IL-6信号通路抑制剂托珠单抗能提高老年小鼠卵巢对促性腺激素的反应性增加获卵数,降低卵母细胞异常减数分裂的发生,改善卵母细胞内线粒体集聚,提高年老小鼠血清AMH和雌激素水平。托珠单抗对老年小鼠卵巢的保护作用可能与它抗凋亡和提高自噬活性有关。2.芯片结果显示人颗粒细胞环状RNA表达谱在女性衰老进程中发生显着改变,而且通过 qRT-PCR 确认了 circRNA103829、circRNA103827、circRNA104816 和circRNA101889的表达差异。在校正促排卵方案的影响后,circRNA103827和circRNA104816水平仍与女性年龄显着正相关。此外,颗粒细胞中这两个环状RNA的表达水平与血清AMH、AFC、获卵数和优质胚胎数呈显着负相关关系。ROC曲线分析表明circRNA103827和circRNA104816对临床妊娠结局具有一定的预测价值,其中circRNA103827用于活产的预测性能为0.698[0.570-0.825],灵敏度为77.2%,特异性为60.9%（P=0.006）,circRNA104816的预测价值为0.645[0.507-0.783]（P = 0.043）。生物信息学分析显示这两个环状RNA可能参与了能量代谢、细胞周期等生物学过程,以及类固醇激素生成、细胞粘附等信号通路。结论:1.IL-6在人和小鼠卵巢中的表达均呈增龄性的升高,升高的IL-6是窦前卵泡发育的负向调节因子,能引起卵泡发育成熟障碍和类固醇激素生成受损。它对卵泡发育成熟的调控作用可能与促凋亡、抑制自噬活性以及受损线粒体的集聚有关。此外,IL-6抑制剂托珠单抗注射能提高老年小鼠卵巢对促性腺激素的反应性,改善老年小鼠恶化的卵母细胞质量。因此,随年龄增长而升高的IL-6可能是导致女性内分泌功能异常、卵母细胞质量下降和卵巢低反应性的重要因素,阻断IL-6信号通路有望成为新的提高高龄妇女生育结局和延长卵巢寿命的方法。2.人颗粒细胞中环状RNA的表达受年龄的影响,随年龄增长而显着上调的circRNA103827和circRNA104816可能是卵泡微环境损伤的潜在指标,对体外受精的妊娠结局具有一定的预测价值。阐明这些环状RNA的生物学功能将有助于揭示卵母细胞质量下降的分子机制,改善个性化辅助生殖技术的治疗策略,提高高龄不孕女性的妊娠结局。
二、Recombinant human zona pellucida proteins ZP1, ZP2 and ZP3 co-expressed in a human cell line（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Recombinant human zona pellucida proteins ZP1, ZP2 and ZP3 co-expressed in a human cell line（论文提纲范文）
（1）人胚胎原肠前动态发育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境因素与生殖健康 |
| 1.1.1 环境污染与生殖健康 |
| 1.1.2 生活方式与配子发生 |
| 1.1.3 胚胎体外培养环境压力与表观遗传改变 |
| 1.2 早期胚胎发育概述 |
| 1.2.1 早期胚胎发育 |
| 1.2.2 多能干细胞与胚胎发育 |
| 1.3 着床前胚胎发育 |
| 1.3.1 辅助生殖技术现状 |
| 1.3.2 着床前胚胎发育过程 |
| 1.3.3 着床前胚胎基因调控 |
| 1.4 着床后胚胎发育 |
| 1.4.1 胚胎2D体外培养体系的建立 |
| 1.4.2 着床后胚胎发育过程 |
| 1.4.3 着床后胚胎发育转录因子调控 |
| 1.4.4 人类胚胎干细胞模型 |
| 1.5 信号通路在胚胎发育及干细胞中的研究 |
| 1.5.1 Wnt信号通路与胚胎发育 |
| 1.5.2 TGF-β/Activin/Nodal信号通路对胚胎发育的作用 |
| 1.6 论文的立题依据及主要研究内容 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料来源 |
| 2.1.2 主要试剂及配制方法 |
| 2.1.3 使用抗体 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.1.5 耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 胚胎样品的准备 |
| 2.2.2 胚胎体外培养 |
| 2.2.3 Matrigel浓度的选择 |
| 2.2.4 全胚染色 |
| 2.2.5 胚胎冰冻切片及切片染色 |
| 2.2.6 共聚焦显微镜拍照 |
| 2.2.7 单细胞消化分离 |
| 2.2.8 细胞测序过程 |
| 2.2.9 测序结果分析 |
| 第三章 人胚胎原肠前动态发育研究实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 人胚胎体外3D培养体系的建立 |
| 3.2.1 人胚胎体外培养体系探索 |
| 3.2.2 着床后胚胎发育过程是谱系动态变化的过程 |
| 3.3 EPI动态发育研究 |
| 3.3.1 EPI发育过程是naive向 primed转变的过程 |
| 3.3.2 EPI发育阶段互相联系又各自表达不同基因 |
| 3.3.3 人类与非人灵长类EPI发育既有差异又有保守性 |
| 3.4 着床后胚胎关键结构的形成 |
| 3.4.1 羊膜上皮是从EPI中迁移出来的一群独特的细胞 |
| 3.4.2 胚胎前后轴及原条前体的形成 |
| 3.5 滋养层细胞发育是分化发育的过程 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 人胚胎体外培养体系的突破 |
