一、鸡球虫病细胞介导免疫研究（论文文献综述）
王雅坤[1]（2021）在《EtCab蛋白在鸡球虫入侵中的作用及其重组乳酸菌疫苗免疫保护性研究》文中研究说明鸡球虫是专性胞内原虫,寄生于鸡的肠上皮细胞,引起的鸡球虫病给养禽业造成巨大经济损失。鸡球虫对宿主细胞的粘附和入侵是其完成内生性发育的关键,一系列重要的蛋白质参与鸡球虫的入侵过程,已被证明与入侵相关的球虫蛋白有微线蛋白、棒状体蛋白、一些表面抗原和蛋白激酶等。最近的研究发现,钙结合蛋白也与某些寄生虫的入侵相关,但其在鸡球虫入侵宿主细胞中的作用尚未见报道。疫苗免疫是防治鸡球虫病的有效手段之一,由于使用传统弱毒或强毒球虫疫苗进行免疫存在诸多缺陷,新型鸡球虫疫苗的研发成为目前研究的热点。乳酸杆菌是肠道常在的“食品级”益生菌,可以维持肠道稳态、提高机体免疫力。基因工程乳酸杆菌可以作为活载体递呈鸡球虫抗原蛋白,这种新型活载体疫苗成为防治鸡球虫病的理想选择。本课题通过制备鸡柔嫩艾美耳球虫钙结合蛋白（Eimeria tenella membrane-associated calcum-binding protein,EtCab）的单克隆抗体,对EtCab蛋白进行亚细胞定位,研究EtCab在球虫不同发育阶段的动态表达,及其在粘附和入侵宿主细胞过程中所介导的功能,构建表面表达EtCab蛋白的重组乳酸杆菌疫苗,对重组乳酸杆菌疫苗进行动物免疫保护力评价。具体研究内容如下:1、EtCab单克隆抗体的制备、鉴定与应用按照常规方法制备并获得10株稳定分泌抗EtCab单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为G9D3、D4F10、A2C10、E11C4、G10C8、C5C2、E1C11、G2G7、G6C1和D9F1,其中E11C4属于Ig G2b亚型,其余9株属于Ig G1亚型,ELISA相加试验发现10株单克隆抗体中E11C4识别一个抗原识别位点,其余9株识别另一个抗原识别位点。Western blot试验证明E11C4株单抗能特异性识别天然EtCab蛋白,间接ELISA法测定其效价及亚型,E11C4株细胞上清的效价为1:1.6×103,纯化的腹水效价为1:1.28×105。利用制备的E11C4单抗进行间接免疫荧光试验（IFA）,结果显示,不透化的条件下EtCab位于柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）子孢子的细胞膜,透化的条件下EtCab位于子孢子的细胞膜和细胞质,说明EtCab蛋白是E.tenella的表面蛋白。2、EtCab在入侵宿主细胞中功能的初步研究为分析EtCab蛋白在粘附和入侵过程中的作用,本课题使用相对荧光定量PCR和Western blot的方法研究EtCab在E.tenella不同发育阶段的转录水平和蛋白表达水平,利用酵母粘附模型研究EtCab蛋白在粘附中的作用,利用入侵抑制试验研究EtCab蛋白在入侵中的作用。结果发现,EtCab在E.tenella的所有发育阶段均转录和表达。子孢子中EtCab基因转录水平明显高于其他三个阶段,是未孢子化卵囊阶段的3.11倍（P<0.001）;孢子化卵囊中EtCab的转录水平与未孢子化卵囊中的转录水平相比无显着差异（P>0.05）;裂殖子中EtCab的转录水平与未孢子化卵囊相比显着降低（P<0.01）。在子孢子阶段和裂殖子阶段,EtCab蛋白表达水平最高,表达水平相比差异不显着（P>0.05）,裂殖子中EtCab蛋白表达水平是孢子化卵囊中的1.93倍,是未孢子化卵囊的14.13倍。粘附试验结果显示,表面表达EtCab的酵母细胞对宿主细胞的粘附率（62.10%）与对照组（24.58%）相比差异显着（P<0.001）,是对照组的2.5倍。入侵抑制试验结果显示,经EtCab抗体处理后的E.tenella子孢子入侵DF-1细胞能力明显下降,其中多抗对子孢子入侵的阻断能力较强,其中多抗的入侵阻断能力较强,多抗（200μg/m L）入侵抑制率最高为58.17%。结果说明,EtCab在E.tenella粘附和入侵宿主细胞中发挥重要作用。3、重组乳酸杆菌疫苗的构建与鉴定在实验室前期构建的持续表达型表面展示系统P32-SP-AP基础上,更换信号肽SP和锚定蛋白AP为乳酸杆菌Mur O基因或枯草芽孢杆菌Pgs A基因,插入EtCab基因,共构建三种重组乳酸杆菌表达质粒P32-SP-EtCab-AP、P32-Mur O-EtCab和P32-Pgs A-EtCab,电转至乳酸杆菌后,Western blot鉴定重组EtCab蛋白的表达,IFA分析重组乳酸杆菌表面展示效率。试验发现三种重组乳酸杆菌均可表面展示EtCab蛋白,重组乳酸杆菌P32-Pgs A-EtCab-NC8的表面展示率为44.90%,P32-SP-EtCab-AP-NC8的表面展示率为33.87%,P32-Mur O-EtCab-NC8的表面展示率为21.25%。结果说明,三种表面展示系统均可将外源蛋白展示到乳酸杆菌表面,其中Pgs A与EtCab组合具有更高的蛋白展示效率。4、重组乳酸杆菌疫苗的免疫保护作用评价为研究重组乳酸杆菌疫苗在抗鸡球虫感染中的作用,本课题选用表面展示率最高的重组乳酸杆菌P32-Pgs A-EtCab-NC8进行动物免疫保护试验,通过检测平均增重、盲肠病变、卵囊排出量、ACI及血清抗体等指标评价其免疫保护效果。结果显示P32-Pgs A-EtCab-NC8免疫组、NC8免疫组和PBS免疫组的ACI的抗球虫指数分别为170.79、151.45和114.77。P32-Pgs A-EtCab-NC8免疫组在一定程度上可以改善感染E.tenella后造成的生长迟缓,减轻盲肠病变程度,减少卵囊的排出,提高机体的lg G的抗体水平（P<0.05）;提高外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚型比例（P<0.01）。本课题制备了具有良好特异性,能稳定分泌抗EtCab蛋白Ig G2b型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,证明EtCab蛋白是E.tenella的表面蛋白,在子孢子和裂殖子阶段高度表达,在粘附和入侵宿主细胞过程中介导重要的功能,成功制备表面展示EtCab蛋白的重组乳酸杆菌,免疫重组乳酸杆菌可以有效预防鸡球虫感染。
高阳[2]（2021）在《毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究》文中研究指明鸡球虫病是由顶复门（Apicomplexa）、艾美耳属球虫（Eimeria）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,其中毒害艾美耳球虫（E.necatrix）是鸡球虫病的主要病原,主要危害8～18周龄的青年鸡,可引起鸡的急性小肠球虫病,导致育成鸡的大批死亡。近年来,随着饲养周期相对较长的黄羽鸡饲养量不断攀升,以及鸡球虫病活疫苗的使用,毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病越来越多见。目前鸡球虫病的防治主要依赖药物,但随着耐药性虫株、药物残留肉蛋、病原污染环境等问题的出现,迫切需要寻找一种有效、安全的方法来替代抗球虫药。艾美耳球虫为单宿主寄生虫,其发育经历孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖三个阶段。孢子生殖在外界环境中进行,形成具有感染性的孢子化卵囊。裂殖生殖和配子生殖在鸡肠道上皮细胞内进行,最终形成未孢子化卵囊,并随鸡粪便排出体外。孢子化卵囊被鸡食入后,释放出孢子囊,后者在肠道中释放出子孢子。子孢子入侵肠上皮细胞,进行裂殖生殖,产出裂殖子,后者再次侵入肠上皮细胞,开始新一轮的裂殖生殖。经2～3代裂殖生殖后,裂殖子进入配子生殖。由此可见,子孢子与裂殖子入侵宿主细胞是球虫建立和完成寄生生活的关键点。鉴定与解析参与这些关键点的分子及其作用机制,将有助于发现防控鸡球虫的新策略。迄今,关于顶复门原虫入侵宿主细胞的关键分子和机制主要来源于对疟原虫（Plasmodium spp.）和弓形虫（Toxoplasma gondii）的研究,对艾美耳球虫的研究甚少。本文通过对毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组学和蛋白质组的比较分析,鉴定差异表达基因和差异表达蛋白,筛选虫体入侵相关分子,并选择关键基因进行原核表达和功能分析,研究结果将有助于阐明球虫入侵宿主细胞的分子机制以及发现药物治疗靶点或疫苗候选抗原。一、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的转录组学比较研究分离纯化未孢子化卵囊（UO）、子孢子（SZ）和第二代裂殖子（MZ-2）,分别提取RNA,构建测序文库,进行高通量测序。基于PacBio平台三代全长转录组测序,UO、SZ 和 MZ-2 分别获得 9 305 110、8 423 031、6 756 870 条 Subreads,34 932、23040、21 923条转录本,4949,4254,4007个基因;UO发生3’端可变剪接基因数目最多（27.5%）,SZ 和 MZ-2 发生 5’端最多（19.09%、23.93%）;UO、SZ、MZ-2 的 mRNA3’端分别有955、797、840个基因含有单个poly-A位点;分别鉴定到1958（UO）、1743（SZ）、1416（MZ-2）个新基因,26810（UO）、17804（SZ）、17151（MZ-2）个新转录本;转录因子分析显示,UO、SZ和MZ-2分别有194、159和84条转录本支持10个、11个和8个转录因子家族;在UO、SZ、MZ-2中,分别鉴定到5223、3581、2039条长链非编码RNA,3835、4019、2588个融合转录本。基于Illumina平台二代转录组学测序,分别获得 71 298 596（UO）、73 222160（SZ）和 70203 690（MZ-2）条 Raw reads,8376（SZ vs UO）、6905（SZ vs MZ-2）和 7902（MZ-2 vs UO）个差异表达基因;GO富集分析显示,在SZ vs UO间有6237个DEGs显着富集到113条GO条目,在SZ vs MZ-2间有5076个DEGs显着富集到9条GO条目,在MZ-2 vs UO间有5833个DEGs显着富集到102条GO条目;KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有664个DEGs显着富集到13条信号通路,在SZ vs MZ-2间有1324个DEGs显着富集到31条信号通路,在MZ-2 vs UO间有987个DEGs显着富集到14条信号通路。筛选获得了123个差异表达基因与子孢子入侵宿主细胞相关,50个基因在SZ阶段上调表达,73个基因在UO阶段上调表达。二、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的蛋白质组学比较研究分别提取UO、SZ、MZ-2的总蛋白,采用iTRAQ定量标记,进行蛋白质组学测序。共鉴定到983 835个二级谱图,26 410条肽段,3606个蛋白。用GO、KEGG、IPR、KOG四个数据库注释,分别获得1725、2143、2386、1724个蛋白。蛋白差异分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间分别鉴定到388、300、592个差异蛋白（DEPs）。GO富集分析,在SZ vs UO间有166个DEPs显着富集到38个GO条目,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显着富集到20个GO条目,在MZ-2 vs UO间有200个DEPs显着富集到11个GO条目。KEGG富集分析显示,在SZ vs UO间有89个差异蛋白显着富集到102条信号通路,在SZ vs MZ-2间有52个DEPs显着富集到72条信号通路,在MZ-2 vs UO间有105个DEPs显着富集到125条信号通路。差异表达蛋白结构域富集分析显示,在SZ vs UO间有47个DEPs富集到66个结构域,在SZ vs MZ-2间有32个DEPs富集到43个结构域,在MZ-2 vs UO间有64个DEPs富集到84个结构域。