一、PCR技术在转人肾素基因小鼠繁殖保存及育种中的应用（论文文献综述）
李晓聪[1]（2020）在《Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究》文中研究表明羊绒是重要的高端纺织品原材料,随着世界范围内羊绒市场的日益扩大,对羊绒产量及质量的要求也日益提高。绒山羊作为我国优良的畜种,其羊绒品质优良,但多年来在绒山羊选育中为了提高羊绒产量盲目进行杂交,造成山羊平均产绒量和羊绒质量降低、传统良种和改良品种所占比例不高等问题。利用现代生物技术对绒山羊进行分子育种是今后绒山羊育种的重要方向。胸腺素β4具有多种生物学功能,其对毛发生长的促进作用已在很多研究中被证实,但作用机制还没有明确的定论。本研究在利用基因编辑技术获得Tβ4基因定点整合绒山羊的基础上,对Tβ4基因定点整合绒山羊进行鉴定及健康状况评价,观察Tβ4基因对绒山羊绒毛生长的影响,利用Tβ4基因定点整合绒山羊进行扩繁并对后代进行检测,进一步结合转录组学及蛋白组学分析探究Tβ4基因促进绒毛生长的机制,为今后利用基因编辑技术培育高产优质绒山羊提供理论依据。一、Tβ4基因定点整合绒山羊的检测1、Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价本研究在利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术获得了Tβ4基因在CCR5位点定点整合绒山羊的基础上,对该基因编辑绒山羊进行了southern blot检测、Real-time PCR检测及免疫细胞化学检测,检测结果表明我们获得的绒山羊实现了Tβ4基因在CCR5位点的定点整合。另外,对基因编辑绒山羊的安全问题及健康状况进行检测,检测指标主要包括脱靶分析、插入位点CCR5基因邻近基因mRNA水平的检测、生长状况监测及血常规检测,结果表明在所检测到的潜在脱靶位点中未出现脱靶现象,CCR5邻近基因的表达也未受到影响,绒山羊的生长状况及血液指标与对照相比均无显着差异。说明Tβ4基因的定点整合并未影响整合位点周围内源基因的表达,且获得的基因编辑绒山羊生长状况及健康状况良好。2、Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测对绒山羊的产绒性能进行检测,检测指标主要包括绒纤维强伸度、细度、绒与毛的质量比及产绒量,检测结果表明,Tβ4基因定点整合绒山羊的绒纤维强伸度及细度与对照相比无显着差异,绒与毛的质量比与对照相比显着提高,产绒量与对照相比提高了74.5%。同时,还对绒山羊的皮肤组织进行了石蜡切片HE及免疫组织化学染色,结果表明Tβ4基因定点整合绒山羊的次级毛囊与初级毛囊的比（S/P）及次级毛囊处Tβ4基因的表达与对照相比显着提高。说明Tβ4基因主要作用于次级毛囊,并通过增加次级毛囊的数量进而提高产绒量。3、Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测对Tβ4基因定点整合绒山羊进行超数排卵处理,共获得20个2-8细胞期的胚胎,将这些胚胎分别移入4只受体羊中,共得到7只后代,其中有3只后代出生后不久死亡,经PCR鉴定,死亡的3只羔羊中有2只实现了Tβ4基因定点整合,存活的4只羔羊中有3只实现Tβ4基因定点整合。对4只存活羔羊的皮肤组织进行石蜡切片、HE染色、免疫组化及Tβ4基因的qPCR检测,发现Tβ4基因定点整合的羔羊表现出了更密集的次级毛囊分布及更高的S/P,并且Tβ4基因在次级毛囊处的表达量显着提高。对3只死亡羔羊进行解剖,取各内脏器官检测Tβ4基因mRNA表达情况,结果显示3只羔羊各脏器组织中Tβ4基因mRNA表达水平无显着差异,表明Tβ4基因的定点整合只会使其在皮肤组织中高表达而不会影响该基因在其它脏器中的表达,且利用基因编辑获得的Tβ4基因定点整合绒山羊可以将其优良性状稳定遗传给后代。二、Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究1、Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析将对照绒山羊与Tβ4基因定点整合绒山羊的皮肤组织进行高通量转录组测序,共筛选到差异基因1076个,其中上调基因463个,下调基因613个。上调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在肽酶活性的负调控、皮肤屏障的建立、皮肤失水的调节;在实现的分子功能中主要富集在生长因子受体的结合。下调差异基因在参与的生物学过程中主要富集在多细胞生物过程的调控、细胞粘着;在实现的分子功能中主要富集在钙离子的结合。差异基因在KEGG富集分析中显着富集在了血管平滑肌收缩信号通路、cGMP-PKG信号通路、细胞黏附分子信号通路、肾素分泌信号通路、白细胞跨内皮细胞迁移信号通路。对差异基因富集的信号通路进一步分析,筛选了关键的差异基因,发现这些差异基因主要参与细胞间的连接,调节细胞间的运动并影响血管生成、血管舒张、血管通透性的改变及血管稳定性的维持等。对这些差异基因进行了实时定量PCR验证,结果与转录组测序相符。说明Tβ4可能通过影响细胞间的连接进而影响了细胞的运动,同时还影响了毛囊周围血管的生成及血管的舒张等,最终达到了促进绒毛生长的作用。2、Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析利用iTRAQ技术,分析Tβ4基因定点整合绒山羊与对照绒山羊皮肤组织中的差异蛋白,共筛选到875个差异蛋白,其中上调蛋白666个,下调蛋白209个。上调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在离子跨膜运输;在实现的分子功能中主要富集在有机阴离子跨膜转运体活性。下调的差异蛋白在参与的生物学过程中主要富集在醛生物合成的过程和组蛋白mRNA代谢过程;在实现的分子功能中主要富集在锂离子结合和碱金属离子结合。在KEGG富集分析中,差异表达的蛋白显着富集在囊泡运输中的相互作用信号通路及TRP通道炎症介质调控信号通路,筛选了关键的差异蛋白包括MAPK、CAMK、PKC等。将蛋白组学分析与转录组学分析进行关联,发现共同上调或下调的差异基因/蛋白,结合信号通路,分析结果表明Tβ4的过表达使TIMPs的表达降低,进而MMPs的表达升高,促进了基底膜及细胞外基质的降解,释放出了与蛋白多糖以非共价键连接的VEGF,VEGF与VEGFR-2结合后激活了p38 MAPK信号通路,另外,Tβ4也激活了PKC信号通路。说明Tβ4通过MAPK及PKC信号通路影响肌动蛋白的组装,影响细胞的迁移、调节细胞的增殖与分化,最终促进了毛发的生长。
姚顺[2]（2020）在《利用CRISPR/Cas9技术制备牛IGF2基因编辑胚胎》文中提出CRISPR/Cas9是划时代的第三代基因编辑技术。IGF2基因编码胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF2）,该生长因子是一种促进细胞分裂的多肽,参与生长发育,影响骨骼肌质量和脂肪沉积。IGF2基因具有高度的保守性,其内含子3上的阻遏物锌指蛋白6（Zinc finger bed domain containing,ZBED6）结合位点被破坏,会引起骨骼肌中IGF2的表达量上调,进而影响肌肉生长和脂肪沉积。西门塔尔为肉、乳兼用型牛种,它的产肉性能及泌乳性能与纯种奶牛相当。IGF2基因第三内含子ZBED6结合位点敲除对IGF2表达量影响的相关研究多集中于小鼠和猪,牛上鲜有报道,需要开展相关研究,故此,本研究拟用CRISPR/Cas9技术对牛IGF2基因进行编辑并制备基因编辑胚胎,以期探究牛IGF2基因第三内含子ZBED6结合位点敲除IGF2表达量变化情况,为生产高产肉牛奠定理论基础和制备肉牛育种新材料。本研究主要结果如下:1.利用CRISPR Design软件对牛IGF2第三内含子中抑制因子ZBED6结合位点及其附近序列设计5个单一导向RNA（Single-guide RNA,sg RNA）并成功构建对应的PX458-sg RNA基因打靶载体。随后,在细胞水平借助T7E1酶切结合T-A克隆检测的方法验证编辑效率,其中sg RNA1效率最高,约为40%。2.通过流式细胞分选结合无限稀释手段,成功获得10株西门塔尔IGF2中ZBED6结合位点完全敲除的细胞系,其中1株为纯合突变。3.在小鼠C2C12细胞中利用荧光素酶试验和荧光定量PCR在牛成纤维细胞上分析突变对IGF2表达的影响,结果显示IGF2非编码区突变可增强IGF2启动子3活性,在转录水平提高IGF2表达。4.运用体细胞核移植技术获得34枚42号纯合突变细胞系克隆胚胎并利用T-A克隆检测了9枚克隆胚胎ZBED6结合位点敲除情况,结果获得100%的敲除效率。随后,经PCR鉴定,42号细胞系及其制备的克隆胚胎均无载体骨架残留,无外源基因引入,具生物安全性,可用于胚胎移植。综上所述,本试验构建的CRISPR/Cas9系统可有效编辑牛肌肉生长相关基因IGF2并提高其表达水平,此外,本试验还借助体细胞核移植技术获得了可用于胚胎移植的牛IGF2基因编辑胚胎。本试验结果为高产肉牛的分子育种奠定了基础。
徐忠[3]（2020）在《基于基因组信息对金华猪种质特性及其保护、利用的研究》文中研究表明金华猪是我国猪种资源宝库中的佼佼者,因其肉质优良、肉味鲜美,深受人们喜爱,特别是以其后腿作为原料加工制作的金华火腿,堪称世界一绝。在生产实践中,金华猪相比于西方引进猪种更容易感染猪气喘病,严重影响其生产效率。而目前对金华猪的这些特性的遗传基础及形成机制尚不清楚。在保种过程中,金华猪的保种效果不能有效评估,缺乏从分子水平上的评估方法。此外,在金华猪的杂交利用中,缺乏有效的杂种优势预测理论及配合力测定进行指导。为此,本研究的主要目的是利用全基因组信息对金华猪进行种质特性和保护、利用研究,开展以下工作:（1）首先对金华猪进行简化基因组测序,并与其它群体一起进行全基因组单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）检测;（2）对金华猪在遗传资源分类中的地位进行深入了解;（3）从基因组结构、功能特性和信号选择分析等对其分子种质特性进行挖掘;（4）对金华猪气喘病易感性的分子机制进行生物信息学挖掘和全基因组关联分析;（5）利用传统系谱和全基因组分子标记对其保种效果进行分析和评估;（6）最后利用杂种优势预测及配合力测定试验找出最优杂交利用的组合模式。具体研究内容和结果如下:（1）基因组测序与遗传变异检测:本研究首先对金华猪国家级保种场在群的202头金华猪采集了耳组织样,利用基于基因组简化与测序的基因型分型（genotyping by genome reducing and sequencing,GGRS）平台对其进行了建库实验和测序。结果共得到12.5亿条高质量Reads数,每个个体平均测序深度为6.13,平均覆盖度为3.3%。进一步结合实验室前期数据,对金华猪与江、浙、沪等中国地方品种和西方品种共19个品种914头猪进行了遗传变异检测。最终共得到114687个高质量的SNPs位点,这些位点在染色体上分布较均匀,说明测序结果较理想。特别是与现有猪的SNP数据库进行对比分析,其中有16 656个为本次新发现的SNPs多态标记,大大丰富了我国地方猪品种及西方引进品种的分子遗传标记数据库。（2）金华猪在遗传资源分类中的地位:本研究在分子层面对金华猪与其它群体间遗传距离、遗传分化和遗传结构进行了分析。