| 4.2 本研究填补了着床后人胚胎发育分子机制的空白 |
| 4.3 胚胎发育过程是多能性细胞从naive到 primed态转变过程 |
| 4.4 人类胚胎与其他物种胚胎发育的差异 |
| 4.5 人胚胎发育过程中特殊结构的形成 |
| 4.6 滋养层细胞发育分化 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文的创新性 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读博士期间取得的科研成果及奖励 |
| 附录 B 医学伦理证明 |
（2）人多能干细胞向雌性生殖细胞诱导分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 文献综述 |
| 第一章 生殖细胞的体内发生 |
| 1.1 PGCs的形成与迁移 |
| 1.2 PGCs增殖与分化 |
| 1.3 卵子的发生 |
| 第二章 生殖细胞发育和成熟的分子调控 |
| 2.1 hPGCs发育过程中的基因调控网络 |
| 2.2 减数分裂的关键因子调控 |
| 2.2.1 DAZL和 BOULE对生殖细胞减数分裂的作用 |
| 2.2.2 RA-Stra8 通路介导减数分裂启动 |
| 2.2.3 NANOS基因介导的信号通路 |
| 2.2.4 TAF4B调控卵母细胞减数分裂 |
| 2.3 卵母细胞发育过程中的表观遗传学修饰 |
| 2.4 生殖细胞的特异性基因 |
| 2.4.1 减数分裂前的特异性基因 |
| 2.4.2 减数分裂及其分裂后生殖特异性基因 |
| 第三章 多能干细胞向雌性生殖细胞诱导分化的研究进展 |
| 3.1 小鼠多能干细胞体外向原始生殖细胞的诱导分化 |
| 3.2 人多能干细胞体外向原始生殖细胞的诱导分化 |
| 3.3 原始生殖细胞向雌性生殖细胞的诱导分化 |
| 试验研究 |
| 第四章 人诱导多能干细胞向原始生殖细胞诱导体系的建立 |
| 4.1 试验材料,仪器和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备及器材 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 hPSCs在无饲养层体系下的培养 |
| 4.2.2 hiPSCs向 i PGCs的诱导分化 |
| 4.2.3 iPGCs的基因表达检测 |
| 4.2.4 iPGCs转录组分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 诱导的原始生殖细胞向卵泡样结构诱导分化体系的建立 |
| 5.1 试验材料,仪器和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂与耗材 |
| 5.1.3 主要仪器设备及器材 |
| 5.1.4 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 iPGCs向 i FLs的诱导分化 |
| 5.2.2 iFLs的形态学及特征检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 诱导的卵泡样结构向卵母样细胞诱导分化体系的建立及三步法体系的验证 |
| 6.1 试验材料、仪器和方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 主要试剂与耗材 |
| 6.1.3 主要仪器设备及器材 |
| 6.1.4 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 iFLs向 OLCs的诱导分化 |
| 6.2.2 OLCs的体外成熟及检测 |
| 6.2.3 利用h ESCs验证三步法诱导体系 |
| 6.2.4 胚胎样结构的产生及检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点及未来研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）Izumo1和Juno在哺乳动物受精过程中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 哺乳动物的受精过程 |
| 2 精子表面蛋白Izumo1的发现 |
| 3 卵子表面蛋白Juno的发现 |
| 4 Izumo1与Juno的基因和蛋白信息 |
| 5 Izumo1与Juno在精卵融合过程中的相互作用 |
| 6 其他影响精卵融合的蛋白 |
| 7 结语与展望 |
（4）睾丸特异性丝氨酸蛋白酶PRSS55在雄性生殖中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 前言 |
| 1.1 生殖 |
| 1.2 丝氨酸蛋白酶与生殖 |
| 1.3 PRSS家族与生殖 |
| 1.4 PRSS55 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 生化与分子细胞生物学试剂 |
| 2.3 主要溶液及其配制 |
| 2.4 实验仪器 |
| 2.5 引物设计与合成 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 小鼠基因组 DNA 的提取及基因型鉴定 |
| 3.2 组织RNA抽提 |
| 3.3 半定量 RT-PCR 和荧光实时定量 PCR (Real-time PCR) |
| 3.4 蛋白抽提及western blotting |
| 3.5 PRSS55 抗体制备 |