差异表达蛋白互作分析显示,在SZ vs UO间有273个蛋白686条蛋白互作反应线,在SZ vs MZ-2间有153个蛋白230条蛋白互作反应线,在MZ-2 vs UO间有321个蛋白864条蛋白互作反应线。筛选获得了 103个差异蛋白与虫体入侵相关。三、毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组和蛋白组联合分析基于转录组和蛋白组的联合分析结果显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间转录组和蛋白组表达量person关联系数分别为0.086、0.297和0.317;在mRNA水平与蛋白水平上,关联基因除表达趋势一致外还存在多种表达模式。对转录组和蛋白组相互关联的差异表达基因分析显示,在SZ vs UO、SZ vs MZ-2、MZ-2vs UO间的差异表达基因数分别为292、159和391个,这些差异表达基因富集到核酸结合、小分子结合、转移酶活性、辅因子结合、氧化还原酶活性等GO条目,参与内质网中蛋白质加工、氨酰基tRNA的生物合成、谷胱甘肽代谢、丙酸酯代谢、碳代谢、氨基酸生物合成、过氧化物酶体等信号通路。筛选获得了 68个关联的差异表达基因与虫体入侵相关。四、毒害艾美耳球虫SAG、P25和MIC13基因的原核表达及免疫荧光定位分析用RT-PCR克隆3个虫体入侵相关差异表达基因—表面抗原基因（EnSAG）、P25蛋白基因（Enp25）和微线体蛋白13基因（EnMIC13）,并用pET28a（+）载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达。重组蛋白rEnSAG、rEnp25和rEnMIC13 大小分别为 26 kDa、23 kDa 和 19 kDa,其中 rEnSAG 和 rEnMIC13 以包涵体形式存在,rEnp25表达于上清。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后免疫小鼠,制备鼠抗血清。Western blot检测显示,3种重组蛋白均被6 × HIS标签单抗和鼠抗血清特异性识别。用鼠抗血清检测MZ-2中天然蛋白,结果均检测到天然蛋白。免疫荧光定位结果显示,EnSAG蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内,Enp25蛋白分布在SZ虫体一端和MZ-2胞质内,EnMIC13蛋白分布在SZ和MZ-2胞质内。实时荧光定量PCR检测显示,EnSAG基因在SZ高表达,Enp25基因在UO高表达,EnMIC13基因在MZ-2高表达。Western blot检测蛋白表达量显示,EnSAG蛋白和Enp25蛋白在SZ和MZ-2均高表达,且在MZ-2表达量最高;EnMIC13蛋白仅在MZ-2表达,但表达量相对较低。五、重组蛋白rEnSAG、rEnP25和rEnMIC13的免疫保护效果评价将3种重组蛋白分别与佐剂混合后,制备免疫原。每种蛋白分别设高、中、低（200、100、50 μg/羽）三个剂量组,同时设未免疫攻虫组（阳性对照组）和未免疫未攻虫组（阴性对照组）。二免后7d,除阴性组外,其余各试验组攻虫。以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率为指标,评价重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,rEnSAG中剂量组、rEnp25高剂量组和rEnMIC13高剂量组的免疫保护效果较好,与阳性对照组相比,免疫组的病变记分降低,卵囊产量减少,平均增重增加。
汤新明[3]（2020）在《基于CRISPR/Cas9系统的艾美耳球虫基因编辑体系的建立》文中研究说明艾美耳球虫（Eimeria）是危害多种动物健康的主要病原之一,亦是研究顶复门原虫生物学和免疫学特性的重要模式生物。前期研究已建立了艾美耳球虫的瞬时转染、筛选等反向遗传操作平台。但受艾美耳球虫难以进行体外培养、转染效率低下等因素的影响,尚未建立有效的基因编辑技术,限制了对艾美耳球虫基因功能的研究。CRISPR/Cas9系统是一类高效、强大的基因编辑工具,已广泛应用于多种生物体的基因编辑。本文建立了基于CRISPR/Cas9系统的艾美耳球虫基因编辑系统,主要发现和结论如下:1.柔嫩艾美耳球虫组蛋白4启动子和核定位序列能够调控SpCas9核酸内切酶表达至子孢子细胞核部位,是Cas9对球虫核基因组进行剪切的基础。2.柔嫩艾美耳球虫有两个U6启动子,均能有效调控sgRNA的表达,且表达的sgRNA具有生物学活性。3.CRISPR/Cas9系统介导艾美耳球虫基因组靶位点产生断裂位点。4.艾美耳球虫基因组断裂位点在同源片段存在的情况下能够进行同源重组修复。总之,本文证实CRISPR/Cas9系统可对艾美耳球虫进行基因编辑,将促进艾美耳球虫基因功能的研究,具有重要意义。
蒋保余[4]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫在鸡巨噬细胞中的培养及子孢子感染巨噬细胞细胞因子的表达水平》文中进行了进一步梳理鸡球虫病由一种或多种艾美耳球虫引起的危害养鸡业最严重的肠道寄生虫病,可导致体重显着下降、营养不良、失血、脱水和对其他疾病的易感性增加,每年造成世界范围内的经济损失高达30亿美元。先天性免疫系统是抵抗微生物入侵的第一道防线,其中巨噬细胞在先天性免疫和适应性免疫中都发挥重要作用。巨噬细胞可被多种细胞因子和病原相关分子模式如脂多糖、CpG DNA信号激活,从而启动先天免疫反应。本研究将鸡巨噬细胞（HD11）作为柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）子孢子的宿主细胞,研究体外E.tenella子孢子在鸡巨噬细胞（HD11）中的发育情况以及巨噬细胞（HD11）产生的抗感染免疫。具体内容如下:1.柔嫩艾美耳球虫子孢子的HD11细胞体外培养。将E.tenella子孢子接种HD11巨噬细胞,制备细胞爬片,用吉姆萨染色显微镜观察,结果发现E.tenella子孢子成功入侵HD11细胞,但并没有发育迹象,体外培养至50 h时巨噬细胞裂解,子孢子游离在培养基中并且活力良好。2.分别设置实验组,活子孢子感染HD11细胞组;空白对照组,将子孢子悬液换成相等体积的培养基;阳性对照组,将子孢子悬液换成试剂盒中阳性对照试剂。用荧光探针法检测细胞内一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的水平,结果显示:与空白对照组相比,活子孢子感染后HD11细胞内NO含量在4 hpi显着升高（P<0.05）,8 hpi达到最高并且随时间变化不再变化,而ROS含量在2hpi显着升高（P<0.05）,6 hpi达到最高并且随时间变化逐渐降低。3.分别设置活子孢子感染HD11细胞组,热灭活子孢子感染HD11细胞组和细胞空白对照组（加等量细胞培养基）。用qPCR方法检测E.tenella感染相关的8种宿主细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7）的mRNA水平,为巨噬细胞在球虫感染中的免疫反应进行初步阐述。结果显示:与空白对照组相比,活子孢子感染HD11细胞IL-1β和iNOS mRNA表达水平在6 hpi显着增加（P<0.05）,IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7在10 hpi显着增加（P<0.05）。与空白对照组相比,热灭活子孢子感染后HD11细胞IL-6和IFN-γmRNA表达水平在4 hpi显着增加（P<0.05）,IL-1、TNF-α和iNOS在6 hpi显着增加（P<0.05）,而IL-10、IL-12和IRF7在10 hpi显着增加（P<0.05）。表明,巨噬细胞抗球虫的免疫反应中,细胞因子的显着上调可能与机体抑制球虫发育增殖或清除球虫感染有关。综上所述,本研究发现柔嫩艾美耳球虫子孢子可以入侵巨噬细胞,但在细胞内不能够发育,并且巨噬细胞对子孢子没有消化或其他不良影响,但巨噬细胞产生了大量的细胞因子,为巨噬细胞的抗球虫免疫反应提供了理论依据。
赵宁宁[5]（2020）在《鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究》文中研究说明鸡球虫病是危害养鸡业最为严重的寄生虫病之一,每年给养鸡业带来巨大的经济损失。耐药虫株的出现、药物残留、鸡球虫活疫苗生产成本昂贵、散毒等问题,使鸡球虫病的防控面临更严峻的挑战。随着现代生物技术的发展,安全无毒的第三代疫苗被认为是理想的抗球虫疫苗;而筛选鉴定免疫原性强的保护性抗原和种特异性抗原是研发第三代疫苗的基础和关键。本研究应用比较免疫蛋白质组学对E.tenella特异性抗原组进行筛选鉴定;通过免疫原性试验鉴定E.tenella特异性抗原,并对其功能进行研究;为鸡球虫新型亚单位疫苗的研发提供理论依据和新思路。研究内容具体包括以下六个方面:1、E.tenella和E.maxima高免血清的制备和鉴定本研究通过口服感染鸡球虫卵囊制备E.tenella和E.maxima高免血清,应用ELISA、Western blot、体外阻断及被动免疫等试验对抗体质量进行评价。ELISA结果显示,随着接种次数的增多,血清抗体滴度升高,且第五次接种8天后血清抗体滴度达到高峰。以制备的高免血清为一抗对裂殖子全蛋白进行Western blot分析,结果显示,E.tenella免疫血清识别的抗原种类和反应强度均高于E.maxima免疫血清。抗体阻断试验显示E.tenella高免血清对E.tenella子孢子入侵的抑制率显着高于E.maxima高免血清。被动免疫结果显示E.tenella免疫血清可提供良好的免疫保护力（ACI=181.26）,而E.maxima免疫血清只能提供有限的免疫保护（ACI=141.36）。以上结果表明本研究制备的E.tenella和E.maxima免疫血清抗体存在较大差异,可以用于后续差异免疫蛋白质组学分析。2、E.tenella特异抗原组的筛选为了系统筛选E.tenella特异性抗原组,本研究选取E.tenella裂殖子进行免疫蛋白质组分析。制备E.tenella裂殖子全蛋白,分别以E.tenella和E.maxima高免血清为一抗对其进行免疫印迹反应,共鉴定了109个差异显着的蛋白质点。选取差异倍数为2.0倍以上的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了36个抗原基因。为了验证组学的可靠性,本研究选取EtHSP60、EtSERPIN1、Etprofilin、EtCCT2、Etpyruvate kinase、EtMIC1、EtRACK和EtG-3-P等八个抗原基因进行原核表达;以重组蛋白质为抗原,E.tenella和E.maxima免疫血清为一抗进行Western blot分析,结果显示与免疫蛋白质组学结果符合率为83.33%。3、差异抗原功能初步分析为了对差异抗原进行初步探究,本研究从抗原基因在不同阶段的转录差异、内源性表达与定位、以及是否参与子孢子入侵等方面进行分析。RT-PCR显示上述8个基因在未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子阶段均转录,且转录水平存在较大差异。EtCCT2、EtHSP60、EtRACK、EtProfilin、EtSERPIN1和EtG-3-P在裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段;EtPyruvate kinase在孢子化卵囊、子孢子和裂殖子具有较高的转录水平;EtMIC1在子孢子和裂殖子阶段的转录水平显着高于其它阶段。为了进一步研究其功能,制备了鼠源多克隆抗体;以制备的多抗为一抗对子孢子和裂殖子进行间接免疫荧光分析,结果显示,8种抗原在子孢子和裂殖子虫体内均表达,且EtMIC1、EtHSP60、EtSERPIN1和EtCCT2可以定位在虫体表面,可能为膜抗原。体外阻断入侵试验显示抗EtMIC1和EtSERPIN1多克隆抗体对子孢子入侵有明显的抑制作用,抑制率分别为38.5%和36.7%;而其它多抗的抑制作用不明显。