从聚类分析和PCA分析可以看出金华猪所有个体聚在一起,而与其它群体较独立,有着独特的遗传结构;从ADMIXTURE的群体结构来看,金华猪群体最早独立出来,说明金华猪起源相对较早,具有着较为古老的祖先血统;从遗传距离、遗传分化和PCA结果上也可以看,相比于西方商业品种猪,金华猪与中国地方品种猪有着更近的遗传背景;由Treemix分析也可以看金华猪有向兰溪花猪迁移事件,可能是因为两者地理距离较近,有基因交流的可能性也更大。这些结果表明金华猪在遗传资源分类中具有独特的地位,为其作为独立品种提供了分子依据。（3）金华猪基因组结构和功能特性:基因组结构的不同是动物表型差异的遗传基础。我们对SNPs在基因组的分布、单倍型块和连续纯合性片段（runs of homozygosity,ROH）等基因组结构进行分析。在本研究总共检测到114 687个SNPs遗传变异中85 287（74.4%）在金华猪中存在多态,说明金华猪的遗传多样性相对较高。特别是有29 400（25.6%）个位点在其它群体表现多态但在金华猪群体中表现纯合,这些点所在基因主要参与色素沉积（GO:0043473～pigmentation）、对刺激反应的调节（GO:0048585～negative regulation of response to stimulus）和气喘病（hsa05310～Asthma）等,这些说明金华猪群体内一些与色素沉积、对刺激的反应和气喘病相关的基因位点已经发生纯合。我们发现了249个金华猪品种特异的SNPs,这些SNPs可以作为品种鉴定的候选位点。金华猪单倍型块在基因组分布并不均匀,在6号染色体的单倍型区块最多（862个）,覆盖区域最长（33101 Kb）,占相应染色体总长度的比例最大（19.38%）。金华猪中最长的单倍型块位于7号染色体57 101 799～57 601 268的位置上,位于其中的基因与免疫、肌内脂肪含量和繁殖相关。金华猪基因组中ROH分布也不均匀,短的ROH片段多位于染色体的两端。在所有金华猪中出现频率最高的位点是Chr3:37449853,距离此位点最近的基因是SEC14L5,此基因与脂质转运与代谢相关。这些结果为进一步深入揭示金华猪种质特性的遗传机制提供参考。（4）金华猪选择信号分析:金华猪之所以形成如此独特的表型特征,是长期的自然选择和人工选择造成的,而这些选择信号可能是造成金华猪种质特性的原因。本研究通过基于金华猪群体内的（REHH、i HS和CLR三种方法）和金华猪与其它群体间的（基于PLS和XPEHH）信号选择方法,对金华猪基因组上的受选择区域进行了分析。金华猪群体内选择信号分析共找到62个候选基因,与肉质、繁殖、生长和免疫等相关（如PIK3R6、NOS2、ZNF423、IL21R）。而这些性状相关的候选基因为后续的功能基因验证提供了一定的指导意义。在金华猪与其它猪群体间的信号选择方法中,我们还找到了:与毛色性状相关的基因如MYO7A、EDNRB和KIT等;与骨组织生长相关的基因如PBX1、GSG1L和PAPPA2等;与肺部疾病相关的通路如气喘病通路（hsa05310～Asthma）和肺结核（hsa05152～Tuberculosis）等。这些可能与金华猪独特的两头乌毛色、皮薄骨细和易感气喘病等性状有关,值得深入研究。这些结果使我们对中国地方猪的基因组进化和选择机制有了更深入的了解。（5）金华猪气喘病相关研究:我们同时利用基因组到表型（选择信号分析方法）和表型到基因组（全基因组关联分析）研究分析金华猪气喘病的遗传机制,并进一步基于表达谱实验数据进行核实验证。选择信号分析方法是通过比较三个对气喘病易感的猪种（金华猪53头、二花脸猪31头、梅山猪80头）和两个相对不易感气喘病猪种（杜洛克猪48头、长白猪37头）的基因组,挖掘猪支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine,MPS）候选基因,结果找到了CYP1A1、TLR2和CXCL2等14个相关候选基因;同时对171头金华猪的基因型数据和连续100天的气喘病表型记录,利用全基因组关联分析（genome-wide association study,GWAS）找到KIAA1644、MAGI3、PGM1和ALK四个候选基因。这两种方法找到的18个候选基因中有2个（CYP1A1和TLR2）是前人研究已证实的,16个是本次研究新发现的。其中有4个基因（EPAS1,CXCL2,TLR2和IL7R）我们通过猪气喘病转录组的数据分析进一步进行了核实验证。这些MPS易感性位点可能是在对繁殖力和肉质等优良经济性状的选择过程中,由于多效性和搭便车效应从而导致受选择,在随后的选种中需要更加注意。本研究初步揭示了金华猪易感MPS的遗传机制,为后续金华猪抗MPS的基因组保护和和基因组选择方案提供指导作用。同时这些研究可能对人类呼吸系统疾病的研究起一定的参考作用。（6）金华猪保种效果分析:利用12 560个个体的系谱信息和6 018条繁殖记录对金华猪的保种效果进行纵向比较,发现在2009～2017年间,金华猪的近交系数稳定在较低（0.009左右）的水平,繁殖性能（总产仔数、活产仔数和出生窝重）的个体估计育种值（estimated breeding value,EBV）均呈现增加趋势,分别提升2.0头、1.9头和0.85kg,说明了近几年的总体保种效果较好。但利用传统系谱信息和分子遗传标记信息深入分析显示仍存在一些问题,需要进一步优化保种策略。其一,对本研究采样时的在群金华猪群体的近交系数、亲缘系数和血统结构进行了分析。分析结果表明金华猪个体平均近交系数和个体间亲缘系数总体虽较低,但也有极个别间较大,达到0.5以上,且金华猪每个血统个体数并不是很均匀,在以后的保种过程中群体结构有待优化。其二,系谱和分子计算的金华猪群体有效含量分别为63和88头,根据畜禽遗传资源受威胁程度的分类可知,金华猪可能仍处于受威胁状态,表明仍需进一步适当扩大保种群体规模,特别是基于分子标记指导选种、选配,逐步提高群体有效含量。其三,我们利用其它地方品种及西方品种等19个群体的分子遗传多样性指标,对金华猪的保种效果进行了横向比较,发现金华猪遗传多样性较高,但近交程度（基于分子的）在这些群体中处于中等水平,提示我们在今后保种过程中尽量避免近交,优化配种策略。本研究为金华猪今后的保种工作提供了参考价值。（7）金华猪的杂交利用:本研究基于全基因组遗传标记筛选金华猪候选杂交组合,并结合繁殖、育肥和屠宰等配合力测定试验确定了最优的杂交组合模式。首先利用全基因组性状特异（繁殖、健康、生长和胴体与肉质）的SNP对金华猪与三个西方引进品种杜洛克（DD）、大白猪（YY）和长白猪（LL）共180头猪的各种杂交组合进行了杂种优势的预测,结果显示在二元、三元和双杂交组合中最优选择为D×J、J×LY和DJ×LY。随后我们挑选了合适组合进行配合力测定试验,其中繁殖性能测定共88窝,育肥测定试验共91头,屠宰测定试验共83头。最终确定了DJ×LY为最佳的杂交组合模式。研究为金华猪的杂交利用提供了一套切实可行的方案。综上,本论文对金华猪种质特性的遗传基础及其形成机制进行了探究,进而为该遗传资源的保护、选育、利用奠定基础。这在非洲猪瘟流行的背景下,对我国地方猪遗传资源的保护和利用具有特殊意义。有关结果也为研究人类复杂性状的遗传机制提供了依据,对人类哮喘病等呼吸系统疾病的研究具有参考作用。
孙犁[4]（2019）在《中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）竞争行为相关基因的筛选、克隆及表达分析》文中指出中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）肉质鲜美、个体较大,具有较高的经济价值,是我国重要的养殖虾类。在养殖中表现出较强的竞争行为,对其生长、存活性能及群体整齐度产生了较大的影响。然而目前为止尚不清楚其发生的分子机制,在竞争过程中发挥作用的基因有哪些。因此,本文利用分子生物学方法和技术,筛选、获得与竞争性强弱相关的基因,将为改良对虾的竞争能力提供理论依据和分子基础。1.在竞争环境下基于转录组筛选中国明对虾的差异表达基因在不同的竞争刺激环境下,选择竞争行为性状差异明显的中国明对虾2017G12世代同一家系的18尾个体,通过设置三种不同环境条件的处理组,即竞争能力差异显着的个体混合养殖少量投喂组（MHL vs MHS）、竞争能力差异显着的个体独立养殖足量投喂组（SCL vs SCS）和竞争能力差异显着的个体独立养殖少量投喂组（SHL vs SHS）,利用Illumina Hiseq 2500对其进行测序分析,共获得94,092条Unigenes,其中78.08%的Unigenes在Nr数据库中有注释,77.04%的Unigenes在GO数据库中有注释。通过比较分析,跟另外两组相比,在MHL vs MHS中得到4,397个差异表达基因,其中4,087个上调,312个下调。KEGG富集分析显示,这些差异基因参与的大多数信号通路的功能是神经信号传导,提示接受外界刺激后个体间在神经信号传导速度中的差异可导致其竞争能力的不同,研究结果为中国明对虾竞争行为相关候选基因的鉴定,以及竞争行为分子机制的解析奠定了重要的基础。2.中国明对虾钙调神经磷酸酶（calcineurin,CN）基因的克隆及其在竞争行为中作用的初探在上述比较转录组分析获得的与中国明对虾竞争行为相关的候选基因中包括提示为钙调神经磷酸酶基因,包括其催化亚基（CNA）和调节亚基（CNB）,是参与许多重要生物过程的多功能蛋白质。CN在Ca2+/CaM的介导下主要在动物的中枢神经系统发挥重要的作用,为了进一步明确其在中国明对虾竞争过程中的作用,本研究通过RACE技术克隆了中国明对虾FcCN-A和FcCN-B的全长cDNA序列,并利用Real-time PCR技术分析了其在2018G13世代高竞争能力组（HCG）和低竞争能力组（LCG）组间不同组织（神经节、心脏、胃、肝胰腺和肠）中的表达情况。FcCN-A序列分析结果显示,FcCN-A的全长cDNA序列为3260bp,包括115 bp的5’非编码区（untranslation region,UTR）,1566 bp的开放阅读框（ORF）序列和1579 bp的3’UTR;FcCN-B的全长cDNA序列为2867 bp,包括95 bp的5’UTR,540 bp的ORF和2232 bp的3’UTR,其中ORF中具有四个保守的EF-hand Ca2+结合结构域。蛋白质同源性分析显示,FcCN-A的氨基酸序列与其它物种具有较高的同源性（72.2-93.4%）,其中同源性最高的是罗氏沼虾和中华绒螯蟹;FcCN-B同样与其它物种具有较高的同源性（78.8%-93.8%）,其中最高的是中华绒螯蟹和黑腹果蝇。系统进化关系分析显示,脊椎动物和无脊椎动物分别独立为一支,其中基于FcCN-A分析表现为中国明对虾与罗氏沼虾单独聚为一支,之后与中华绒螯蟹聚类关系最近;基于FcCN-B分析表现为中国明对虾与中华绒螯蟹单独聚为一支,之后与黑腹果蝇聚类关系最近。Real-time PCR定量结果显示FcCN-A在HCG组的神经节中的表达显着高于LCG组（P<0.05）,而其在HCG组的心脏和肝胰腺中的表达显着低于LCG组（P<0.05）。FcCN-B在HCG组的神经节中的表达极显着高于LCG组（P<0.01）,而其在HCG组的心脏中的表达极显着低于LCG组（P<0.01）。3.中国明对虾钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶互作蛋白（CASK-interacting protein 2,Caskin-2,CK）基因的克隆及其在竞争行为中作用的初探在上述比较转录组分析获得的与中国明对虾竞争行为相关的候选基因中包括提示为caskin-2（CK）基因,CK是一种调节皮质肌动蛋白丝的支架蛋白,在哺乳动物的神经突触中富集。为了进一步明确CK基因在中国明对虾竞争过程中的作用,本研究通过RACE技术克隆了中国明对虾CK的全长cDNA序列,并利用Real-time PCR技术分析了其在2018G13世代HCG和LCG组间不同组织（神经节、心脏、胃、肝胰腺和肠）中的表达情况。FcCK序列分析结果显示,FcCK的全长cDNA序列为4185bp,包括268 bp的5’UTR,2808bp的ORF序列,和1109 bp的3’UTR,蛋白质同源性分析显示,FcCK的氨基酸序列与其它物种的同源性相对较低（17.5%-53%）,其中最高的是鼠妇;系统进化关系分析显示,中国明对虾与鼠妇单独聚为一支,之后与食粪金龟和玉米根叶虫聚类关系最近,提示FcCK在对虾中可能具有与其在鼠妇相类似的功能。Real-time PCR定量结果显示FcCK在HCG组的神经节中的表达极显着高于LCG组（P<0.05）。本研究通过比较转录组分析筛选了与中国明对虾竞争行为相关的候选基因,并进一步对其中的calcineurin、caskin-2基因进行了克隆和特征分析,初步证明其在中国明对虾的竞争行为中可能发挥一定的作用,为解析中国明对虾竞争行为的分子机制奠定了重要的基础。