| 3.6 H&E染色 |
| 3.7 组织免疫组化与免疫荧光 |
| 3.8 雄鼠生殖能力评价 |
| 3.9 睾丸体重比、精液分析及精子超微结构观察 |
| 3.10 组织病例检测 |
| 3.11 精子顶体反应及顶体酶活性检测 |
| 3.12 精子体内受精率及在雌性生殖道内的迁移分析 |
| 3.13 精卵体外结合分析及体外受精 |
| 3.14 细胞培养及瞬时转染 |
| 3.15 磷脂酰肌醇磷脂酶 C(PI-PLC)水解 GPI-锚定蛋白 |
| 3.16 睾丸组织和精子的组分分离 |
| 3.17 蛋白酶K水解生殖细胞非胞质面单层膜蛋白 |
| 3.18 蛋白的免疫沉淀(IP)分析 |
| 3.19 m RNA基因芯片检测 |
| 3.20 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 PRSS55 在成年小鼠中的组织表达谱 |
| 4.2 Prss55~(-/-)小鼠模型的建立及鉴定 |
| 4.3 Prss55 缺失导致雄鼠不育 |
| 4.4 Prss55~(-/-)雄鼠睾丸发育、精子发生、精子形态及超微结构无差异 |
| 4.5 Prss55~(-/-)雄鼠精子顶体反应、顶体酶活性无差异 |
| 4.6 Prss55~(-/-)雄鼠精子体内受精率严重下降 |
| 4.7 Prss55~(-/-)雄鼠精子在雌性生殖道内迁移障碍 |
| 4.8 Prss55~(-/-)雄鼠精子与卵细胞识别/结合障碍但体外受精能力正常 |
| 4.9 PRSS55 在小鼠生殖细胞中的定位模式 |
| 4.10 PRSS55 抗体封闭实验 |
| 4.11 Prss55~(-/-)小鼠精子中ADAM3 成熟体消失 |
| 4.12 PRSS55 酶活性分析 |
| 4.13 PRSS55与ADAM3 的相互作用分析 |
| 4.14 酵母双杂交筛选PRSS55 相互作用蛋白 |
| 4.15 基因芯片筛选睾丸组织中差异表达基因 |
| 4.16 PRSS55 在附睾中的剪切加工及顶体反应后的释放动力学表现 |
| 4.17 Prss37 缺失不影响PRSS55 在雄性生殖器官内的表达 |
| 4.18 PRSS55 在人类精子中的免疫荧光定位 |
| 5 讨论 |
| 6 总结 |
| 7 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
| 附录 在学期间已发表学术论文全文 |
（5）重组人卵膜糖蛋白2与精子体外结合的研究及四个DNA遗传标记的多态性调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:重组人卵膜糖蛋白2的表达及与精子体外结合的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组h ZP2蛋白的制备 |
| 2.2.2 重组h ZP2蛋白与人未获能精子的体外结合 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组h ZP2蛋白在真核系统中的成功表达 |
| 3.1.1 p CDNA3.1(+)- h ZP2重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.1.2 重组h ZP2蛋白在HEK293细胞中的成功表达 |
| 3.1.3 重组h ZP2蛋白纯化的最佳条件 |
| 3.2 重组h ZP2蛋白与未获能精子的结合 |
| 3.2.1 ELISA检测重组h ZP2蛋白表现出浓度依赖性 |
| 3.2.2 间接免疫荧光未发现精子与重组h ZP2蛋白体外结合 |
| 3.2.3 在不同结合条件下抑制试验未反应出结合前后重组h ZP2蛋白浓度差异 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组h ZP2蛋白的真核表达与纯化 |
| 4.2 真核表达重组h ZP2蛋白体外结合未获能精子的探究 |
| 第二部分:四个DNA遗传标记在中国北方地区的多态性调查及法医学意义 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 研究对象 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 基因组DNA的提取 |
| 6.3.2 PCR引物设计及限制性内切酶的选择 |
| 6.3.3 PCR-RFLP分型检测 |
| 6.4 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 PCR-RFLP法对四个多态性标记的基因型鉴定 |
| 7.2 基因型频率分布及关联性分析 |
| 8 讨论 |
| 8.1 四个DNA遗传标记的遗传多态性及法医学意义 |
| 8.2 四个DNA遗传标记频率分布及与PD关联性 |
| 9 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）人卵膜糖蛋白4的表达、抗体的制备及与精子体外结合的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GST-ZP4-His融合蛋白的制备 |
| 2.2.2 兔抗人ZP4抗血清的制备及效价和质量测定 |
| 2.2.3 人重组ZP4蛋白与未获能精子体外结合的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组hZP4的诱导表达及纯化结果 |
| 3.1.1 pGEX-4T-1-ZP4-His重组质粒的酶切结果 |
| 3.1.2 成功诱导表达和纯化融合蛋白GST-ZP4-His |
