一、PTEN基因mRNA在膀胱癌中的表达（论文文献综述）
韩健松[1]（2021）在《Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景在我国,尿路上皮癌（UC）仍是目前最常见的泌尿系统恶性肿瘤。然而,迄今为止,与细胞毒性疗法相比,尚无针对UC靶向药物的临床试验证明可以提高存活率。癌症基因组图谱（TCGA）已在膀胱癌中检测到许多潜在发挥重要作用的基因改变,为在这种疾病中使用小分子抑制剂提供了路线图。此外,在过去的五年中,随着飞速发展的新一代测序技术,深度测序实时定义着肿瘤的分子特征。寻找膀胱癌治疗诊断特异性的靶向基因,成为精准治疗时代亟需解决的问题。研究目的结合体内外实验,在验证Pokemon在膀胱癌中表达情况的基础上阐明其与膀胱癌体内外的肿瘤恶性行为有关。应用“挽救实验”明确Pokemon可以调控靶基因IGFBP3,同时进一步阐明IGFBP3抑制膀胱癌肿瘤恶性生物学功能。应用高通量芯片分析及利用亚硫酸氢盐修饰后基因组测序,揭示Pokemon通过影响IGFBP3表观遗传修饰发挥抑制膀胱癌转移的分子机制,并积极寻找IGFBP3调控的下游通路。进而对积极寻找靶向治疗膀胱癌的新方法提供理论依据和临床数据支撑。研究方法1.确定Pokemon在膀胱癌中高表达以及发挥促癌作用。（1）应用免疫组织化学染色检测临床组织样本中Pokemon的表达情况。（2）应用western blot,荧光定量PCR实验检测膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮永生化细胞中Pokemon mRNA和蛋白表达情况。（3）通过过表达质粒（pcDNA3.1）和小干扰RNA（siRNA）构建过表达/敲低Pokemon细胞。（4）分别做细胞-细胞粘附实验,细胞基质粘附实验,Transwell小室侵袭迁移实验,失巢凋亡实验。分析Pokemon在这些肿瘤转移表型中的作用。最后,通过实时荧光定量PCR,western blot检测相关功能基因,Integrin-β1,MMP-9,BCL-2的mRNA和蛋白表达水平。2.确定IGFBP3在膀胱癌中的表达情况以及发挥抑癌作用。（1）对从临床组织标本进行免疫组织化学染色检测组织中IGFBP3的表达情况。（2）对膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮永生化细胞进行western blot,实时荧光定量PCR实验检测IGFBP3在细胞中表达情况。（3）通过过表达质粒（pcDNA3.1）和小干扰RNA（siRNA）构建过表达/敲低IGFBP3细胞。（4）分析IGFBP3在上述肿瘤转移表型中的作用。通过实时荧光定量PCR,western blot检测相关功能基因的mRNA和蛋白表达水平。3.证明Pokemon是通过靶向调控IGFBP3影响膀胱癌的转移。设计挽救实验,同时敲低Pokemon和IGFBP3,判断相比于单独敲低Pokemon时肿瘤转移表型以及相关功能蛋白表达有无回复,判断Pokemon是否通过靶向作用IGFBP3影响肿瘤转移。4.验证Pokemon调控IGFBP3的表观遗传学机制,寻找IGFBP3下游信号通路。（1）在膀胱癌细胞中转染siPokemon和FAM无义序列,进行亚硫酸氢盐修饰后基因组测序。根据测序结果,分析IGFBP3的启动子区域发生甲基化的具体CpG位点,绘制甲基化图谱。分析阴性对照组和敲除Pokemon组的IGFBP3启动子甲基化程度高低。（2）在膀胱癌细胞中转染pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1IGFBP3,培养24h后,收集细胞,进行转录组测序。通过统计学分析列出所有在过表达IGFBP3后有统计学差异的上调/下调基因,绘制热图。并通过分析,筛选膀胱癌转移相关的信号通路。确定信号通路后,通过实时荧光定量PCR和western blot,对该信号通路进行验证。5.动物模型的建立进行体内实验。