4、柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定为了对E.tenella特异性抗原进行进一步鉴定,本研究评价了E.tenella差异抗原和E.maxima同源抗原对E.tenella的免疫保护效果。成功克隆并表达了巨型艾美尔球虫EmMIC1、EmHSP60、EmSERPIN1、Emprofilin、EmCCT2、Empyruvate kinase、EmRACK和EmG-3-P基因。分别以16个重组蛋白为免疫原免疫雏鸡,评价其对E.tenella的免疫保护效果。结果显示,重组EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1、EtPyruvate kinase和EmPyruvate kinase免疫组可以显着降低由E.tenella感染引起的盲肠病变程度、卵囊排出量和体重减轻程度,可以提供良好的免疫保护力,ACI分别为180.77、171.44、173.69、171.44和167.87。EtG-3-P、EmG-3-P和EtSERPIN1可以提供有限的免疫保护力（ACI:150.94/149.55/152.56）。以上结果显示,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1和Etpyruvate kinase可以提供对E.tenella良好的免疫保护力,而只有巨型艾美尔球虫Empyruvate kinase具有较强的交叉免疫原性。因此,EtCCT2、Etprofilin、EtMIC1可能是E.tenella种特异性抗原,pyruvate kinase可能是E.tenella和E.maxima的共有抗原。5、特异性抗原EtCCT2功能差异分析以上研究结果表明EtCCT2是E.tenella的特异性抗原,功能上可能与EmCCT2存在较大差异。因此,本研究对EtCCT2/EmCCT2的功能进行研究。前期研究结果显示,该蛋白可以定位于虫体的表面,且与入侵无关,因此,我们猜测EtCCT2可能通过与宿主互作发挥其功能。为了验证以上猜想,本研究探究了EtCCT2/EmCCT2与宿主的相互作用。共聚焦观察结果显示EtCCT2与内源性和外源性鸡CCT4（GgCCT4）存在共定位现象;免疫共沉淀实验显示EtCCT2与内源性和外源性GgCCT4共沉淀。该结果表明EtCCT2与GgCCT4存在明显的互作关系。鸡CCT是8聚体的环状蛋白复合物,CCT2的邻位是CCT4和CCT5。那么EtCCT2是否与GgCCT5同样存在相互作用关系。为了进行验证,本研究构建了GgCCT5的真核表达质粒,与EtCCT2共转后发现EtCCT2与GgCCT5存在明显的互作关系。为了进一步研究互作对细胞的影响,我们检测互作复合物的定位情况。结果发现,互作复合物以颗粒状的形式聚集,随着时间的延长互作复合物入核,最终导致核裂解,细胞凋亡增加。EmCCT2功能分析显示,EmCCT2只与GgCCT5互作,不诱导细胞凋亡发生。另外研究发现,鸡柔嫩艾美尔球虫感染和CCT2的表达会调控宿主CCT4的表达水平。因此,EtCCT2可能是柔嫩艾美尔球虫的潜在毒力因子,可以通过与GgCCT互作调控宿主宿主细胞的进程。6、特异性抗原EtMIC1抗原表位及其关键氨基酸的鉴定利用抗EtMIC1单克隆抗体（1-A1和1-H2）,通过分段表达的方式鉴定EtMIC1的抗原表位,并对表位进行种特异性及免疫原性鉴定。通过截短表达的方式,成功鉴定了EtMIC1两个抗原表位(I:91LITFATRSK99和CTR:698ESLISAGE705)。定点突变分析显示所有的表位氨基酸是反应的必须氨基酸。序列比对显示,I表位在七种鸡球虫之间具有较大的差异;Western blot实验表明该单抗与其它种鸡艾美尔球虫表位肽之间无交叉反应原性。为了鉴定表位的免疫原性,以重组的表位肽免疫雏鸡,评价其诱导的抗鸡柔嫩艾美尔球虫的免疫效果。结果显示,I表位肽可以显着减轻柔嫩艾美尔球虫感染引起的盲肠病变、卵囊排出及鸡体重减轻情况,可以提供与EtMIC1几乎同等程度的免疫保护力。另外,I表位肽可以诱导产生高滴度的血清抗体水平,显着提高淋巴细胞转化水平和CD4+细胞的比例。以上结果表明,I表位肽具有良好的免疫原性,具有诱导体液和细胞免疫的能力,可能是柔嫩艾美尔球虫特异性抗原表位。综上所述,本研究通过比较免疫蛋白组学筛选了3个E.tenella特异性抗原和一个E.tenella和E.maxima共同抗原;鉴定了柔嫩和巨型艾美尔球虫CCT2蛋白的功能差异,初步证明该基因可能是E.tenella潜在的毒力因子;鉴定了EtMIC1关键抗原表位。这将为鸡柔嫩艾美尔球虫新型亚单位疫苗的设计和研发提供新的靶点。
余水兰[6]（2020）在《柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是由艾美耳属球虫感染引起的一种家禽传染性寄生虫病。由于使用药物防治球虫病会产生耐药性及药物残留的问题,因此迫切需要免疫预防替代药物成为球虫病控制的主导途径。由早熟株卵囊组成的减毒活疫苗是目前应用最广泛的球虫病疫苗,但球虫活疫苗对免疫鸡的生长具有潜在不良影响。研究发现免疫增强剂不仅可增强球虫活疫苗的免疫效果,同时也可降低接种疫苗带来的不良影响。与母株相比,球虫早熟株具有潜在期明显缩短、致病性减弱、繁殖能力降低等独特的生物学特性,但其早熟的分子机制不明。为此,本研究一方面通过笼养试验和平养试验研究盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖等对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强效果和免疫鸡增重的影响,以筛选获得每种免疫增强剂的有效剂量,为筛选球虫活疫苗的免疫增强剂奠定基础;另一面通过RNA-seq技术筛选柔嫩艾美耳球虫早熟株与母株孢子化卵囊的转录组差异,并对其中两个差异表达基因——柔嫩艾美耳球虫颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）的功能和特性进行初步分析,为探讨早熟性状产生的分子机制奠定基础。1.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验通过笼养试验评价盐酸左旋咪唑、黄芪多糖、壳寡糖、地衣芽孢杆菌、酵母多糖的不同剂量对柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的免疫增强效果,以筛选每种免疫增强剂的有效剂量。3日龄雏鸡进行首次免疫并服用免疫增强剂,10日龄时仅用卵囊进行二免,17日龄时用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体水平等作为评判指标。结果显示,0.05 mg～0.1 mg盐酸左旋咪唑、2.5 mg～5 mg黄芪多糖、2.5 mg～7.5 mg壳寡糖、1.25 mg酵母多糖以及10 mg地衣芽孢杆菌对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有免疫增强和促生长双重作用。2.五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验通过平养试验对笼养试验中所获得的5种免疫增强剂的有效剂量进一步验证。3日龄雏鸡用柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊进行免疫并服用免疫增强剂,24日龄用柔嫩艾美耳球虫野毒株进行攻虫,以免疫期间体重、攻虫后的抗球虫指数（ACI）以及试验期间血清IgG和IgM抗体、CD4和CD8分子、细胞因子（TNF-α、TGF-β1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10）水平等作为评价指标。结果显示,0.1 mg盐酸左旋咪唑可明显促进鸡CD4、CD8因子的增殖和TNF-α、IL-2的分泌,明显提高柔嫩艾美耳球虫的免疫效果,且有促生长的作用。2 mg和6 mg地衣芽孢杆菌、5 mg和7.5 mg壳寡糖、2.5 mg酵母多糖均可明显促进鸡CD8分子的增殖和TNF-α的分泌,具有免疫增强和促生长的作用。5 mg黄芪多糖对柔嫩艾美耳球虫感染鸡具有促生长作用,但免疫增强效果不显着,黄芪多糖对球虫具有免疫增强作用的有效剂量仍需进一步研究。3.柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析继续对本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育,经过11次的早熟株选育,潜在期由126 h缩短到107 h,缩短了19 h,与同源母株的潜在期141 h相比,缩短了34 h。通过RNA-seq技术比较了该早熟株与母株之间孢子化卵囊的转录组差异,筛选两个虫株之间的差异表达基因。结果共鉴定出差异表达基因6602个,早熟株上调表达基因3888个,下调表达基因2714个。这些差异基因主要与阳离子结合、未折叠蛋白结合、磷酸酯水解酶活性等功能相关,参与细胞内吞作用、泛素介导的蛋白水解、谷胱甘肽代谢、内质网蛋白加工等通路。利用qPCR对转录组数据分析获得的22个差异表达基因和5个非差异表达基因进行验证,结果显示27个基因的mRNA转录水平均与RNA-seq结果一致。研究结果为探索球虫早熟性状产生的分子机制奠定基础。4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析根据转录组学结果,选取两个早熟株下调基因——柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3（EtRON2和EtRON3）进行特性和功能的初步研究。结果显示,EtRON2的mRNA转录水平在孢子化卵囊中最高,未孢子化卵囊和第二代裂殖子次之,子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子、胞内子孢子和第二代裂殖子顶端棒状体的位置,以及未成熟裂殖体的细胞质中;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON3转录水平在孢子化卵囊阶段转录水平最高,未孢子化卵囊阶段次之,第二代裂殖子和子孢子最低;蛋白主要分布在游离的子孢子和胞内子孢子顶端棒状体的位置,第二代裂殖子的胞质以及未成熟裂殖体的表面;其抗体对子孢子入侵DF-1细胞具有显着的抑制作用。EtRON2和EtRON3在早熟株孢子化卵囊中转录水平均明显低于母株,与转录组学分析的结果一致,这提示EtRON2和EtRON3与早熟性状的产生有着一定的关系。但是EtRON2和EtRON3在球虫入侵以及发育调节中的作用仍需深入研究。
李雪雁[7]（2020）在《沙咪珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子蛋白组的影响研究》文中认为鸡球虫病是一种由艾美尔属球虫引起的胞内寄生虫疾病,每年都会给养禽业造成巨大的经济损失。其中柔嫩艾美尔球虫（Eimeria tenella,E.tenella）的致病性较强。在其第二代裂殖子阶段,滋养体复分裂形成裂殖体,进而产生大量裂殖子,对肠道造成不可逆损伤。因此,研究药物对第二代裂殖子时期的影响尤为重要。目前,E.tenella的防治主要依靠化学药物。沙咪珠利（Ethanamizuril）是上海兽医研究所兽用抗感染药物创新团队自主研发的一种新型三嗪类化合物,具有广谱、高效、低毒的特点。前期研究表明其抗球虫效果在第二代裂殖子时期最为显着。我们通过研究沙咪珠利对E.tenella第二代裂殖子蛋白组的影响,期望发现药物的作用分子以及潜在的耐药机制。结果如下:1.Label free蛋白质组学研究沙咪珠利对E.tenella第二代裂殖子蛋白表达水平的影响,筛选出具有药物效应的目标蛋白。液相色谱-质谱/串联质谱（LC-MS/MS）对蛋白进行鉴定和定量分析。采用基因本体论（Gene ontology,GO）,京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）和构建蛋白相互作用网络（Protein-protein interaction networks,PPI）等方法对蛋白进行富集,筛选出145个显着表达差异蛋白,其中66个上调蛋白,79个下调蛋白。GO分析表明,上调蛋白涉及基因转录、蛋白合成和代谢过程,下调蛋白主要包括核糖体蛋白和表面抗原（Surface antigens,SAGs）。KEGG通路和PPI网络显示,差异蛋白主要参与RNA代谢和蛋白生物合成等通路。有趣的是,SAGs有17个,在球虫显着下调蛋白中占最大比例,推测SAGs最可能是药物作用的关键分子。2.为了验证上述推测,选择了10种SAGs运用Real-time PCR方法检测沙咪珠利作用后E.tenella第二代裂殖子SAGs在mRNA水平的相对表达量的变化。结果显示,敏感株SAGs在沙咪珠利作用后均呈现下调,但耐药株SAGs的相对表达水平出现逆转。3.为研究沙咪珠利对第二代裂殖子SAGs蛋白水平的影响,选择基因水平发生明显逆转的2个SAGs（SAGfm1和SAGfm2）,利用基因克隆和大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）表达体系实现SAGs的体外表达。SDS-PAGE结果表明,这两种重组蛋白均在32 kD处出现特异性条带,为包涵体蛋白。Western blot分析表明,重组蛋白可以与多克隆抗体特异性结合。4.运用Western blot、免疫荧光定位对SAGfm1和SAGfm2进行蛋白水平验证。Western blot结果表明,沙咪珠利显着下调敏感株SAGs的蛋白表达水平,而耐药株却出现上调。免疫荧光定位结果显示,SAGs分布在第二代裂殖子表面且均匀分布;与对照组相比,沙咪珠利作用后,敏感株SAGs的荧光信号强度明显减弱,而耐药株SAGs的荧光信号强度明显增强。综上所述,推测这两种蛋白不仅可能为药物作用的关键分子,且可能与耐药相关。本研究有助于进一步了解抗球虫药物的作用机理,延缓耐药性问题的出现。