| 3.2 兔抗人ZP4抗血清的效价和特异性 |
| 3.2.1 ZP4多克隆抗血清显示出较高的效价 |
| 3.2.2 ZP4多克隆抗血清的特异性结果 |
| 3.3 重组hZP4与精子的结合效果 |
| 3.3.1 ZP4与抗体反应表现出浓度依赖性 |
| 3.3.2 纯化的重组hZP4在体外未显现与未获能精子的结合 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组hZP4的诱导表达和纯化 |
| 4.2 制备兔抗hZP4抗血清 |
| 4.3 大肠杆菌表达的重组hZP4与精子体外结合 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）重组人卵膜糖蛋白3的表达、抗体制备及与精子体外结合的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组hZP3的制备 |
| 2.2.2 制备抗血清及特异性检测 |
| 2.2.3 重组hZP3与未获能精子的体外结合 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组hZP3的诱导表达及纯化结果 |
| 3.1.1 pGEX-4T-1(+)-hZP3重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.1.2 大肠杆菌BL21(DE3)成功表达重组hZP |
| 3.1.3 纯化后hZP3的蛋白免疫印迹检测结果 |
| 3.2 抗hZP3血清的抗体效价及特异性 |
| 3.2.1 多克隆抗hZP3血清显现出较高的效价 |
| 3.2.2 多克隆抗hZP3血清的特异性结果 |
| 3.3 重组hZP3体外与精子的结合 |
| 3.3.1 重组hZP3与抗体反应表现出浓度依赖性 |
| 3.3.2 间接免疫荧光未显示重组hZP3体外与未获能精子结合 |
| 3.3.3 抑制实验结果显示与精子结合前后hZP3蛋白浓度发生变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组hZP3在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 |
| 4.2 关于多克隆兔抗hZP3血清的制备 |
| 4.3 大肠杆菌表达重组hZP3体外结合未获能精子的探究 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）ZP3基因突变引起空卵泡综合征导致女性不孕（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 序言 |
| 第一章 空卵泡综合征致病突变的定位研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 致病突变的体外功能研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 致病突变的小鼠模型研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 英文论文3 |
（9）ZP基因变异与卵细胞异常的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文文章 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附表 |
（10）炎性因子Interleukin-6和新型转录本环状RNA在卵巢衰老中的作用初探（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 增龄性表达上升的IL-6通过促进凋亡和抑制自噬活性阻碍卵泡的发育和卵母细胞成熟 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 女性衰老过程中卵巢颗粒细胞环状RNA表达谱分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、Recombinant human zona pellucida proteins ZP1, ZP2 and ZP3 co-expressed in a human cell line（论文参考文献）
- [1]人胚胎原肠前动态发育研究[D]. 相立峰. 昆明理工大学, 2020(04)
- [2]人多能干细胞向雌性生殖细胞诱导分化的研究[D]. 王宁. 西北农林科技大学, 2019(02)
- [3]Izumo1和Juno在哺乳动物受精过程中的研究进展[J]. 胡文萍,汤继顺,张壮彪,喇永富,刘秋月,狄冉,王翔宇,储明星. 畜牧兽医学报, 2019(09)
- [4]睾丸特异性丝氨酸蛋白酶PRSS55在雄性生殖中的作用及分子机制研究[D]. 尚璇. 上海交通大学, 2019(06)
- [5]重组人卵膜糖蛋白2与精子体外结合的研究及四个DNA遗传标记的多态性调查[D]. 杨新瑞. 中国医科大学, 2019(02)
- [6]人卵膜糖蛋白4的表达、抗体的制备及与精子体外结合的研究[D]. 于裴夫. 中国医科大学, 2018(12)
- [7]重组人卵膜糖蛋白3的表达、抗体制备及与精子体外结合的研究[D]. 朱文清. 中国医科大学, 2018(12)
- [8]ZP3基因突变引起空卵泡综合征导致女性不孕[D]. 陈泰来. 山东大学, 2017(03)
- [9]ZP基因变异与卵细胞异常的相关性研究[D]. 杨萍. 山东大学, 2017(09)
- [10]炎性因子Interleukin-6和新型转录本环状RNA在卵巢衰老中的作用初探[D]. 程静. 华中科技大学, 2017(10)