白曼[5]（2018）在《小尾寒羊公羊繁殖性能研究及其睾丸发育miRNA-mRNA表达谱联合分析》文中研究表明公羊繁殖性能主要体现在配种能力和精液品质两个方面,精液品质则与睾丸组织结构密切相关。睾丸发育和精子发生是影响公羊繁殖能力的重要因素。小尾寒羊是我国优良的地方绵羊品种,以高繁殖力着名,是肉羊产业发展中广泛使用的母本品种,在我国肉羊产业化发展过程中发挥着重要作用。本研究以小尾寒羊公羊为研究对象:一、对小尾寒羊公羊进行繁殖性能研究挑选出2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸,采用H.E.染色方法进行组织学观察。二、在2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸组织结构和精子发生进程差异的基础上,构建睾丸mRNA文库和sRNA文库,利用RNA-seq测序技术和生物信息学方法对2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸中mRNA和miRNA的表达谱进行分析,并对miRNA与mRNA表达谱进行联合分析,构建miRNA-靶基因调控网络,筛选出睾丸发育和精子发生的关键miRNA及其靶基因。三、利用qRT-PCR方法对测序数据进行验证,并采用双荧光素酶报告基因检测系统对筛选出的睾丸发育和精子发生关键miRNA及其靶基因的靶向调控作用进行验证。旨在为揭示小尾寒羊公羊睾丸发育和精子发生的分子调控机制及影响其优秀繁殖性能的分子标记提供理论依据。本研究获得的主要研究结果如下:1.小尾寒羊公羊繁殖性能研究:结果表明,小尾寒羊公羊具有性早熟特性,公羔在75-88日龄出现性行为,6月龄可达性成熟。小尾寒羊睾丸发育与睾酮分泌水平呈正相关,成年公羊射精量多,精液密度大,精子活率高,精子在体外存活时间长,精液品质好,可用于常年配种。且2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸在曲细精管直径和生精细胞数量等组织学上存在明显差异,可用于后续转录组差异分析。2.不同月龄小尾寒羊睾丸mRNA表达谱分析:成功构建了2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸mRNA文库,2月龄vs 6月龄睾丸获得630个差异基因（470个上调和160个下调）,6月龄vs 12月龄睾丸获得322个差异基因（218个上调和104个下调）,2月龄vs 12月龄睾丸获得102个差异基因（82个上调和20个下调）。GO和pathway分析表明2月龄vs 6月龄睾丸的差异基因显着富集到雄性求偶,类固醇代谢和精子发生等191个生物过程及氨基糖与核苷酸代谢,核苷酸切除修复及AMPK等17条信号通路。6月龄vs 12月龄睾丸的差异基因显着富集到有性生殖,发育性细胞凋亡及精子获能等311个生物过程及核糖体,多糖降解和核黄素代谢等8条信号通路。3组差异基因取并集后获得的955个差异基因趋势分析,共获得8种表达谱并归类为4种模式表达谱,根据4种模式表达谱构建了4个基因间共表达网络,筛选出29个睾丸发育和精子发生的关键基因。随机选取13个基因（CA3,APOH,MYOC,CATSPER4,SYT6,SERPINA10,DAZL,ADIPOR2,RAB13,CEP41,SPAG4,ODF1和FRG1）对mRNA测序数据进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与RNA-seq结果趋于一致,证明了mRNA测序数据的准确性。3.不同月龄小尾寒羊睾丸miRNA表达谱分析:成功构建了2月龄,6月龄和12月龄小尾寒羊睾丸miRNA文库,2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs12月龄睾丸中分别鉴定出差异表达绵羊已知miRNA:5个,1个和4个;差异表达novel miRNA:132个,105个和24个。选取6个差异表达绵羊已知miRNA（oar-miR-379-5p,oar-miR-665-3p,oar-miR-200b,oar-miR-409-3p,oar-miR-495-3p和oar-miR-200c）和6个差异表达novel miRNA（has-miR-3592-5p,has-miR-6820-3p,has-miR-3615,mmu-miR-1957b,mmu-miR-182-3p和mmu-miR-1929-3p）对miRNA测序数据进行qRT-PCR验证,qRT-PCR结果与RNA-seq测序结果趋于一致,证明了miRNA测序数据的准确性。4.差异表达miRNA靶基因预测:结合miRNA与mRNA结果,对2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs 12月龄睾丸差异表达miRNA进行靶基因预测,差异表达绵羊已知miRNA分别得到68个,1个和9个靶基因,差异表达novel miRNA分别得到363个,168个和29个靶基因。靶基因的GO和pathway分析表明,2月龄vs 6月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显着富集到细胞凋亡,减数分裂I期,顶体反应等100个生物过程及Hedgehog和Wnt等11条信号通路;6月龄vs 12月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显着富集到多细胞生物生殖,精卵结合,单受精和蛋白水解4个生物过程;2月龄vs 12月龄睾丸差异表达绵羊已知miRNA的靶基因显着富集到腺苷代谢,嘌呤碱基代谢及核苷酸代谢等17个生物过程及核黄素代谢和花生四烯酸代谢等4条信号通路。5.睾丸发育和精子发生关键miRNA及其靶基因筛选验证:构建了3个miRNA-靶基因调控网络,基于GO和KEGG分析,筛选出睾丸发育和精子发生关键oarmiR-379-5p及其候选靶基因WNT8A和oar-miR-665-3p及其候选靶基因CCIN。双荧光素酶报告基因检测系统结果证明了WNT8A是oar-miR-379-5p的靶基因,CCIN可能不是oar-miR-665-3p的靶基因。
李国辉[6]（2019）在《金茅黑鸡A系胸肌转录组特征及对重要肉用性状的影响》文中指出生长、屠宰及肉品质性状是肉鸡产业重点关注的性状,生长速度、产肉性能及肉品质直接影响产业的经济效益。随着科技的飞速发展,传统育种方法与现代生物技术相结合,将大大缩短育种周期,这也成为当前育种工作的重点。目前关于肉鸡生长发育规律和经济性状遗传机理的研究越来越多,研究的成果正逐步解析这些性状形成的分子奥秘。因此,针对鸡复杂的性状选择合适的研究方法成为科研工作者突破创新必经之路。RNA-seq技术在转录组学研究方面,具有高效快捷、精确度高、技术成本相对较低的优点,可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行全局性检测,它不仅能够分析转录本结构和表达模式,而且还能精确识别cSNP（编码序列单核苷酸多态性）以及可变剪接位点,因此,被认为是研究复杂性状最有效的工具之一。本研究以金茅黑鸡（A系）为试验动物,在生长期采取2周龄、6周龄、10周龄（接近生长拐点）和14周龄（上市日龄）胸肌样本,利用RNA-seq测序和基因共表达研究方法,探索金茅黑鸡生长过程中全基因组范围内基因表达的变化情况,筛选出不同生长阶段特异性基因;在14周龄对金茅黑鸡进行群体屠宰,采取胸肌组织,测定体重、屠宰性状和肉品质性状并进行转录组关联分析,以期揭示影响金茅黑鸡A系复杂性状的分子遗传标记以及遗传机理,为金茅黑鸡生长发育规律以及重要肉用性状形成的分子机制提供参考依据。主要研究结果如下:1.金茅黑鸡生长规律的研究发现Compertz模型拟合金茅黑鸡生长曲线的拟合度达到0.999以上,确定金茅黑鸡生长拐点为11.12周龄,拐点体重为979.6g,该模型下的拟合结果与金茅黑鸡生长的实测值较为接近。2.对4个生长阶段两两比较RNA-seq测序结果共发现差异表达基因2341个,其中上调基因930个,下调基因1411个。W2vsW14的差异基因最多共699个,W2vsW6的差异基因最少共107个（FC≥2,FDR<0.05）。3.在不同生长时期,利用基因共表达分析鉴定了 4个时期的阶段特异性模块,每个时期鉴定出特异性模块1个,对特异性模块内的重要基因进行功能富集分析,发现2周龄特异性模块基因在ECM-受体相互作用、肾素-血管紧张素系统和ErbB信号通路均显着富集（P<0.05）。在6周龄模块中,吞噬体、肌动蛋白细胞骨架的调控和MAPK信号通路显着富集（P<0.05）。在10周龄模块中,吞噬体、TGF-β信号通路和MAPK信号通路显着富集（P<0.05）。在14周龄模块中,ECM受体相互作用、粘着斑和胰岛素信号通路显着富集（P<0.05）。这些pathway在金茅黑鸡生长和胸肌发育过程中发挥着重要的调控作用。4.四个生长阶段特异性模块中,将FGF22、NRG1和SCD等作为2周龄金茅黑鸡生长发育相关的重要基因,FGF16、APLNR1和NGFR等作为6周龄生长发育相关的重要基因,FGF10、SOCS2、CTSG作为10周龄生长发育相关的重要基因,ACSL1、PRKCE和PP1R3C作为14周龄生长发育相关的重要基因。对这些基因的功能分析发现,每个生长阶段不同的基因起到重要的调控作用。5.14周龄体重转录组关联分析结果共发现9个显着相关的表达基因,包括BRDT、BPIFB4、NUP107、CFAP65、MC4R和CCDC152等。MC4R基因作为影响体重的候选基因,对金茅黑鸡的生长发育起到了重要的调控作用。NUP107基因作为影响体重和屠体重的共同候选基因,它通过调节核质间的物质运输,参与生物的多种生长发育过程。CCDC家族基因在关联分析中被鉴定出来,CCDC152基因与14周龄体重也显着相关。6.与屠宰性状显着相关的基因共发现28个,其中与半净膛重显着相关的基因有SRP68、PAXIP1,与全净膛显着相关的基因GAK,与头重显着相关的基因有SPAG4、ASB2和PKHD1等,与翅重显着相关的基因有GAK、NSUN6和C70RF72等。GAK基因作为翅重和全净膛重显着相关的共同候选基因,在调节受体运输中以及受体信号和功能方面起着关键作用,可能影响金茅黑鸡生长后期的翅重和全净膛重。CCDC家族的其它基因例如CCDC89基因与头重显着相关,CCDC65与肌胃重显着相关。ACSL4基因和肝重、脾重显着相关,可以作为肝重、脾重的候选基因进一步研究。7.肉品质性状的转录组关联分析结果显示FFAR4和TXK等基因作为肌苷酸含量的候选基因,待进一步研究。PLEKHS1、MUC等基因的表达可能影响肉色。在系水力的研究中,LHX9、SPDEF、GRXCR1等基因作为系水力的候选基因,但在家禽的研究中未见有报道。肌肉pH值的候选基因方面,NPY、POMC、FGF20、MGAT4C和GUK1基因鲜有报道,这些基因在调节脂类代谢、糖代谢过程和磷酸二酯酶水解同时可能影响肌肉pH值的变化。HS6ST3、EDAR基因作为肌肉剪切力（嫩度）的候选基因,与肌肉纤维和肌间脂肪的沉积有关进而间接影响肌肉的剪切力。