将稳定敲除/过表达Pokemon和IGFBP3的T24细胞进行裸鼠尾静脉注射,建立裸鼠膀胱癌尾静脉转移模型,8周后处死小鼠,开腹检查膀胱肿瘤转移情况,肉眼计数肺部转移灶的数目。并对组织切片做HE染色判断肿瘤转移情况。研究结果1.Pokemon在膀胱癌组织和旁组织中的高表达率有显着差异,癌组织高表达率67.3%,癌旁组织高表达率26.9%;膀胱癌细胞系中Pokemon的mRNA和蛋白表达量都高于正常膀胱上皮永生化细胞;临床标本信息分析表明,Pokemon表达高低与膀胱癌的肿瘤分期以及是否发生远处转移有明显相关性,而与年龄,性别,肿瘤大小的相关性没有统计学意义。2.Pokemon可以促进膀胱癌细胞体外侵袭,迁移,细胞基质粘附;Pokemon可以抑制细胞-细胞粘附和失巢凋亡;Pokemon可以促进MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达。3.IGFBP3在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的低表达率有显着差异,癌组织低表达率63.5%,癌旁组织低表达率38.5%;膀胱癌细胞系中IGFBP3的mRNA和蛋白表达量都低于正常膀胱上皮永生化细胞;临床标本信息分析表明,IGFBP3表达高低与膀胱癌是否发生远处转移有明显相关性,而与年龄,性别,肿瘤大小,肿瘤分期的相关性没有统计学意义。4.IGFBP3可以抑制膀胱癌细胞体外侵袭,迁移,细胞基质粘附;IGFBP3可以促进细胞-细胞粘附和失巢凋亡;IGFBP3可以抑制MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达;IGFBP3可以抑制VASP和Paxillin的共定位表达,这代表了IGFBP3对黏着斑形成的抑制作用。5.Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达,促进膀胱癌的侵袭迁移,细胞-基质黏附。抑制膀胱癌的细胞-细胞粘附,抑制膀胱癌细胞失巢凋亡。Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达促进MMP-9,Integrin-β1,BCL-2的转录表达。6.T24细胞中敲低Pokemon的siPokemon组与阴性对照组相比,16个位点的甲基化比例下降,2个位点甲基化比例上升。J82细胞的siPokemon组与阴性对照组相比10个位点的甲基化比例下降,3个位点的甲基化比例上升。38个位点总的甲基化位点占比显示与对照组相比,siPokemon组的T24和J82细胞中IGFBP3启动子甲基化位点百分比降低,证明当Pokemon表达减少时,会使IGFBP3启动子去甲基化从而恢复IGFBP3的转录表达。7.真核有参转录组测序发现IGFBP3的过表达可以引起RIG-1的表达量增高,p<0.05。对信号通路的验证实验结果表明:敲低Pokemon或过表达IGFBP3后,RIG-1的mRNA和蛋白表达水平均升高,而过表达Pokemon或敲低IGFBP3后,RIG-1的mRNA和蛋白表达水平均降低。“挽救”实验结果表明,共转染siPokemon和si IGFBP3时,RIG-1的转录表达水平相比于单独敲低Pokemon时显着降低。8.在体内动物模型实验中,阴性对照组小鼠肺部发现大量转移性肿瘤结节。而敲低Pokemon的小鼠和过表达IGFBP3的小鼠和对照组相比,小鼠肺部转移性结节数量明显减少,尺寸明显变小,HE染色结果表现与大体组织表现一致。证明了敲低Pokemon和过表达IGFBP3组裸鼠表现出相似的转移抑制特性。结论Pokemon可以通过促进IGFBP3启动子甲基化抑制IGFBP3的转录表达,进而促进膀胱癌的转移。而且膀胱癌中Pokemon-IGFBP3可以调控下游RIG-1信号通路。