戚南山[8]（2019）在《自噬对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活性及抗药性的影响》文中提出柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫,可引起鸡的球虫病,严重危害集约化养鸡业生产。当前鸡球虫病的防控主要采用化学药物配合活卵囊疫苗的技术手段,由此造成的抗药性、药物残留以及活疫苗潜在散毒风险等问题日益突出。由于鸡球虫复杂的生活史和生物学特性,人们至今对球虫的细胞生物学活性、入侵宿主以及抗药性等作用机制尚未全面了解,造成传统抗球虫药物的敏感性恢复、新型抗球虫药物及分子疫苗的研发面临巨大困难。近年来在对顶复门原虫自噬的研究中发现,通过药物的诱导或者抑制虫体的自噬可介导虫体发生程序性死亡,说明自噬对于寄生虫的细胞活性非常重要。鉴于此,本研究以E.tenella子孢子为研究对象,开展鸡球虫子孢子自噬方面的研究,以期揭示自噬对鸡球虫子孢子入侵活性及抗药性的作用机制,为新型抗球虫药的研发与抗球虫药抗药性的研究提供新的思路。1.E.tenella自噬标记蛋白Et ATG8的克隆表达及功能鉴定。本研究对E.tenella自噬相关基因（autophagy associated gene,Etatg8）进行了克隆、表达与亚细胞定位分析。结果显示,成功克隆获得全长为375 bp的Etatg8基因开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,编码124个氨基酸的Et ATG8蛋白,其三维结构与恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）Pf ATG8高度相似;Etatg8基因在虫体未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子及裂殖子4个发育阶段均有表达,但在未孢子化卵囊的转录水平显着高于其他3个阶段;Et ATG8蛋白在自噬诱导下呈点状聚集于子孢子及裂殖子胞浆中。结果表明,E.tenella具有与其他顶复门原虫、酵母以及哺乳动物等高度保守的atg8基因,Et ATG8蛋白在虫体自噬体膜的形成过程中起相同作用,可作为鸡球虫自噬研究的标记蛋白。2.E.tenella子孢子自噬的诱导、调节和检测。本研究以完全培养基培养的E.tenella子孢子为对照,利用营养缺陷型培养基、自噬调节剂处理子孢子建立自噬模型;利用免疫印迹（WB）、间接免疫荧光试验（IFA）及透射电镜（EM）等技术检测子孢子自噬体的形成及Et ATG8的表达。结果显示,饥饿或自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）诱导的E.tenella子孢子可形成双层膜样自噬体结构;Et ATG8蛋白在自噬诱导下发生脂化,呈点状聚集于子孢子及裂殖子胞浆中,而3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine）可有效抑制自噬体的产生。结果表明,E.tenella与其他真核细胞一样具有保守的自噬机制。3.自噬对E.tenella子孢子入侵活性的作用研究。本研究利用化学发光法检测子孢子腺苷三磷酸（ATP）水平,利用台盼蓝染色法检测子孢子存活率,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）⊿⊿CT法研究自噬对子孢子入侵活性的影响。结果显示,子孢子随着饥饿处理时间延长其存活率呈现明显下降趋势,但ATP水平却有所增加;而利用3-MA处理后ATP水平逐渐降低。子孢子经过RP诱导产生的自噬有利于对宿主细胞的入侵,相反3-MA可抑制子孢子的入侵活性。结果表明E.tenella在饥饿培养基诱导条件下可通过自噬机制保持能量平衡,自噬诱导剂诱导虫体产生的自噬则有利于其对宿主细胞的入侵。4.自噬在E.tenella对莫能霉素（Monensin）抗药性产生的作用研究。本研究通过台盼蓝染色法研究莫能霉素对E.tenella广州株敏感虫株（Mon S-GZ）及耐药虫株（Mon R-GZ）虫体活性的影响,利用WB、IFA及TEM等技术研究莫能霉素对两个虫株的自噬诱导作用。结果发现,相比Mon R-GZ株,莫能霉素可诱导Mon S-GZ株产生自噬并介导虫体死亡,而自噬抑制剂3-MA可有效阻断Mon S-GZ株产生自噬并拯救虫体存活。结果表明,莫能霉素诱导的自噬可作为介导球虫死亡的一种机制,同时也为解释球虫抗药性的产生提供了新的理论依据。
郝飞飞[9]（2019）在《鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究》文中研究表明为探讨基因佐剂IL-2、IL-4对鸡球虫病活疫苗的免疫增强效果和安全性,本试验使用SPF雏鸡,以基因佐剂pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP配合鸡球虫病三价四株活疫苗对雏鸡进行免疫攻毒,对基因佐剂的免疫增效作用进行检验;同时对基因佐剂的实验室安全性和体内分布表达情况进行研究。结果表明:（1）各佐剂接种组均能达到疫苗效力检验标准;随给药剂量的增加,免疫攻毒后鸡只的相对增重率（RWG）、抗球虫指数（ACI）升高;但剂量超过250μg/只时,其ACI、RWG反而下降;100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP单独给药,50μg/只pCI-chIL-2-EGFP和200μg/只pCI-chIL-4-EGFP联合给药时,ACI值均达到高效。表明pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP单独给药、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP联合给药剂量分别为100μg/只、50μg/只和200μg/只。（2）球虫疫苗免疫同时肌注100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP,免疫间隔时间佐剂添加组≥6 d、免疫攻毒组≥7 d时,均可达到良好免疫效果,符合效力检验标准。表明pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可使鸡球虫病活疫苗免疫间隔缩短1 d。（3）口服组（100300μg/只）ACI随接种剂量增加而升高。其中当口服给药为300μg/只时,其ACI（188.41）与肌注100μg/只ACI（190.49）接近,达到高效。表明鸡口服pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可以起到免疫增效作用,但给药剂量为肌注的3倍。（4）佐剂添加组在二免后≥5 d和免疫攻毒组≥6 d攻毒时,符合效力检验标准。表明球虫疫苗配合接种100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP时,免疫产生期缩短1 d。（5）pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP一次单剂量（100μg/只）、重复单剂量、一次超剂量（10倍）肌注组均无鸡死亡;鸡体温均在39.640.7℃之间,符合健康鸡正常体温;实验组平均增重与空白组差异不显着（p>0.05）;各组鸡未见眼观和镜检病变,基因佐剂未在体内的微生物中进行转移整合。表明该佐剂的安全性符合兽用生物制品的要求。（6）以100μg/只pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP肌注和口服给药鸡,接种部位最先检测到质粒;其次是血液和心脏;肝、脾、肾和肺在最后。其中肌注部位肌肉最长可达21 d;并可从注射后8 h持续表达到14 d。表明基因佐剂通过肌注途径接种可以在体内存在21d,佐剂肌注在体内分布和表达的时间长于口服。
李文宇[10]（2019）在《柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究》文中认为鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内,引起鸡产生食欲不振、消瘦、血便等一系列临床症状的寄生虫病。其发病率高,是严重危害养禽业发展的重要疾病之一,给全球养禽业造成了巨大的经济损失。艾美耳球虫属主要寄生于鸡的肠道,不同种球虫具有明显的寄生部位特异性,但其机制机理尚不明确。有研究显示,柔嫩艾美耳球虫微线蛋白3（EtMIC3）可能是柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）侵入盲肠细胞过程中,决定其寄生部位特异性的关键分子。本研究进一步通过观察鸡球虫侵入相关分子微线蛋白（EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1）与鸡不同肠段的结合情况,从而确定E.tenella侵入部位特异性关键分子。并在此基础上,构建鸡盲肠上皮细胞的cDNA文库,通过酵母双杂交方法确定E.tenella侵入部位特异性关键分子的受体分子,并通过GST-pulldown技术进行验证。对受体分子进行基因克隆及表达,制备抗血清,分析抗血清对球虫侵入宿主是否具有阻断作用,以及观察受体在鸡不同肠段的分布情况。本研究对于阐明鸡球虫侵入部位特异性的分子机制具有重要意义,也为鸡球虫病的防控提供新思路。1.E.tenella微线蛋白与鸡不同肠段结合能力的分析通过免疫组织化学方法观察微线蛋白EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1与鸡不同肠段（前段、中段、后段和盲肠）的结合能力。结果发现EtMIC3与盲肠具有明显的结合作用,与其它肠段没有明显的结合作用。EtMIC2和EtAMA1与鸡肠段（前段、中段、后段和盲肠）没有明显的结合作用;用EtMIC3抗血清封闭E.tenella子孢子,计算子孢子的侵入抑制率。结果显示EtMIC3抗血清对子孢子侵入盲肠组织的抑制率为63.63%。而在对照组中,PBS和空白大鼠血清不能对E.tenella子孢子侵入盲肠组织引起明显的阻断作用,表明EtMIC3抗血清能够显着阻断E.tenella子孢子侵入盲肠组织的能力。结果显示EtMIC3分子可能是E.tenella侵入部位特异性的关键分子。2.鸡盲肠上皮细胞文库的构建提取并纯化鸡盲肠上皮细胞中总RNA,构建鸡盲肠上皮细胞cDNA文库。构建诱饵质粒pDHB1-EtMIC3,将其转入NMY51酵母菌株中,确定诱饵质粒pDHB1-EtMIC3能否在酵母中进行表达。结果表明获得了高纯度的鸡盲肠上皮细胞RNA,鸡盲肠上皮细胞cDNA初级文库滴度为3×106CFU/mL,扩增后文库滴度约为3×109CFU/mL。文库中插入的片段长度约为400 bp-2000 bp,平均长度大于1000 bp。综上所述,可以用于筛选EtMIC3的受体分子。3.EtMIC3鸡盲肠上皮细胞受体分子的鉴定通过酵母双杂交系统进行EtMIC3受体分子的筛选,经返回性验证发现有8个与EtMIC3结合的受体分子。通过对受体分子的基因克隆及蛋白表达,并经GST-pulldown验证,发现2个能够与EtMIC3分子结合的蛋白:BCL2 associated athanogene 1（BAG1）;Endonuclease,polyU-specific-like（ENDOUL）。对鸡盲肠上皮细胞中EtMIC3受体分子的研究有利于阐明E.tenella侵入部位特异性机制。4.受体分子在肠道分布情况及其抗血清对子孢子侵入的阻断作用观察通过免疫组织化学的方法观察受体分子BAG1、ENDOUL在鸡不同肠段（前段、中段、后段和盲肠）的分布情况。将BAG1、ENDOUL受体分子蛋白分别免疫鸡,制备受体分子特异性免疫抗体。将BAG1、ENDOUL抗血清通过静脉注射至鸡体内,通过攻虫试验分析受体分子抗血清对E.tenella侵入是否具有阻断作用。免疫组织化学试验结果显示,2种受体分子主要分布于鸡盲肠,不在其他肠段分布;攻虫试验结果显示,与对照组相比,BAG1、ENDOUL抗血清组能够显着减缓鸡球虫感染造成的体重下降,说明BAG1、ENDOUL抗血清对E.tenella的感染具有一定的阻断作用。