赵鲜红[7]（2016）在《TALEN介导的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠的表型研究》文中研究说明研究报道,foxo3a在水牛、猪、鼠类卵泡发育启动方面起着重要作用,foxo3a-/-雌鼠会出现早期全球卵巢卵泡募集,随后会出现卵巢内卵母细胞提前耗尽,造成雌鼠出现早期卵巢功能衰竭和继发性不孕症。自然突变ALK6的Booroola羊即FecB突变类型,单拷贝突变（基因型B+）母羊多产1.11羔,双拷贝突变（基因型BB）增加1.40-1.50只羊羔。故本研究以51bpfoxo3a基因敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠为模型,观察其对小鼠产仔数及相关基因表达模式的影响。TALEN-foxo3a基因编辑小鼠：建立了TALEN-foxo3a基因编辑小鼠（缺失51bp）的PCR鉴定方法,琼脂糖凝胶电泳PCR产物,foxo3a-/-基因编辑小鼠602bp单一条带,野生小鼠653bp单一条带,foxo3a-/+小鼠602bp和653bp两条带。应用T7E1酶切断基因编辑切口,对PCR产物进行酶切鉴定,可以观察到foxo3a-/+小鼠产生3条带,foxo3a-/-基因编辑小鼠与野生型小鼠为单一大小不同条带。进一步分析653bp的野生型小鼠基因组序列酶切位点含有第270位、第285位和第543位3个PSTI酶切位点,因此野生型小鼠的PCR产物可酶切为110bp和260bp左右的两条带；单敲小鼠的DNA序列能酶切为543bp、110bp和260bp左右的三条带；双敲小鼠DNA序列仅能酶切为543bp和110bp两条带。生物信息分析显示酶切的51bp中恰好包含了foxo3a的第32位苏氨酸位点,一个重要的磷酸化位点。选择foxo3a-/+（?）foxo3a-/+的组合进行交配,对后代鼠进行PCR电泳、PCR加酶切以及测序鉴定显示：后代总生仔数43只,其中单敲阳性数位24只,单敲阳性率为55.81%,双敲阳性数位9只,双敲阳性率为20.93%,总阳性率为76.74%,阳性率符合孟德尔遗传定率。选择鉴定出foxo3a-/-母鼠,对其产仔数进行统计,共统计4窝,平均生仔数为7±1.02a,显着低于野生小鼠9.71±0.71（P<0.01）。单敲小鼠foxo3a-/+产仔数共统计13窝,平均生仔数为7.38±0.54只,亦显着低于野生型小鼠（P<0.05）。单敲小鼠和野生型小鼠交配共统计生仔数8窝,平均生仔数为7.88±0.35只。利用SPSS分析结果显示：相对于野生型小鼠,双敲小鼠产仔数显着下降（P=0.013）,单敲小鼠产仔数也显着下降（P=0.015）,双敲小鼠和单敲小鼠产仔数差异不显着（P=0.674）。水牛ALK6点突变FecB基因转基因小鼠：为了探讨ALK6点突变FecB基因是否能够提高水牛繁殖力,本实验以水牛源ALK6点突变转基因小鼠为模型,观察了其产仔数和基因表达变化情况。结果显示：小鼠和水牛ALK6基因编码的氨基酸个数相同均为502个,均无信号肽,分子质量分别为56.9444Kda和56.9234Kda,等电点分别为7.48和7.78,亚细胞定位均在质膜,在374位都有一个磷酸化位点,第24位、第109位和第284位均有糖基化修饰位点。水牛源ALK6点突变转基因小鼠平均生仔数为11.6±0.91只,比野生型小鼠平均生仔数9.71±0.71只多1.89只,但两者统计学差异不显着（P=0.297,P>0.05）。QRT-PCR定量结果显示水牛源ALK6点突变转基因小鼠卵巢和睾丸组织中的小鼠ALK6基因相对野生型小鼠表达量均显着下降（P<0.05）。水牛源ALK6点突变转基因小鼠卵巢和睾丸中水牛ALK6基因相对于鼠内源ALK6基因表达量均较低。在水牛源ALK6点突变转基因小鼠的卵巢和睾丸中,小鼠ALK6基因和水牛ALK6基因表达量之和均低于野生型小鼠卵巢和睾丸中小鼠本身ALK6基因。结论：水牛源ALK6突变转基因小鼠产仔数有增加,但差异不显着,这与转基因小鼠卵巢中ALK6基因表达的下调有一定的联系。结论：本研究为阐明foxo3a和FecB基因参与哺乳动物繁殖效率的分子机制研究奠定了基础。
吕洋[8]（2016）在《正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析》文中认为机体维持正常的生理机能和健康,需要控制体内代谢平衡。一些重要的转录因子可以直接或间接的影响营养和代谢链,如胆固醇、脂质、葡萄糖和胰岛素等可以快速改变基因表达的程序,从而维持代谢平衡。microRNAs（miRNAs）可以调控动物多种生理生化活动,在基因表达的转录水平或转录后水平表现为重要的调控分子,miRNAs可能也参与调控体细胞克隆动物和转基因克隆动物的表观遗传。利用Solexa测序技术,分别检测并分析2头体内受精（in vivo fertilization,Ferti）牛、2头克隆牛（somatic cell nuclear transfer,SCNT）和2头转fat-1基因牛（transgenic, TG）的成纤维细胞中的miRNA表达谱,共建立了6个miRNAs文库。利用Mireap软件,分析miRNA的表达差异,探讨成纤维细胞中miRNAs的表达规律,并预测了差异miRNAs调控的靶基因。通过基因GO （Gene ontology）数据库富集分析和全基因组及代谢途径数据库（KEGG）通路分析,研究了这些靶基因参与的生物学通路,初步揭示了体内受精、克隆和转基因来源的牛中的miRNA表达和靶向基因之间的关系。结果表明：1.运用miRNAs测序技术,共检测了367个已知miRNAs,其中83个、19个和23个已知miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达,14个已知miRNAs在三者中共同表达；新发现了178个数据库未公布的miRNAs,其中17个、1个和4个新的候选miRNAs分别在体内受精、克隆和转fat-1基因牛中特异性表达,1个新的候选miRNA在三者中共同表达。2.通过筛选体内受精、克隆和转fat-1基因牛成纤维细胞中的差异表达miRNA,发现成纤维细胞中存在一系列上调和下调的miRNA。通过Real time RT-PCR方法检测、验证和比较体内受精、克隆和转基因组三组中表达量前10个miRNA的差异,同时对表达量高的2个新的候选miRNA进行荧光定量PCR验证,并预测部分高表达的候选miRNA结构。GO富集分析和KEGG通路分析显示,差异表达miRNA对应靶基因显着富集的通路主要在代谢通路、MAPK信号通路、钙离子信号通路、嘌呤代谢通路、泛素介导的蛋白水解通路、嘧啶代谢通路和细胞周期通路等7个生物学通路。3.通过生物信息学软件预测FGF10、LPL和ATGL可能作为bta-miR-21的靶基因,荧光定量PCR验证后发现,与克隆牛和转基因牛成纤维细胞相比,FGF10和ATGL的mRNA在体内受精牛成纤维细胞中表达显着降低,而bta-miR-21在体内受精牛成纤维细胞中表达显着升高,初步认为bta-miR-21与FGF10和ATGL的表达存在负调控的关系。4.microRNA的功能鉴定。利用在体外水平过表达或敲减bta-miR-21,检测靶基因的表达变化,进一步证明bta-miR-21与FGF10和ATGL的靶向关系,bta-miR-21可能通过调控FGF10和ATGL的表达发挥作用。结论：1.本研究建立了遗传背景一致,不同来源胚胎（体内受精、克隆和转fat-1基因牛）成纤维细胞的miRNA文库,获得了可能影响克隆、转基因克隆后代发育的miRNA信息,为深入揭示克隆与转基因克隆胚胎发育异常的机制提供了重要参考。2.本研究发现bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL在体内受精、克隆和转fat-1基因牛胎儿成纤维细胞中具有调控作用,推测bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL可能是克隆与转基因克隆胚胎发育调控的重要靶标。
杨严格[9]（2016）在《转人β防御素3基因牛乳食用安全性评价 ——对小鼠生殖器官生长发育及机能的影响》文中研究说明转基因技术自问世以来已经被广泛应用于生命科学的各个研究领域,特别是在动物抗病育种方面已经取得了大的进展,西北农林科技大学农业部动物生物技术重点实验室近年在动物抗病育种研究方面进行了不断探索,成功研制出携带人β防御素3（Humamβ-defensin-3,HBD-3）基因的克隆牛,其在后期的相关研究中表现出良好的抗病潜力及相对高附加值的产品。但截至目前,有关转HBD-3基因牛源性食品的生物安全性检测方面的研究尚显不足,转HBD-3基因牛源性的相关食品的下游开发与应用亟需相关的的食品安全性毒理学评价及生物安全性检测数据支撑,这是转基因技术由实验室走向日常应用的必经之路,也是促进转基因技术发展的必要手段。本研究以课题组前期培育的转HBD-3基因牛乳为研究材料,参照世界经济合作与发展组织（OECD）对于转基因食品安全的检测提出的实质等同性原则和2003年由中华人民共和国卫生部发布的关于食品安全监测的国家标准——GB15193.13-2003,通过将转基因牛乳掺入小鼠日粮中进行饲喂的方法,对4周龄断乳C57小鼠进行90天小鼠经口亚慢性毒性试验。根据鼠粮成分的不同,将试验鼠分为高剂量转基因牛乳组、高剂量普通牛乳组和经济饲料组共三组。在试验期间,通过对各组小鼠进行体重测量、生殖器官指数测定、生殖器官大体及组织形态观察以及雄性小鼠附睾头三精子数目统计来评价转基因牛乳对小鼠生殖器官生长发育的影响;通过放射免疫分析法测定各组小鼠血清中生殖激素水平,实时定量PCR技术检测各组小鼠生殖器官中生殖功能相关基因及相关癌基因的表达情况,阴门观察结合阴道脱落细胞涂片法观察雌性小鼠发情周期各阶段的细胞学变化及时程,以评价日粮中添加转HBD-3基因牛乳对小鼠生殖功能的影响,结果如下:1.转HBD-3基因牛乳组、普通牛乳组和对照组小鼠的体重、生殖器官指数、雄性小鼠附睾头精子数及相对计数等指标彼此之间均无显着性差异,各组小鼠生殖器官大体形态及其组织学结构均显示正常。2.转HBD-3基因牛乳组、普通牛乳组和对照组雄鼠血清FSH、LH、T水平以及雌鼠血清E2、FSH、LH水平各组之间均无显着性差异（P>0.05）。3.实时定量PCR检测结果显示,短时期饲喂转HBD-3基因牛乳对小鼠睾丸组织中睾酮合成相关基因（CYP11a1,Cox7a2,Hsd3b7和Star）、卵巢组织调控卵泡生长发育以及卵巢功能的相关基因（Esr,GDF-9和BMP-15）以及癌变相关基因Msmb和Cox-2的表达均无影响（P>0.05）。4.通过阴道外观法和阴道涂片染色观察法对各组小鼠的发情周期进行检测,结果显示,各组小鼠发情周期并无紊乱,且各组小鼠在发情周期的4个不同阶段均呈现出相应的细胞学变化、各自持续时间也无明显差异。结论:短时期内对小鼠饲喂转HBD-3基因牛乳对小鼠生殖器官的生长发育、血清中生殖激素水平、主要生殖器官中生殖功能相关基因和相关癌基因表达以及小鼠发情周期时程及周期性均无影响,提示以C57小鼠进行的90天转HBD-3基因牛乳的经口亚慢性毒性试验证实其对小鼠生殖功能是安全的。