钱小锐[2]（2021）在《BAG2通过PINK1/PTEN轴促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭》文中研究指明目的:膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤,早期诊断困难,治疗仍旧以手术为主,严重影响患者生活质量,易复发,预后较差,因此需要更好的生物标志物帮助膀胱癌的早期诊断或特异性靶向治疗。BAG2基因是抗凋亡基因BAG家族一员,具有作为泛素蛋白连接酶抑制剂的作用,调节蛋白的泛素化降解。越来越多的研究已经证实,BAG2参与了多种疾病的发生发展,如神经退行性疾病,结核病以及多种肿瘤疾病。但BAG2在膀胱癌中的作用机制仍然尚不明确。通过生信分析我们发现BAG2与膀胱癌的不良预后密切相关,我们推测BAG2可能影响了膀胱癌的发生与发展,因此,在多对膀胱癌和癌旁组织以及膀胱癌细胞系中,我们对BAG2的表达水平进行检测,然后通过功能实验研究其对膀胱癌细胞的生物学行为产生的影响。在阅读大量文献的基础上,发现了BAG2与PTEN之间可能存在的关系,并通过实验加以验证。PTEN作为一个经典的抑癌基因,其在膀胱癌中失活的机制已有多篇报道,且已经发现多种药物可以通过上调PTEN发挥抗癌作用。本研究旨在探究BAG2在膀胱癌中发挥作用的一种可能的机制,同时为PTEN基因的失活提供了一个新的方向,从而为膀胱癌的早期诊断和靶向治疗提供新的思路。方法:我们通过生物信息学方法在TCGA数据库中分析BAG2与膀胱癌的关系。我们通过组织Western Blot法检测BAG2在5对膀胱癌及其癌旁组织中的表达水平。我们借助qRT-PCR法和Western Blot法分别检测BAG2在膀胱癌细胞系T24和5637以及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中mRNA和蛋白的表达水平。为验证BAG2在膀胱癌细胞中的功能,我们运用小干扰RNA技术实现BAG2基因的沉默,通过qRT-PCR法和Western Blot法分别在mRNA和蛋白水平检测小干扰RNA的沉默效果。在转染了siBAG2后,我们通过划痕实验和Transwell实验检测膀胱癌细胞T24和5637迁移和侵袭能力的变化。我们通过Western Blot法检测膀胱癌细胞T24和5637在转染了siBAG2后,PINK1和PTEN表达水平的变化。结果:在TCGA数据库中,我们发现BAG2与膀胱癌的不良预后明显相关,BAG2的表达水平越高,患者预后越差。在五对膀胱组织中,我们发现有四对的膀胱癌组织中的BAG2呈现明显高表达。细胞系的检测结果发现,相较于正常的膀胱细胞,膀胱癌细胞T24和5637中BAG2的mRNA和蛋白的表达水平明显升高。转染了siBAG2后,我们通过检测BAG2的表达变化,证明了siBAG2的沉默效果良好。然后在划痕实验和Transwell实验中,我们发现相较于NC组,转染了siBAG2后,膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力降低,说明BAG2可以促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭。然后在Western Blot实验中,我们发现BAG2沉默后,PINK1的表达水平同步下降,而PTEN的表达水平有所升高。结论:BAG2在膀胱癌中呈现高表达且可能通过PINK1/PTEN轴促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭。
杨宇[3]（2020）在《长链非编码RNA SLCO4A1-AS1通过靶向miR-335-5p促进膀胱癌生长和侵袭的机制研究》文中研究表明研究背景膀胱癌（Bladder cancer）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,属于全球发病率第9大癌症。据报统计每年全世界约有40万患者被诊断出患有膀胱癌,导致15万人死亡。膀胱癌的主要治疗方法包括外科手术结合放疗或化学疗法等。由于其高复发率和转移率,该病的5年生存率仍然很低。