二、鸡球虫病细胞介导免疫研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡球虫病细胞介导免疫研究（论文提纲范文）
（1）EtCab蛋白在鸡球虫入侵中的作用及其重组乳酸菌疫苗免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫及鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 鸡球虫 |
| 1.1.2 鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫生物学研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫的致病性 |
| 1.2.2 鸡球虫入侵相关因子研究进展 |
| 1.3 钙结合蛋白及在顶复门原虫中的研究进展 |
| 1.3.1 钙结合蛋白分类 |
| 1.3.2 钙结合蛋白在顶复门原虫中的研究进展 |
| 1.4 鸡球虫疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 鸡球虫疫苗概述 |
| 1.4.2 鸡球虫重组乳酸菌疫苗研究进展 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物、虫株和菌株 |
| 2.1.2 质粒、引物和基因合成 |
| 2.1.3 主要试验仪器 |
| 2.1.4 主要试验试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 EtCab蛋白鼠源单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.3 E.tenella不同发育阶段虫体的收集与纯化 |
| 2.2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.2.5 EtCab在不同发育阶段的转录水平差异分析 |
| 2.2.6 EtCab在不同发育阶段的翻译水平差异分析 |
| 2.2.7 细胞粘附试验 |
| 2.2.8 体外抗体阻断试验 |
| 2.2.9 乳酸杆菌重组表达质粒的构建 |
| 2.2.10 重组乳酸杆菌的制备 |
| 2.2.11 重组乳酸杆菌的表达与鉴定 |
| 2.2.12 动物免疫保护性试验 |
| 2.2.13 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EtCab单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.1.1 重组蛋白的制备 |
| 3.1.2 小鼠血清抗体效价检测 |
| 3.1.3 阳性杂交瘤细胞株筛选 |
| 3.1.4 单克隆抗体抗原识别位点分析 |
| 3.1.5 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.1.6 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.1.7 单克隆抗体的纯化 |
| 3.1.8 单克隆抗体的效价鉴定 |
| 3.2 EtCab蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 EtCab的动态表达 |
| 3.3.1 转录水平的差异分析 |
| 3.3.2 表达水平的差异分析 |
| 3.4 EtCab蛋白在粘附和入侵中的作用 |
| 3.4.1 粘附宿主细胞作用 |
| 3.4.2 抗体阻断入侵宿主细胞作用 |
| 3.5 重组乳酸杆菌疫苗的构建与鉴定 |
| 3.5.1 重组EtCab蛋白的表达鉴定 |
| 3.5.2 重组乳酸杆菌表面荧光强度的鉴定 |
| 3.6 重组乳酸杆菌疫苗的免疫效果评价 |
| 3.6.1 体重增重变化 |
| 3.6.2 盲肠病变计分 |
| 3.6.3 卵囊排出量情况 |
| 3.6.4 抗球虫指数ACI |
| 3.6.5 外周血血清IgG抗体水平 |
| 3.6.6 外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群比例 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EtCab蛋白是首次发现的定位于寄生虫细胞膜的CREC蛋白 |
| 4.2 EtCab蛋白在球虫粘附和入侵宿主细胞中介导重要功能 |
| 4.3 表面展示EtCab蛋白重组乳酸杆菌疫苗具有良好免疫保护力 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
| 附录 |
（2）毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 一、鸡球虫入侵相关分子的研究进展 |
| 1 鸡球虫病病原 |
| 2 鸡球虫入侵宿主细胞过程 |
| 3 鸡球虫入侵关键分子 |
| 二、转录组学与蛋白组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 1 转录组学测序技术 |
| 2 蛋白质组学测序技术 |
| 3 转录组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 4 蛋白质组学在鸡球虫病研究中的应用 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的转录组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的蛋白质组学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 毒害艾美耳球虫未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子转录组和蛋白组的联合分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毒害艾美耳球虫SAG、P25和MIC13基因的原核表达及免疫荧光定位分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组蛋白RENSAG、RENP25和RENMIC13的免疫保护效果评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一: 转录组筛选子孢子入侵相关基因 |
| 附录二: 蛋白组筛选入侵相关差异蛋白 |
| 附录三: 转录组和蛋白组关联分析筛选入侵相关差异基因 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 致谢 |
（3）基于CRISPR/Cas9系统的艾美耳球虫基因编辑体系的建立（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸡球虫与鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫病防控措施的弊端 |
| 1.3 艾美耳球虫反向遗传操作平台的建立及发展 |
| 1.3.1 艾美耳球虫反向遗传操作平台的建立 |
| 1.3.2 建立艾美耳球虫反向遗传操作平台的技术突破 |
| 1.3.3 艾美耳球虫反向遗传操作的发展方向 |
| 1.4 建立艾美耳球虫基因编辑系统的重要意义 |
| 第二章 表达SpCas9和sgRNA的重组球虫的构建及其功能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物与虫株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 质粒构建 |
| 2.2.4 转染、筛选与鉴定 |
| 2.2.5 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 SpCas9表达于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞核部位 |
| 2.3.2 SpCas9和sgRNA介导球虫基因组特定位点产生DSB |
| 2.4 小结 |
| 第三章 CRISPR/Cas9系统介导柔嫩艾美耳球虫基因组同源修复的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物与虫株 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 质粒构建 |
| 3.2.4 转染 |
| 3.2.5 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 CRISPR/Cas9系统介导异源基因的定点插入及效率研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物与虫株 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 质粒构建 |
| 4.2.4 转染与筛选 |
| 4.2.5 EtMic2-RFP的鉴定 |
| 4.2.6 数据处理与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（4）柔嫩艾美耳球虫在鸡巨噬细胞中的培养及子孢子感染巨噬细胞细胞因子的表达水平（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词英汉对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病及防治现状 |
| 1.1.1 鸡球虫病病原 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病防治现状及最新探索 |
| 1.2 鸡球虫对宿主细胞的入侵 |
| 1.3 鸡球虫细胞培养的研究现状及进展 |
| 1.4 鸡免疫系统 |
| 1.4.1 B淋巴细胞 |
| 1.4.2 T淋巴细胞 |
| 1.4.3 巨噬细胞 |
| 1.4.3.1 鸡巨噬细胞来源 |
| 1.4.3.2 巨噬细胞与寄生虫的相互作用 |
| 1.4.4 NK细胞 |
| 1.5 抗艾美耳球虫的先天性免疫反应和获得性免疫反应 |
| 1.5.1 抗体反应 |
| 1.5.2 细胞免疫 |