王丙萍[10]（2014）在《靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究》文中研究表明FGF5基因是FGF基因家族中的一员,在毛发生长周期中具有重要的调控作用。FGF5基因突变可以导致毛发生长周期中生长期的延长,从而使毛发的长度增加。本研究拟靶除内蒙古白绒山羊的FGF5基因,利用核移植方法创造高产绒量山羊。以我区的白绒山羊为对象,建立胎儿皮肤成纤维细胞系；设计pLOX-EGFP-FGF5、 RNAi-FGF5、TALEN-FGF5,三种FGF5基因靶除载体；分别将三种敲除载体用脂质体介导法、电转法、转染仪介导法转染到绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选阳性细胞并扩繁；以其为核供体构建转基因山羊重构胚并移植到同步发情的受体羊输卵管内,制造转基因克隆山羊并鉴定。1.根据已经公布的牛和山羊的FGF5基因序列设计引物克隆内蒙古白绒山羊的FGF5基因,发现FGF5基因具有三个外显子和两个内含子,cDNA长度为924bp。根据基因序列设计并构建合成3种靶除绒山羊FGF5基因的载体,分别为基因打靶载体pLOX-EGFP-FGF5,RNA干扰载体RNAi-FGF5-1#和RNAi-FGF5-2#,以及TALEN载体TN000201、TN000202、TN000204。测序及酶切鉴定结果表明载体构建正确并可用。2.采用组织块种植法分离培养了9个绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞系；通过G418敏感度实验,确定了各个细胞系的最佳G418筛选浓度,并选择对G418抗性较好的两个细胞系goat6#和goat9#作为筛选转基因阳性细胞的细胞系；分别应用脂质体介导法、电转法、转染仪介导法将3种载体转染到绒山羊胎儿成纤维细胞中,最终筛选出3种转基因阳性细胞系。3.以筛选鉴定得到3种转基因阳性细胞系为核供体,分别构建转基因克隆胚胎。应用基因打靶技术敲除FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植46只受体山羊,妊娠4只,妊娠率为8.7%。1只羔羊存活4天后死亡,2只羔羊出生后几分钟死亡,目前健康存活羔羊1只。应用RNA干扰技术沉默FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植143只受体山羊,妊娠24只,妊娠率为16.78%,但胎儿均发生流产。应用TALEN技术敲除FGF5基因的转基因克隆胚共同步移植62只受体山羊,经B超检测发现有5只受体羊怀孕,妊娠率为8.06%。4.应用基因打靶技术敲除FGF5基因的转基因克隆羔羊经PCR鉴定,检测出编号为083的羔羊发生了FGF5基因的双敲除,目前健康状况良好。其余三只羔羊为非转基因的克隆羊。在应用RNA干扰技术沉默FGF5基因中,通过实时荧光定量PCR对流产胎儿进行鉴定,结果表明这些胎儿FGF5基因的表达量均发生了明显的降低。应用TALEN技术靶除FGF5基因的转基因克隆羔羊,经PCR产物测序鉴定,结果表明4只新生羔羊FGF5基因的靶标区域均缺失了两个碱基,造成了FGF5基因的移码突变。
二、PCR技术在转人肾素基因小鼠繁殖保存及育种中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR技术在转人肾素基因小鼠繁殖保存及育种中的应用（论文提纲范文）
（1）Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 Tβ4基因促进毛发生长的研究进展 |
| 1.1 Tβ4的分子和生化特性 |
| 1.2 Tβ4在细胞内的定位 |
| 1.3 Tβ4的功能研究进展 |
| 1.3.1 肌动蛋白结合蛋白 |
| 1.3.2 角膜修复及抗炎 |
| 1.3.3 加速皮肤伤口愈合 |
| 1.4 Tβ4促进毛发生长的研究进展 |
| 1.4.1 Tβ4通过激活毛囊干细胞促进毛发生长 |
| 1.4.2 过表达Tβ4促进牙齿异常发育及促进毛发生长 |
| 1.4.3 Tβ4 激活P38/ERK/AKT信号通路促进毛发生长 |
| 1.4.4 Tβ4 激活Wnt/β-catenin/ Lef-1 信号通路 |
| 1.4.5 Tβ4过表达增加绒山羊次级毛囊个数 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 Tβ4基因定点整合绒山羊的检测 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的鉴定及健康状况评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 试剂耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Southern blot检测 |
| 2.2.2 Real-time PCR检测 |
| 2.2.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.2.4 脱靶分析 |
| 2.2.5 基因位点检测 |
| 2.2.6 生长状况监测 |
| 2.2.7 血常规检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Southern blot检测 |
| 2.3.2 Real-time PCR检测 |
| 2.3.3 免疫细胞化学检测 |
| 2.3.4 脱靶分析 |
| 2.3.5 基因位点检测 |
| 2.3.6 生长状况监测 |
| 2.3.7 血常规检测 |
| 2.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊产绒性能的检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 试剂耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.2.2 免疫组织化学 |
| 3.2.3 绒样检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 石蜡切片及HE染色 |
| 3.3.2 免疫组织化学 |
| 3.3.3 绒样检测 |
| 3.4 讨论 |
| 第三节 Tβ4基因定点整合绒山羊的扩繁及后代的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器设备 |
| 4.1.2 试剂耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Tβ4基因定点整合绒山羊的超数排卵 |
| 4.2.2 胚胎移植 |
| 4.2.3 子一代PCR检测 |
| 4.2.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.2.5 皮肤组织石蜡切片及HE染色 |
| 4.2.6 免疫组化 |
| 4.2.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.8 血常规检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 超数排卵 |
| 4.3.2 胚胎移植 |
| 4.3.3 子一代PCR检测 |
| 4.3.4 子一代Real-time PCR检测 |
| 4.3.5 石蜡切片及HE染色 |
| 4.3.6 免疫组化 |
| 4.3.7 绒山羊各组织器官Tβ4 基因m RNA表达水平的检测 |
| 4.3.8 血常规检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第三章 Tβ4基因促进绒山羊绒毛生长的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 Tβ4基因定点整合绒山羊的转录组学分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.2.2 质控数据统计 |
| 5.2.3 序列比对分析 |
| 5.2.4 转录组质量评估 |
| 5.2.5 转录本组装 |
| 5.2.6 转录组功能注释 |
| 5.2.7 表达量分析 |
| 5.2.8 表达量差异统计 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绒山羊皮肤样本RNA的提取 |
| 5.3.2 质控数据统计 |
| 5.3.3 序列比对分析 |
| 5.3.4 转录组质量评估 |
| 5.3.5 转录本组装 |
| 5.3.6 表达量差异统计 |
| 5.3.7 差异表达基因的分析 |
| 5.3.8 差异表达基因的验证 |
| 5.4 讨论 |
| 第二节 Tβ4基因定点整合绒山羊的蛋白组学分析及关联分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 仪器设备 |
| 6.1.2 试剂耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 皮肤组织总蛋白提取 |
| 6.2.2 总蛋白质浓度测定 |
| 6.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 6.2.4 还原烷基化和酶解 |
| 6.2.5 iTRAQ标记 |
| 6.2.6 高p HUPLC第一维分离 |
| 6.2.7 液相串联质谱 |
| 6.2.8 数据质控评估 |
| 6.2.9 全蛋白功能注释 |
| 6.2.10 差异蛋白分析 |
| 6.2.11 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.2.12 关联分析的验证 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 蛋白浓度测定 |
| 6.3.2 数据质控评估 |
| 6.3.3 差异蛋白统计 |
| 6.3.4 差异蛋白分析 |
| 6.3.5 蛋白组与转录组关联分析 |
| 6.3.6 关联分析的验证 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及发明专利 |
（2）利用CRISPR/Cas9技术制备牛IGF2基因编辑胚胎（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 西门塔尔牛简介 |
| 1.2 基因编辑发展及安全管理 |
| 1.2.1 基因编辑发展概述 |
| 1.2.2 牛基因编辑概述 |
| 1.2.3 基因编辑产品的安全管理 |
| 1.3 骨骼肌的发育 |