因此,明确膀胱癌进展的分子机制并开发新的治疗策略具有重要的社会价值。长链非编码RNA属于非编码RNA家族中的一员,其长度200个以上核苷酸。随着RNA-seq的广泛应用,在各种癌症中发现了成千上万的LncRNA的异常表达或突变。许多研究已经证实有些lncRNA的异常表达与肿瘤的进展有着密切的关系。在膀胱癌中已经发现了多种lncRNA发挥作用。长链非编码RNA SLC04A1-AS1（SLC04A1 antisense RNA1）属于溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员4A1（solute carrier organic anion transporter family member 4A1,SLC04A1）的反义RNA。膀胱癌中对SLC04A1-AS1的功能的研究却鲜有报道。本研究中,我们旨在研究SLC04A1-AS1在膀胱癌中的生物学功能,并且寻找其可能靶向的miRNA以及可能介导的信号通路,探索其作为潜在的膀胱癌生物标志物和癌症治疗靶点的可能性,明确其在膀胱癌中的作用,为后期针对临床膀胱癌的诊断、防治提供新的思路及解决途径。研究目的1、探索其称为潜在的膀胱癌预后生物标志物的潜力。2、明确SLC04A1-AS1在膀胱癌中的生物学功能。3、探索SLC04A1-AS1在LncRNA-miRNA-mRNA网络中的分子作用机制。研究方法第一部分SLC04A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究1、将58例临床病人的膀胱癌组织和癌旁正常组织,分别提取RNA,运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织中SLC04A1-AS1的表达水平。另外运用RT-qPCR分别检测人膀胱癌细胞系EJ、T24和RT4,以及SV-HUC-1人膀胱上皮永生化细胞中SLC04A1-AS1的表达水平。2、收集膀胱癌病人的临床信息,随访时间等生存资料。将病人根据SLC04A1-AS1的表达水平分为高表达组和低表达组,两组平行对照设计,运用Kaplan-Meier test进行生存分析,检验两组终点（生存期或生存率）的差异有无显着性。3、设计并合成SLC04A1-AS1的shRNA,利用慢病毒介导的RNA干扰技术在膀胱癌细胞EJ、T24中沉默（敲低）SLC04A1-AS1后观察膀胱癌细胞的表型的变化。进行CCK-8细胞活力检测,克隆形成实验和Transwell迁移和侵袭能力检测。4、利用裸鼠成瘤实验,观察沉默（敲低）SLC04A1-AS1后裸鼠体内膀胱癌生长的变化。第二部分SLC04A1-AS1与靶标miR-335-5p的关系1、利用生物信息学分析 miRDB 数据库（http://mirdb.org/miRDB/index.html）预测 SLC04A1-AS1 的 miRNA。2、运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织、人膀肮癌细胞系中miR-335-5p的表达水平。3、将病人根据miR-335-5p的表达水平分为高表达组和低表达组,运用Kaplan-Meier test进行生存分析。4、根据临床样品中SLC04A1-AS1与miR-335-5p的表达水平,进行了相关性分析,分析两者的线性关系。5、利用人工合成的miR-335-5p mimics观察对EJ和T24细胞中SLC04A1-AS1的表达的影响;另外RT-qPCR检测沉默（敲低）SLC04A1-AS1后miR-335-5p的表达水平的变化。6、进行荧光素酶报告基因实验,验证SLC04A1-AS1和miR-335-5p是否互作。第三部分:SLC04A1-AS1通过靶向miR-335-5p上调OCT4表达1、利用生物信息学分析TargetScan7软件预测miR-335-5p的靶基因。2、运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织、膀胱癌细胞系OCT4的表达水平。