| 1.5.3 细胞因子及 NO 在抗球虫感染中的作用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫子孢子在HD11细胞中的体外培养 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 鸡巨噬细胞和虫株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡球虫的复壮与传代 |
| 1.2.2 球虫卵囊的收集与孢子化 |
| 1.2.3 无菌子孢子的提取 |
| 1.2.4 HD11细胞的复苏与培养 |
| 1.2.5 柔嫩艾美耳球虫在HD11细胞中的体外培养 |
| 2 结果 |
| 2.1 柔嫩艾美耳球虫在HD11细胞中体外培养的研究 |
| 2.1.1 孢子化卵囊和子孢子的收集与纯化 |
| 2.1.2 柔嫩艾美耳球虫在HD11细胞中的培养 |
| 2.1.3 柔嫩艾美耳球虫在CEK细胞中的培养 |
| 2.1.4 接种时间的确定 |
| 2.1.5 接种剂量的确定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫感染HD11细胞免疫反应的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 鸡巨噬细胞和虫株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 鸡球虫的复壮与传代 |
| 1.2.2 球虫卵囊的收集与孢子化 |
| 1.2.3 无菌子孢子的提取 |
| 1.2.4 HD11细胞的复苏与培养 |
| 1.2.5 柔嫩艾美耳球虫感染HD11 细胞细胞内NO和 ROS的检测 |
| 1.2.6 细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7表达水平检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 柔嫩艾美耳球虫子孢子感染HD11 细胞后细胞内NO和 ROS的检测 |
| 2.2 柔嫩艾美耳球虫感染相关的8种宿主细胞因子表达水平检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（5）鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡球虫病概述 |
| 1.1.1 病原生物学 |
| 1.1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.1.3 鸡球虫病流行病学及危害 |
| 1.2 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫抗原的种类 |
| 1.2.2 天然免疫反应 |
| 1.2.3 细胞免疫 |
| 1.2.4 体液免疫 |
| 1.3 鸡球虫病防控研究进展 |
| 1.3.1 鸡球虫病的药物防控 |
| 1.3.2 鸡球虫病的疫苗防控 |
| 1.4 蛋白质组学在球虫疫苗研发中的应用 |
| 1.4.1 蛋白质组学概述 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术 |
| 1.4.3 免疫蛋白质组学 |
| 1.4.4 蛋白质组学在鸡球虫抗原鉴定中的应用 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验质粒、菌株、虫体、细胞 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 主要试剂与药品 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 高免血清的制备 |
| 2.2.2 子孢子的分离纯化 |
| 2.2.3 裂殖子的分离纯化 |
| 2.2.4 裂殖子蛋白质的抽提 |
| 2.2.5 免疫差异蛋白质双向电泳 |
| 2.2.6 RNA的提取 |
| 2.2.7 反转录合成c DNA |
| 2.2.8 荧光定量PCR |
| 2.2.9 基因PCR扩增及产物回收 |
| 2.2.10 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.11 Blunt载体的制备 |
| 2.2.12 重组质粒的构建 |
| 2.2.13 原核表达 |
| 2.2.14 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.15 His重组蛋白的纯化 |
| 2.2.16 鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.2.17 组织蛋白抽提 |
| 2.2.18 Western blot实验 |
| 2.2.19 酵母表面展示 |
| 2.2.20 间接免疫荧光实验 |
| 2.2.21 多抗抑制子孢子入侵实验 |
| 2.2.22 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.23 抗球虫指数ACI计算 |
| 2.2.24 细胞转染 |
| 2.2.25 免疫共沉淀 |
| 2.2.26 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备与鉴定 |
| 3.1.1 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的制备 |
| 3.1.2 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体外鉴定 |
| 3.1.3 柔嫩和巨型艾美尔球虫高免血清的体内鉴定 |
| 3.2 柔嫩艾美尔球虫差异蛋白质组的筛选、鉴定 |
| 3.2.1 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白双向电泳分析 |
| 3.2.2 柔嫩艾美尔球虫裂殖子蛋白免疫蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.3 柔嫩艾美尔球虫免疫差异基因的鉴定 |
| 3.2.4 柔嫩艾美尔球虫免疫差异蛋白质表达、纯化 |
| 3.2.5 免疫蛋白质组学可靠性检测 |
| 3.3 差异抗原功能初步分析 |
| 3.3.1 差异抗原多克隆抗体的制备 |
| 3.3.2 差异抗原不同发育阶段转录谱分析 |
| 3.3.3 差异抗原在不同阶段的表达和定位分析 |
| 3.3.4差异抗原多克隆抗体体外抑制子孢子入侵实验 |
| 3.4 柔嫩艾美尔球虫特异性抗原的鉴定 |
| 3.4.1 巨型艾美尔球虫同源基因的克隆、表达 |
| 3.4.2 重组抗原免疫保护力评价 |
| 3.4.3 重组抗原诱导体液免疫的能力 |
| 3.5 特异性抗原CCT2 的功能研究 |
| 3.5.1 EmCCT2 多抗的制备 |
| 3.5.2 CCT2 多抗对子孢子入侵的抑制作用 |
| 3.5.3 EtCCT2 与宿主细胞的相互作用 |
| 3.5.4 EtCCT2 对宿主细胞的影响 |
| 3.5.5 EmCCT2与EtCCT2 的功能差异 |
| 3.5.6 EtCCT2对GgCCT4 表达的影响 |
| 3.5.7 柔嫩艾美尔球虫感染对宿主CCT4 表达的影响 |
| 3.6 特异性抗原EtMIC1 表位及其关键氨基酸序列的鉴定 |
| 3.6.1 表位的鉴定 |
| 3.6.2 表位关键氨基酸的鉴定 |
| 3.6.3 不同种艾美尔球虫表位种特异性鉴定 |
| 3.6.4 感染初期EtMIC1 亚细胞定位结果 |
| 3.6.5 EtMIC1 表位及结构域免疫保护力评价 |
| 3.6.6 EtMIC1 表位诱导体液免疫和细胞免疫的能力 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫蛋白质组学具有筛选高效抗原的优势 |
| 4.2 EtCCT2 可能是柔嫩艾美尔球虫表面抗原 |
| 4.3 柔嫩艾美尔球虫Profilin样蛋白是潜在候选抗原 |
| 4.4 柔嫩艾美尔球虫CCT2 可能是毒力因子 |
| 4.5 ~(91)LITFATRSK~(99)是EtMIC1 的关键抗原表位 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 博士在读期间发表的论文 |
（6）柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.1.1 鸡球虫病原 |
| 1.1.2 鸡球虫病的防治 |
| 1.2 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 DNA疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3 禽用免疫增强剂研究进展 |
| 1.3.1 微生态制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.2 生物制剂类免疫增强剂 |
| 1.3.3 中草药及多糖类免疫增强剂 |
| 1.3.4 化学合成小分子类免疫增强剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫免疫增强效果的评价——笼养试验 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验虫株 |
| 2.2.3 实验试剂和仪器 |
| 2.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 2.2.5 免疫增强剂的配制 |
| 2.2.6 实验动物分组 |
| 2.2.7 免疫攻虫程序 |
| 2.2.8 主要观察指标 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 免疫期间动物体重变化 |
| 2.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 2.3.3 血清抗体水平检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 五种免疫增强剂对柔嫩艾美耳球虫的免疫增强研究——平养试验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验虫株 |
| 3.2.3 实验试剂和仪器 |
| 3.2.4 柔嫩艾美耳球虫免疫用和攻毒用卵囊制备 |
| 3.2.5 免疫增强剂的制备 |
| 3.2.6 实验动物分组 |
| 3.2.7 免疫攻虫程序 |
| 3.2.8 主要观测指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫增强剂对免疫期间动物体重变化 |
| 3.3.2 免疫增强剂对攻虫后免疫效果的影响 |
| 3.3.3 免疫增强剂对鸡群抗体和细胞因子水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验虫株 |
| 4.2.3 实验试剂和仪器 |
| 4.2.4 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株进行早熟选育 |
| 4.2.5 柔嫩艾美耳球虫母株卵囊的收集和纯化 |
| 4.2.6 柔嫩艾美耳球虫早熟株卵囊的繁殖和纯化 |
| 4.2.7 柔嫩艾美耳球虫早熟株和母株孢子化卵囊的转录组测序 |
| 4.2.8 荧光定量PCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 继续对柔嫩艾美耳球虫早熟株的早熟选育结果 |
| 4.3.2 早熟株与母株转录组测序结果 |
| 4.3.3 差异基因的筛选 |
| 4.3.4 差异基因功能分类 |
| 4.3.5 转录组差异表达基因的荧光定量验证结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2和3特性与功能初步分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 实验虫株和细胞 |