| 1.3.1 骨骼肌形成及发育过程 |
| 1.3.2 骨骼肌发育的分子机理 |
| 1.4 IGF2基因在遗传育种中的研究进展 |
| 1.4.1 IGF2基本概况 |
| 1.4.2 IGF2表达调控方式 |
| 1.4.3 IGF2对克隆效率的影响 |
| 1.4.4 IGF2与家畜家禽生产性状的关系 |
| 1.4.5 IGF2基因编辑研究成果 |
| 1.5 试验目的及意义 |
| 第二章 西门塔尔IGF2突变的阳性细胞筛选及验证 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 试验结果与分析 |
| 2.2.1 牛IGF2 基因编辑位点筛选及sg RNA设计 |
| 2.2.2 牛IGF2基因编辑载体构建 |
| 2.2.3 牛IGF2基因编辑载体细胞转染及效率检测 |
| 2.2.4 西门塔尔IGF2基因纯合突变的阳性细胞筛选 |
| 2.2.5 ZBED6 结合位点敲除对IGF2 表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 西门塔尔IGF2突变克隆胚胎的制备 |
| 3.1 试验材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验步骤 |
| 3.2 试验结果与分析 |
| 3.2.1 克隆胚胎制备和鉴定 |
| 3.2.2 质粒骨架残留鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（3）基于基因组信息对金华猪种质特性及其保护、利用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文章部分缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 金华猪概况 |
| 1.1.1 产地分布及品种形成 |
| 1.1.2 种质特性 |
| 1.1.3 保种现状 |
| 1.1.4 研究进展 |
| 1.1.5 主要问题 |
| 1.2 猪的基因组研究 |
| 1.2.1 猪基因组的组装 |
| 1.2.2 基因组测序在猪中的应用 |
| 1.3 分子种质特性研究方法 |
| 1.3.1 遗传变异检测 |
| 1.3.2 基因组结构分析 |
| 1.3.3 基因组功能注释 |
| 1.3.4 选择信号分析 |
| 1.4 家畜遗传资源的保护 |
| 1.4.1 家畜遗传多样性 |
| 1.4.2 遗传多样性检测方法 |
| 1.4.3 在分子水平上评估遗传多样性的指标 |
| 1.4.4 保种相关理论和方法 |
| 1.4.5 保种方式 |
| 1.5 遗传资源的利用 |
| 1.5.1 利用的必要性 |
| 1.5.2 利用的主要途径 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 金华猪在遗传资源分类中的地位 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物与样品 |
| 2.1.2 主要试剂及其来源 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 基因组DNA的提取及质量检测 |
| 2.1.5 文库的构建及测序 |
| 2.1.6 测序数据分析及存贮 |
| 2.1.7 群体及SNPs检测 |
| 2.1.8 群体遗传距离分析 |
| 2.1.9 群体遗传分化 |
| 2.1.10 群体遗传结构分析 |
| 2.1.11 群体迁移分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 测序数据分析结果 |
| 2.2.2 SNPs的数量和频率分布 |
| 2.2.3 金华猪与其它群体间的遗传距离 |
| 2.2.4 群体间遗传分化结果 |
| 2.2.5 群体遗传结构结果 |
| 2.2.6 群体迁移分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 金华猪的基因组测序及遗传变异检测 |
| 2.3.2 金华猪在遗传资源分类的地位 |
| 2.4 小结 |
| 3 金华猪的分子种质特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 基因组结构分析 |
| 3.1.2 基因组功能分析 |
| 3.1.3 金华猪群体内选择信号检测 |
| 3.1.4 群体间选择信号检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 SNPs在基因组上的分布 |
| 3.2.2 群体单倍型块构建 |
| 3.2.3 群体ROH分布 |
| 3.2.4 金华猪群体内选择信号分析 |
| 3.2.5 群体间选择信号分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 基因组结构上的分析 |
| 3.3.2 选择信号分析 |
| 3.4 小结 |
| 4 金华猪易感猪支原体肺炎遗传机制的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 生物信息学挖掘方法 |
| 4.1.2 全基因组关联分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 生物信息学挖掘结果 |
| 4.2.2 全基因组关联分析结果 |
| 4.2.3 候选基因的验证 |
| 4.3 小结 |
| 5 金华猪保种效果分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 基于系谱的近交系数计算 |
| 5.1.2 繁殖性能育种值评估 |
| 5.1.3 在群金华猪近交系数、亲缘系数计算和群体结构分析 |
| 5.1.4 在群金华猪群体有效含量估计 |
| 5.1.5 群体遗传多样性分析 |
| 5.1.6 遗传近交程度估计 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 金华猪历年近交系数变化 |
| 5.2.2 金华猪历年繁殖性能变化 |
| 5.2.3 在群金华猪近交系数、亲缘系数和群体结构 |
| 5.2.4 在群金华猪群体有效含量 |
| 5.2.5 群体遗传多样性分析结果 |
| 5.2.6 群体近交程度估计 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 金华猪的最宜杂交配套模式 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 杂种优势预测方法 |
| 6.1.2 配合力测定试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 杂种优势预测结果 |
| 6.2.2 配合力测定试验结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 杂种优势预测 |
| 6.3.2 配合力测定试验 |
| 6.4 小结 |
| 7 结语 |
| 7.1 具体工作及结果 |
| 7.2 论文创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 论文中的附表 |
| 附录2 论文中其它附件 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间取得的主要成果 |
| 学术论文 |
| 专利 |
（4）中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）竞争行为相关基因的筛选、克隆及表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 中国明对虾竞争行为概述 |
| 1.2 基因测序技术概述 |
| 1.2.1 第1代测序技术 |
| 1.2.2 第2代测序技术 |
| 1.2.3 第3代测序技术 |
| 1.2.4 第4代测序技术 |
| 1.3 基因克隆概述 |
| 1.4 竞争相关基因的研究现状 |
| 1.4.1 钙调神经磷酸酶基因 |
| 1.4.2 钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶互作蛋白基因 |
| 1.4.3 小结 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 基于比较转录组对中国明对虾竞争行为相关候选基因的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 中国明对虾竞争效应实验 |
| 2.1.2 定量分析取样实验 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 2.2.2 数据分析 |
| 2.2.2.1 测序原始数据组装 |
| 2.2.2.2 转录组数据注释 |
| 2.2.2.3 差异表达分析 |
| 2.2.2.4 差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 2.2.3 转录组数据验证 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 测序原始数据组装 |
| 2.3.2 转录组数据注释 |
| 2.3.3 差异表达基因筛选 |
| 2.3.4 差异基因GO富集分析 |
| 2.3.5 差异基因KEGG富集分析 |
| 2.3.6 Real time RT-PCR验证转录组数据 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 中国明对虾calcineurin基因的克隆及其在竞争行为中作用的初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 CN基因开放阅读框的验证 |
| 3.1.2.2 总RNA的提取及c DNA的合成 |
| 3.1.2.3 CN-B基因的RACE克隆 |
| 3.2.4 FcCN-A和 FcCN-B cDNA序列的生物信息学分析 |
| 3.2.5 FcCN-A和 FcCN-B的表达定量分析 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 CN基因ORF序列的验证结果 |
| 3.2.2 基因克隆与生物信息学分析 |
| 3.2.3 FcCN-A和 FcCN-B基因的同源性分析 |
| 3.2.4 FcCN-A和 FcCN-B基因的系统进化分析 |
| 3.2.5 FcCN-A和 FcCN-B编码蛋白三级结构的预测 |
| 3.2.6 FcCN-A和 FcCN-B基因在竞争强弱不同对虾中不同组织的定量分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 中国明对虾Caskin-2 基因的克隆及其在竞争行为中作用的初探 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 总RNA的提取 |
| 4.1.3 FcCK基因开放阅读框的验证 |
| 4.1.4 FcCK基因的RACE克隆 |