3、将病人根据OCT4的表达水平分为高表达组和低表达组,两组平行对照设计,运用Kaplan-Meier test进行生存分析。4、根据临床样品中SLC04A1-AS1与OCT4的表达水平,miR-335-5p与OCT4的表达水平,进行相关性分析,分析两者的线性关系。5、利用人工合成的miR-335-5p mimics观察对EJ和T24细胞中OCT4的表达的影响;另外RT-qPCR检测沉默（敲低）SLC04A1-AS1后OCT4的表达水平的变化。6、荧光素酶报告基因实验检测包含OCT4 WT报告质粒或Mut报告质粒的细胞的荧光素酶活性以验证OCT4和miR-335-5p是否互作。7、在沉默SLC04A1-AS1的膀胱癌细胞EJ、T24中转染过表达OCT4质粒,观察并利用相关实验技术检测膀胱癌细胞的表型的变化包括细胞增殖、克隆形成、细胞的克隆形成能力。8、裸鼠成瘤实验,观察过表达OCT4和沉默SLC04A1-AS1同时处理的膀胱癌细胞在裸鼠体内形成肿瘤的生长变化。研究结果第一部分SLC04A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究RT-qPCR检测显示SLC04A1-AS1在膀胱癌组织中的表达水平异常升高,是癌旁正常组织的2.7倍,统计学分析显示具有显着性差异（P<0.05）。SLC04A1-AS1在三种膀胱癌细胞系EJ、T24和RT4中表达也显着升高,分别是正常SV-HUC-1细胞中表达水平的3.84倍、4.37倍、2.05倍（P<0.05）。生存分析结果显示SLC04A1-AS1表达水平较高的患者,其总生存时间（Overall survival,OS）相对于SLC04A1-AS1表达水平较低者短;SLC04A1-AS1高表达组中位生存期（Median Survival Time）为40.3个月。表示膀胱癌者的总生存时间与SLC04A1-AS1表达有显着的负相关性。SLC04A1-AS1的表达水平和病人的年龄、性别等临床参数无关,和膀胱癌的病理T分期以及淋巴结转移呈现正相关。沉默SLC04A1-AS1（siSLC04A1-AS1）的EJ和T24的细胞活力显着降低,只有对照组的54.5%、52.2%（P<0.05）。在EJ和T24中沉默SLC04A1-AS1,细胞的克隆形成率显着降低,为对照组的37.07%、51.43%（P<0.05）。沉默SLC04A1-AS1后的胱癌细胞EJ和T24的迁移和侵袭数量也明显减少:沉默处理后的EJ的细胞迁移率为（55.33±10.26）%,为对照组的58.24%。沉默处理后的T24的细胞率迁移为（57.33±11.24）%,为对照组的54.08%（P<0.05）。在EJ细胞中SLC04A1-AS1沉默处理后的侵袭细胞数为（50.67±16.70）%,为对照组的52.23%。SLC04A1-AS1沉默处理后的T24的侵袭细胞数为（55±8.54）%,为对照组的59.35%（P<0.05）。裸鼠成瘤实验显示沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤体积在14天、21天、28天时比对照组裸鼠的膀胱癌体积更小;在28天时,对照组肿瘤体积是（672.67±97.90）mm3,沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤体积是（306±66.78）mm3。在28天时沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤质量是（329.33±130.70）mg,沉默组的肿瘤质量显着减小,为对照组的46.60%。第二部分:SLC04A1-AS1与靶标miR-335-5p的关系生物信息学分析miRDB预测SLC04A1-AS1的靶向miRNA是miR-335-5p。miR-335-5p在膀胱癌组织和细胞系中低表达。miR-335-5p高表达组的总生存期比miR-335-5p低表达组的总生存期要长。miR-335-5p低表达组中位生存期为37.4个月。