| 5.2.2 实验试剂和仪器 |
| 5.2.3 柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体的纯化以及cDNA制备 |
| 5.2.4 EtRON2和EtRON3 转录水平分析 |
| 5.2.5 DF-1细胞的传代培养 |
| 5.2.6 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段虫体中的分布 |
| 5.2.7 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 EtRON2和EtRON3 在早熟株和母株孢子化卵囊的转录水平差异 |
| 5.3.2 EtRON2和EtRON3 在不同发育阶段中转录水平的差异 |
| 5.3.3 EtRON2和EtRON3 在虫体不同发育阶段的分布情况 |
| 5.3.4 EtRON2和EtRON3 多抗对子孢子入侵DF-1 细胞的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）沙咪珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子蛋白组的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 柔嫩艾美耳球虫概述 |
| 1.1.1 简介 |
| 1.1.2 发育史 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 防治措施 |
| 1.2 三嗪类药物的研究进展 |
| 1.2.1 三嗪类药物的简介 |
| 1.2.2 三嗪类药物作用机理的研究 |
| 1.3 蛋白组学研究 |
| 1.4 表面抗原的研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 沙咪珠利抗E.tenella第二代裂殖子的蛋白组学研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器和主要试剂 |
| 2.1.2 试验虫株及药物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验动物分组 |
| 2.2.2 E.tenella第二代裂殖子的提取和纯化 |
| 2.2.3 蛋白质样品制备 |
| 2.2.4 酶解产物的LC-MS/MS分析 |
| 2.2.5 Max Quant的非标记分析 |
| 2.2.6 差异表达蛋白质筛选 |
| 2.2.7 生物信息学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 质谱鉴定及差异表达蛋白的筛选 |
| 2.3.2 GO分析 |
| 2.3.3 KEGG信号通路富集分析 |
| 2.3.4 PPI网络分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 沙咪珠利对E.tenella第二代裂殖子差异表面抗原m RNA水平的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器和试剂 |
| 3.1.2 试验虫株和试验用药 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 试验动物分组 |
| 3.2.2 E.tenella第二代裂殖子的制备 |
| 3.2.3 提取E.tenella第二代裂殖子的总RNA |
| 3.2.4 反转录m RNA合成c DNA的第一条链 |
| 3.2.5 引物设计及Real-time PCR |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 提取第二代裂殖子总RNA |
| 3.3.2 Real-time RCR分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 E.tenella第二代裂殖子SAGfm1和SAGfm2 的克隆与表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器和试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 RT-PCR扩增 |
| 4.2.3 表达质粒的构建与鉴定 |
| 4.2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.5 重组蛋白的纯化及鉴定 |
| 4.2.6 多克隆抗体的制备 |
| 4.2.7 检测重组蛋白制备多克隆抗体的特异性 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 表达质粒的构建 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 4.3.3 检测重组蛋白制备多克隆抗体的特异性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 沙咪珠利对E.tenella第二代裂殖子SAGfm1和SAGfm2 蛋白水平的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要仪器和试剂 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 制备E.tenella第二代裂殖子 |
| 5.2.2 提取E.tenella第二代裂殖子的总蛋白 |
| 5.2.3 Western blot分析沙咪珠利对SAGfm1和SAGfm2 蛋白水平的影响 |
| 5.2.4 E.tenella第二代裂殖子SAGfm1和SAGfm2 的免疫定位 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 沙咪珠利对E.tenella第二代裂殖子SAGfm1和SAGfm2 蛋白水平的影响 |
| 5.3.2 E.tenella第二代裂殖子SAGfm1和SAGfm2 的免疫定位 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）自噬对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活性及抗药性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 养鸡业发展对人类生活具有重要意义 |
| 1.1.1.1 全球养鸡业发展概况 |
| 1.1.1.2 养鸡业面临的巨大挑战 |
| 1.1.2 鸡球虫病对养鸡业发展造成巨大危害 |
| 1.1.2.1 鸡球虫病概况 |
| 1.1.2.2 鸡球虫病综合防控技术的研究进展 |
| 1.1.2.3 鸡球虫病新型防控策略的研究进展 |
| 1.1.2.4 当前防控鸡球虫病面临的挑战 |
| 1.1.3 自噬研究为鸡球虫病防控带来新的思路 |
| 1.1.3.1 自噬的概述 |
| 1.1.3.2 顶复门原虫自噬机制的研究进展 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.1.1 E.tenella自噬标记蛋白EtATG8 的克隆表达及功能鉴定 |
| 1.3.1.2 E.tenella子孢子自噬的诱导、调节和检测 |
| 1.3.1.3 自噬对E.tenella子孢子入侵活性的作用机制研究 |
| 1.3.1.4 自噬在E.tenella对莫能霉素抗药性形成中的作用研究 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 第二章 E.tenella自噬标记蛋白ATG8 的克隆表达及功能鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物和饲料 |
| 2.2.2 虫株、菌株和载体 |
| 2.2.3 主要试剂耗材 |
| 2.2.4 抗体 |
| 2.2.5 溶液配制 |
| 2.2.6 主要仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 虫体收集与纯化 |
| 2.3.2 RNA提取和RT-PCR扩增 |
| 2.3.3 克隆、测序和生物信息学分析 |
| 2.3.4 EtATG8重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.5 抗rEtATG8 多克隆抗体的制备 |
| 2.3.6 Etatg8在E.tenella四个发育阶段的转录水平分析 |
| 2.3.7 EtATG8在E.tenella四个发育阶段的表达水平分析 |
| 2.3.8 间接免疫荧光试验 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 Etatg8的克隆与序列分析 |
| 2.4.2 rEtATG8 蛋白的表达纯化 |
| 2.4.3 Anti-r EtATG8 多克隆抗体的制备 |
| 2.4.4 Etatg8在E.tenella四个发育阶段的转录水平 |
| 2.4.5 EtATG8在E.tenella四个发育阶段的表达水平 |
| 2.4.6 EtATG8在E.tenella子孢子和裂殖子的亚细胞定位 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 E.tenella子孢子自噬体的诱导、调节和检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 虫株 |
| 3.2.2 主要试剂耗材 |
| 3.2.3 抗体 |
| 3.2.4 溶液配制 |
| 3.2.5 主要仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 子孢子的制备 |
| 3.3.2 饥饿诱导E.tenella子孢子自噬模型的建立 |
| 3.3.3 自噬调节剂的筛选 |
| 3.3.4 E.tenella子孢子自噬的调节 |
| 3.3.5 自噬标记蛋白EtATG8 表达水平的WB检测 |
| 3.3.6 E.tenella子孢子自噬的IFA检测 |
| 3.3.7 E.tenella子孢子自噬的电镜观察 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 饥饿诱导E.tenella子孢子自噬模型的确定 |
| 3.4.2 自噬调节剂的浓度确定 |
| 3.4.3 自噬的饥饿诱导结果 |
| 3.4.4 自噬调节剂对E.tenella子孢子自噬的调节作用 |
| 3.4.5 E.tenella子孢子自噬体的电镜观察结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 自噬对E.tenella子孢子入侵活性的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 虫株 |
| 4.2.2 主要试剂耗材 |
| 4.2.3 抗体 |
| 4.2.4 溶液配制 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 子孢子的制备 |
| 4.3.2 饥饿诱导与自噬调节 |
| 4.3.3 ATP水平与存活率的监测 |
| 4.3.4 自噬对子孢子入侵活性的影响研究 |
| 4.3.5 数据统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 自噬对E.tenella子孢子活性的影响 |
| 4.4.2 自噬对E.tenella子孢子能量的影响 |
| 4.4.3 自噬对球虫入侵活性的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 自噬在E.tenella对莫能霉素抗药性形成中的作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物和饲料 |