| 4.1.5 FcCK cDNA序列的生物信息学分析 |
| 4.1.6 FcCK的表达定量分析 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 FcCK基因ORF序列的验证结果 |
| 4.2.2 基因克隆与生物信息学分析 |
| 4.2.3 FcCK基因的同源性分析 |
| 4.2.4 FcCK基因的系统进化分析 |
| 4.2.5 FcCK编码蛋白三级结构的预测 |
| 4.2.6 FcCK基因在竞争强弱不同对虾中不同组织的定量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 小结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）小尾寒羊公羊繁殖性能研究及其睾丸发育miRNA-mRNA表达谱联合分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物睾丸发育和精子发生 |
| 1.1 睾丸组织学结构 |
| 1.2 精子发生 |
| 1.3 精子发生的调控 |
| 第二章 睾丸发育和精子发生相关基因的研究进展 |
| 2.1 细胞周期相关基因 |
| 2.2 减数分裂相关基因 |
| 2.3 精子形成相关基因 |
| 2.4 凋亡相关基因 |
| 第三章 睾丸发育和精子发生相关miRNAs的研究进展 |
| 3.1 miRNA概述 |
| 3.2 睾丸发育相关调控miRNA |
| 3.3 精子发生相关调控miRNA |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 小尾寒羊公羊繁殖性能的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 不同月龄小尾寒羊睾丸组织mRNA表达谱分析及验证 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 不同月龄小尾寒羊公羊睾丸组织miRNA-mRNA表达谱联合分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 oar-miR-379-5p和oar-miR-665-3p的候选靶基因验证 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）金茅黑鸡A系胸肌转录组特征及对重要肉用性状的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 肌肉生长发育规律的研究进展 |
| 1.1 家禽肌纤维的形成 |
| 1.2 影响禽肌肉生长发育机制的因素 |
| 1.2.1 营养因素对肌肉生长的调控 |
| 1.2.2 非营养因素对肌肉生长的调控 |
| 1.3 肌纤维生长发育的分子机制 |
| 1.3.1 生肌调节因子(MRFs) |
| 1.3.2 胰岛素样生长因子(IGFs) |
| 1.3.3 肌球蛋白重链MYHC |
| 2 家禽重要经济性状的研究进展 |
| 2.1 体重分子机制的研究 |
| 2.2 屠宰性状分子机制的研究 |
| 2.3 肉品质分子机制的研究 |
| 3 转录组测序(RNA-seq)技术的研究进展 |
| 4 基因共表达研究进展 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 第二章 金茅黑鸡生长规律及不同生长阶段mRNA表达的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验群体与样本采集 |
| 2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 试验方法与统计分析 |
| 2.3.1 性状数据的获取及处理 |
| 2.3.2 总RNA的提取与质量检测 |
| 2.3.3 RNA-seq文库构建及测序 |
| 2.3.4 测序数据质量评估及预处理 |
| 2.3.5 生物信息学分析 |
| 2.3.6 基因共表达分析 |
| 2.3.7 实时荧光定量PCR验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 金茅黑鸡生长曲线拟合 |
| 3.2 RNA样品质量检测和文库构建 |
| 3.2.1 RNA样品检测 |
| 3.2.2 RNA文库构建 |
| 3.2.3 文库质控 |
| 3.2.4 文库质量评估 |
| 3.3 RNA-seq测序质量评估与质控 |
| 3.3.1 测序碱基质量值分布 |
| 3.3.2 测序质量控制 |
| 3.3.3 RNA-seq数据产出统计 |
| 3.4 RNA-seq数据与参考基因组序列对比分析 |
| 3.4.1 比对效率统计 |
| 3.4.2 不同生长阶段基因表达量分析 |
| 3.5 不同生长阶段差异表达基因分析 |
| 3.5.1 差异表达基因的筛选 |
| 3.6 差异表达基因共表达分析 |
| 3.6.1 基因共表达网络构建及模块检测 |
| 3.6.2 不同生长阶段特异性模块的鉴定 |
| 3.6.3 特异性模块的GO富集分析 |
| 3.6.4 特异性模块的KEGG pathway富集分析 |
| 3.6.5 四个特异性模块的枢纽基因可视化作图 |
| 3.7 共表达差异表达基因RT-qPCR技术验证 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 金茅黑鸡屠宰性状、肉品质转录组关联分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验样本 |
| 2.2 主要仪器及试验试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 肉鸡屠宰测定方法 |
| 2.3.2 胸肌肉品质测定方法 |
| 2.3.3 实验数据分析模型 |
| 2.3.4 总RNA的提取与质量检测 |
| 2.3.5 RNA-seq文库构建及测序 |
| 2.3.6 测序数据质量评估及预处理 |
| 2.3.7 基因表达量和肉品质性状的关联分析 |
| 2.3.8 实时荧光定量PCR验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 性状间的相关性分析 |
| 3.2 RNA-seq数据产出统计 |
| 3.3 基因表达量分析 |
| 3.4 遗传进化分析 |
| 3.5 基因表达量和性状(GEM)的关联分析 |
| 3.5.1 体重候选基因关联分析 |
| 3.5.2 屠宰性状的候选基因关联分析 |
| 3.5.3 肉品质性状的显着表达的基因分析 |
| 3.6 候选基因qRT-PCR技术验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 体重、屠宰性状的候选基因 |
| 4.2 肉品质性状的候选基因 |
| 本章小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 研究的不足之处及下一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 附表一 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
（7）TALEN介导的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠的表型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 文献综述 |
| 前言 |
| 1.1 应用转基因技术改良家畜生产性状的国际研究进展 |
| 1.2 国内转基因动物的研究进展 |
| 1.3 转基因动物的制备方法 |
| 1.3.1 显微注射法 |
| 1.3.2 嵌合体法 |
| 1.3.3 精子载体法 |
| 1.3.4 体细胞核移植(克隆)技术 |
| 1.3.5 RNA干扰技术 |
| 1.4 转基因动物在医药方面的应用 |
| 1.4.1 人类疾病模型方面的运用 |
| 1.4.2 生产动物器官用于人体移植 |
| 1.4.3 转基因动物在农业领域的应用 |
| 1.5 基因编辑技术 |
| 1.6 foxo3a基因研究进展 |
| 1.7 ALK6基因研究进展 |
| 第二部 分试验部分 |
| 第二章 TALEN介导的foxo3a基因敲除小鼠的表型研究 |
| 1 实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 TALEN位点和引物设计 |
| 1.3.2 foxo3a敲除小鼠的制备与PCR鉴定 |
| 1.3.3 foxo3a基因在不同基因型小鼠卵巢和睾丸组织的表达模式研究 |
| 1.3.4 阳性小鼠卵巢组织切片的制作与HE染色观察 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 foxo3a~(-/+)小鼠foxo3a~(-/-)和的鉴定 |
| 2.1.1 普通PCR结果 |
| 2.1.2 PCR产物T7E1酶切和PSTI酶切结果 |
| 2.2 TALEN介导的foxo3a敲除小鼠后代阳性率的统计 |
| 2.2.1 TALEN介导的foxo3a~(-/+)+foxo3a~(-/+)后代阳性鉴定及阳性率统计 |
| 2.2.2 TALEN介导的foxo3a~(-/+)+foxo3a~(+/+)后代阳性鉴定及阳性率统计 |
| 2.2.3 foxo3a基因敲除小鼠后代产仔数的统计 |
| 2.2.4 不同周龄敲除小鼠产仔数变化分析 |
| 2.3 foxo3a基因在敲除小鼠和野生型体内的表达异同 |
| 2.3.1 foxo3a基因在野生型小鼠各组织的表达模式的建立 |
| 2.3.2 foxo3a~(-/+)小鼠卵巢和睾丸中foxo3a基因表达模式 |
| 2.3.3 foxo3a~(-/-)小鼠卵巢和睾丸foxo3a基因表达模式 |
| 2.4 不同基因型小鼠卵巢切片HE染色结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 第三章 水牛源ALK6点突变小鼠的表型研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 生物信息学分析 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.2.4 QRT-PCR反应 |
| 2 结果 |
| 2.1 水牛和小鼠ALK6基因蛋白序列一级结构生物信息学分析 |
| 2.2 水牛和小鼠ALK6基因蛋白序列高级结构生物信息学分析 |
| 2.3 水牛源ALK6点突变转基因小鼠及野生型小鼠生仔数统计分析 |
| 2.4 ALK6在转基因小鼠和野生型体内的表达异同 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（8）正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 克隆与转基因克隆动物研究进展 |
| 1.1.1 动物克隆技术 |
| 1.1.2 动物转基因(TRANSGENIC)技术 |
| 1.2 克隆与转基因克隆动物研究中遇到的问题 |
| 1.2.1 克隆效率低 |
| 1.2.2 胎盘肥大且功能异常 |
| 1.2.3 克隆相关基因的异常表达 |
| 1.2.4 转基因克隆动物存在的问题 |
| 1.3 克隆与转基因动物机理研究进展 |
| 1.4 MIRNA在动物发育调控中的作用 |
| 1.4.1 在动物正常发育中的作用 |
| 1.4.2 在克隆动物中的研究情况 |
| 1.4.3 在转基因动物研究中的情况 |
| 第二章 体内受精牛、克隆牛与转FAT-1基因牛的成纤维细胞中差异MIRNA的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 BTA-MIR-21和候选靶基因在体内受精、克隆和转FAT-1基因牛成纤维细胞表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 BTA-MIR-21与FGF10、ATGL靶向关系的验证 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）转人β防御素3基因牛乳食用安全性评价 ——对小鼠生殖器官生长发育及机能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 转基因技术及其在抗病育种中的应用 |
| 1.1 转基因技术的常用方法 |
| 1.2 动物转基因技术的应用 |
| 1.2.1 动物转基因抗病育种的发展与应用 |
| 1.2.2 转基因生物反应器的应用 |
| 1.2.3 转基因技术在动物疾病模型建立中的应用 |
| 1.2.4 异种器官移植供体研究中对转基因动物的应用 |
| 2 转基因动物食品安全评价 |
| 2.1 安全性评价策略 |
| 2.2 转基因食品存在的安全隐患 |
| 2.2.1 转基因食品的毒性 |
| 2.2.2 转基因食品的致敏性 |
| 2.2.3 携激素类转基因食品 |
| 2.3 我国基于转基因及其食品安全的相关规定 |
| 试验研究 |
| 第二章 转人β防御素3基因牛乳对小鼠生殖器官生长发育的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要仪器与试剂 |
| 2.1.3 乳样采集 |
| 2.1.4 试验分组设计 |
| 2.1.5 试验动物及饲养条件 |
| 2.1.6 试验分析 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 小鼠的生长情况 |
| 2.2.2 小鼠生殖器官指数测定结果 |
| 2.2.3 小鼠生殖器官大体形态观察 |
| 2.2.4 生殖器官组织形态观察 |
| 2.2.5 小鼠附睾头精子相对计数结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 转人β防御素基因牛乳对小鼠生殖激素水平的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要仪器与试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 转人β防御素基因牛乳对生殖器官中发育及癌变相关基因表达的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 睾丸组织中睾酮合成相关基因的表达 |
| 4.2.2 卵巢组织中卵泡发育及卵巢功能相关基因的表达 |
| 4.2.3 癌标记基因的表达情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 转人β防御素基因牛乳对雌性小鼠发情周期的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.1.3 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 动物转基因技术的研究历史及进展 |
| 1.1.1 动物转基因技术研究的初级阶段 |
| 1.1.2 动物转基因技术研究的初级应用阶段 |
| 1.1.3 动物转基因技术研究的飞速发展阶段 |
| 1.2 转基因动物的制备方法及其进展 |
| 1.2.1 传统制备转基因动物的主要方法 |
| 1.2.2 新型发展的高效转基因方法 |
| 1.3 动物转基因技术的应用 |
| 1.3.1 动物转基因技术在基础医学研究领域的应用 |
| 1.3.2 生物反应器 |
| 1.3.3 动物转基因技术在农业生产中的应用 |
| 1.3.4 动物转基因技术存在的问题 |
| 1.4 FGF5在皮肤毛囊中的作用及其研究进展 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 靶除绒山羊FGF5基因载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 试剂及耗材 |
| 2.1.3 载体及菌种 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 靶除绒山羊FGF5基因打靶载体的构建 |
| 2.2.2 靶除绒山羊FGF5基因RNA干扰载体的构建 |
| 2.2.3 靶除绒山羊FGF5基因TALEN载体的构建 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 靶除绒山羊FGF5基因打靶载体的构建 |
| 2.3.2 靶除绒山羊FGF5基因RNA干扰载体的构建 |
| 2.3.3 靶除绒山羊FGF5基因TALEN载体的构建 |
| 2.4 讨论 |
| 3 绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验设备 |
| 3.1.2 试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.2.2 生长曲线的测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绒山羊胎儿成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 3.4 讨论 |
| 4 绒山羊鞭除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验设备 |
| 4.1.2 试剂及耗材 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 应用基因打靶技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.2.2 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.2.3 应用TALEN技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 应用基因打靶技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.3.2 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.3.3 应用TALEN技术靶除FGF5基因细胞系的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 5 靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验设备 |
| 5.1.2 试剂及耗材 |
| 5.1.3 主要试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 山羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.2.2 供体细胞的准备 |
| 5.2.3 受体卵母细胞的准备 |
| 5.2.4 核移植构建重构胚 |
| 5.2.5 重构胚的融合 |
| 5.2.6 融和胚的激活和发育 |
| 5.2.7 胚胎移植 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 山羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.3.2 转基因克隆胚构建中融合条件的摸索 |
| 5.3.3 转基因克隆胚的构建及移植 |
| 5.3.4 应用基因打靶技术靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.3.5 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.3.6 应用TALEN技术靶除FGF5基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.4 讨论 |
| 6 靶除FGF5基因克隆绒山羊的鉴定 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验设备 |
| 6.1.2 试剂及耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 基因组DNA水平上的鉴定 |
| 6.2.2 RNA水平上的鉴定 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 应用基因打靶技术靶除FGF5基因克隆山羊的鉴定 |
| 6.3.2 应用RNA干扰技术靶除FGF5基因克隆山羊的鉴定 |
| 6.3.3 应用TALEN技术靶除FGF5基因克隆山羊的鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
四、PCR技术在转人肾素基因小鼠繁殖保存及育种中的应用（论文参考文献）
- [1]Tβ4基因定点整合绒山羊的检测及该基因对绒毛生长促进作用的机制研究[D]. 李晓聪. 内蒙古大学, 2020(01)
- [2]利用CRISPR/Cas9技术制备牛IGF2基因编辑胚胎[D]. 姚顺. 广西大学, 2020(02)
- [3]基于基因组信息对金华猪种质特性及其保护、利用的研究[D]. 徐忠. 上海交通大学, 2020
- [4]中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）竞争行为相关基因的筛选、克隆及表达分析[D]. 孙犁. 上海海洋大学, 2019(03)
- [5]小尾寒羊公羊繁殖性能研究及其睾丸发育miRNA-mRNA表达谱联合分析[D]. 白曼. 吉林农业大学, 2018(02)
- [6]金茅黑鸡A系胸肌转录组特征及对重要肉用性状的影响[D]. 李国辉. 扬州大学, 2019
- [7]TALEN介导的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6点突变转基因小鼠的表型研究[D]. 赵鲜红. 广西大学, 2016(02)
- [8]正常受精、克隆与转基因牛的成纤维细胞microRNA表达谱分析[D]. 吕洋. 内蒙古大学, 2016(08)
- [9]转人β防御素3基因牛乳食用安全性评价 ——对小鼠生殖器官生长发育及机能的影响[D]. 杨严格. 西北农林科技大学, 2016(09)
- [10]靶除FGF5基因体细胞克隆绒山羊的研究[D]. 王丙萍. 内蒙古农业大学, 2014(01)