| 5.2.2 虫株、菌株和载体 |
| 5.2.3 主要试剂耗材 |
| 5.2.4 抗体 |
| 5.2.5 溶液配制 |
| 5.2.6 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 抗药虫株Mon-R GZ strain的诱导 |
| 5.3.1.1 诱导方法 |
| 5.3.1.2 单卵囊扩增传代 |
| 5.3.1.3 抗药性检测 |
| 5.3.2 子孢子制备 |
| 5.3.3 子孢子存活率监测 |
| 5.3.4 免疫印迹分析 |
| 5.3.5 间接免疫荧光试验 |
| 5.3.6 透射电镜观察 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 抗药虫株Mon-R GZ strain的诱导结果 |
| 5.4.2 子孢子存活率 |
| 5.4.3 免疫印迹检测结果 |
| 5.4.4 间接免疫荧光观察结果 |
| 5.4.5 透射电镜观察结果 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文讨论与总结 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 E.tenella自噬标记蛋白EtATG8 的克隆表达与功能鉴定 |
| 6.1.2 E.tenella子孢子在饥饿及自噬调节剂条件下的自噬调节与检测 |
| 6.1.3 自噬对E.tenella子孢子入侵活性的影响 |
| 6.1.4 莫能霉素诱导E.tenella产生自噬介导的球虫抗药性机制 |
| 6.2 全文总结 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 鸡球虫病研究进展 |
| 1.1 鸡球虫病 |
| 1.2 鸡球虫病免疫机制研究 |
| 1.3 鸡球虫病疫苗研究进展 |
| 2 鸡球虫病基因佐剂研究进展 |
| 2.1 鸡球虫病基因佐剂研究进展 |
| 2.2 鸡球虫病基因佐剂的分类与作用机制 |
| 2.3 细胞因子基因佐剂在鸡球虫病防控中的应用 |
| 2.3.1 鸡白介素2 |
| 2.3.2 鸡白介素4 |
| 3 鸡球虫病基因佐剂免疫效果的主要影响因素 |
| 3.1 免疫途径 |
| 3.2 免疫剂量 |
| 3.3 免疫次数 |
| 4 基因佐剂体内分布研究 |
| 5 安全性评价 |
| 6 本课题的目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验菌株及球虫 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 质粒制备 |
| 2.1.1 冻存菌活化 |
| 2.1.2 菌液裂解 |
| 2.1.3 质粒纯化 |
| 2.1.4 纯化质粒检测 |
| 2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗的实验室效力试验 |
| 2.2.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂接种剂量筛选 |
| 2.2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗免疫间隔的影响 |
| 2.2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服和肌注免疫增效比较 |
| 2.2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性试验 |
| 2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达鉴定试验 |
| 2.4.1 动物分组及处理 |
| 2.4.2 PCR敏感度测定 |
| 2.4.3 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP体内分布检测 |
| 2.4.4 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP体内表达检测 |
| 2.5 检测指标和判定标准 |
| 2.6 数据处理 |
| 试验结果 |
| 1 质粒制备结果 |
| 2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗的实验室效力试验 |
| 2.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂接种剂量筛选结果 |
| 2.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗免疫间隔的影响 |
| 2.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服效果和肌注效果比较 |
| 2.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性 |
| 4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达试验 |
| 4.1 引物特异性及敏感性测定结果 |
| 4.2 基因佐剂体内分布及代谢鉴定结果 |
| 4.2.1 基因佐剂在体内微生物中的转移情况 |
| 4.2.2 基因佐剂的组织分布结果 |
| 4.3 基因佐剂体内转录鉴定结果 |
| 4.3.1 荧光显微镜观察蛋白表达 |
| 4.3.2 组织中基因佐剂转录结果 |
| 讨论分析 |
| 1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对球虫疫苗免疫增效作用研究 |
| 1.1 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂给药剂量筛选 |
| 1.2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂给药间隔筛选 |
| 1.3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂口服和肌注效果比较 |
| 1.4 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂对疫苗的免疫产生期影响 |
| 2 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂实验室安全性 |
| 3 鸡重组IL-2、IL-4 基因佐剂的体内分布及表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附图 |
| 致谢 |
（10）柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一章 鸡球虫病及鸡球虫侵入机制研究 |
| 1 鸡球虫病 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 防治 |
| 1.3 鸡球虫的侵入部位特异性及其侵入机制 |
| 2 微线蛋白(MICs)及其在顶复门原虫侵入过程中的作用 |
| 2.1 微线蛋白(MICs)概述 |
| 2.2 微线蛋白(MICs)分子结构域及其功能 |
| 2.3 微线蛋白(MICs)在鸡球虫及其他顶复门原虫侵入过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 第二章 蛋白质相互作用的研究技术 |
| 1 检测未知相互作用蛋白方法 |
| 2 检测已知相互作用蛋白方法 |
| 3 蛋白质相互作用技术的应用 |
| 参考文献 |
| 第三章 E.tenella微线蛋白与鸡不同肠段结合能力的观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1的扩增及序列分析 |
| 2.2 EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1表达载体的构建 |
| 2.3 重组蛋白EtMIC3、EtMIC2和EtAMA1的表达 |
| 2.4 微线蛋白EtMIC3、EtMIC2、EtAMA1与不同肠段的结合能力分析 |
| 2.5 EtMIC3抗血清对E.tenella子孢子侵入阻断作用的观察 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 鸡盲肠上皮细胞酵母双杂交系统的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡盲肠细胞RNA检测 |
| 2.2 cDNA的合成与均一化 |
| 2.3 鸡盲肠上皮细胞cDNA文库质量的评价 |
| 2.4 重组诱饵质粒pDHB1-EtMIC3的构建与鉴定 |
| 2.5 诱饵质粒pDHB1-EtMIC3在NMY51酵母菌中的表达情况 |
| 2.6 酵母双杂交功能性检测 |
| 2.7 筛选3-AT的最适浓度 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 EtMIC3盲肠受体分子的筛选及其验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 酵母双杂交初次筛选 |
| 2.2 返回性验证 |
| 2.3 返回验证阳性捕获质粒中插入基因的鉴定 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 受体分子的扩增及序列分析 |
| 2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.7 受体蛋白的表达、纯化及复性 |
| 2.8 pGEX-6p-1-EtMIC3载体的构建与表达 |
| 2.9 受体分子的GST-pulldown验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 EtMIC3受体分子在鸡不同肠段的分布及其抗血清对E.tenella侵入阻断作用分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 受体蛋白在不同肠段的分布 |
| 2.2 受体分子抗血清对E.tenella侵入阻断作用分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
四、鸡球虫病细胞介导免疫研究（论文参考文献）
- [1]EtCab蛋白在鸡球虫入侵中的作用及其重组乳酸菌疫苗免疫保护性研究[D]. 王雅坤. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]毒害艾美耳球虫入侵宿主细胞关键分子的筛选与鉴定及其功能研究[D]. 高阳. 扬州大学, 2021
- [3]基于CRISPR/Cas9系统的艾美耳球虫基因编辑体系的建立[D]. 汤新明. 中国农业科学院, 2020
- [4]柔嫩艾美耳球虫在鸡巨噬细胞中的培养及子孢子感染巨噬细胞细胞因子的表达水平[D]. 蒋保余. 甘肃农业大学, 2020(12)
- [5]鸡柔嫩艾美尔球虫差异抗原的筛选鉴定及其功能研究[D]. 赵宁宁. 山东农业大学, 2020(08)
- [6]柔嫩艾美耳球虫免疫增强剂筛选与早熟株相关基因研究[D]. 余水兰. 中国农业科学院, 2020
- [7]沙咪珠利对柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子蛋白组的影响研究[D]. 李雪雁. 中国农业科学院, 2020(01)
- [8]自噬对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活性及抗药性的影响[D]. 戚南山. 华南农业大学, 2019
- [9]鸡球虫病活疫苗基因佐剂IL-2、IL-4实验室效力和安全性研究[D]. 郝飞飞. 山西农业大学, 2019(07)
- [10]柔嫩艾美耳球虫侵入部位特异性关键分子及其受体研究[D]. 李文宇. 南京农业大学, 2019