膀胱癌者的总生存时间与miR-335-5p表达有显着的正相关性。SLC04A1-AS1与miR-335-5p的表达水平之间呈负相关（Pearson r为-0.6522,95%C1 为-0.7793,-0.4737）。miR-335-5p mimics 转染后 EJ 细胞中的SLC04A1-AS1的表达水平显着下调,只有对照组的40.91%（P<0.05）。在T24细胞中也是同样的结果（P<0.05）。敲低SLC04A1-AS1后,EJ和T24细胞中miR-335-5p的表达水平升高,分别为对照组的4.07倍、2.95倍（P<0.05）。荧光素酶报告基因显示只有包含了 SLC04A1-AS1的WT报告质粒,细胞的荧光素酶活性才能被miR-335-5p mimics抑制。而miR-335-5p mimics转染对SLC04A1-AS1 Mut报告质粒的细胞的荧光素酶活性没有影响。第三部分SLC04A1-AS1通过靶向miR-335-5p上调OCT4表达生物信息学分析TargetScan7软件预测miR-335-5p的靶基因是OCT4。OCT4在膀胱癌组织和细胞系中高表达:膀胱癌组织中OCT4的表达水平更高,为对癌旁正常组织的2.43倍（P<0.05）OCT4在EJ、T24和RT4细胞系中表达也显着升高（P<0.05）。OCT4高表达组的总生存期（Overall survival,OS）比OCT4高表达组的总生存期要短（图20）。OCT4高表达组中位生存期（Median Survival Time）为41.3个月。膀胱癌者的总生存时间与OCT4表达有显着的负相关性（P<0.01）。SLC04A1-AS1与OCT4表达水平之间,表明SLC04A1-AS1与OCT4的表达水平呈正相关（P<0.0001）。miR-335-5p与OCT4的表达水平呈显着负相关（P<0.0001）。上调miR-335-5p抑制OCT4的表达miR-335-5p mimics转染后EJ、T24细胞中的OCT4的mRNA表达水平显着下调（P<0.05）。在EJ和T24细胞中miR-335-5p mimics处理组的OCT4蛋白表达水平比对照组都显着降低。荧光素酶报告基因实验表明miR-335-5p直接与OCT4相互作用。沉默SLC04A1-AS1抑制OCT4的表达。过表达OCT4逆转SLC04A1-AS1沉默对膀胱癌细胞的影响:沉默SLC04A1-AS1（siSLC04A1）和 过 表 达 OCT4 同 时 处 理（siSLCO4A1-AS+oeOCT4）的细胞增殖则不受抑制;沉默SLCO4A1-AS1抑制了 EJ和T24细胞的克隆形成,而siSLCO4A1-AS+oeOCT4组细胞的克隆形成能力则被恢复。在T24细胞中siSLCO4A1组的细胞迁移率为（57.33±11.24）%,siSLCO4A1-AS+oeOCT4 组的 T24 的迁移细胞率为（107±5.29）%（P<0.05）;siSLCO4A1-AS+oeOCT4组接近对照组的细胞迁移率（106±11.36）%。在T24细胞中siSLCO、siSLCO4A1-AS+oeOCT4组的细胞侵袭率为（55±8.54）%、（102±8.89）%,对照组的细胞侵袭率为（92±8.96）%。在EJ细胞中也是同样的结果。裸鼠动物实验显示si-SLCO4A1-AS1+oeOCT4组的裸鼠膀胱癌生长速度比转染siSLC04A1-AS1组裸鼠的膀胱生长速度更快;在28天时,对照组肿瘤体积是（672.67±97.90）mm3,沉默SLCO4A1-AS1的裸鼠肿瘤体积是（306±66.78）mm3,si-SLC04A1-AS1+oeOCT4 组的肿瘤体积是（597±106.38）mm3,为siSLCO4A1-AS1组的1.95倍,统计学分析显示两组有显着差异（P<0.05）。在28天时对照组裸鼠的肿瘤质量（706.67± 120.02）mg,沉默SLCO4A1-AS1的裸鼠肿瘤质量是（329.33± 130.70）mg,si-SLCO4A1-AS1+oeOCT4 组的肿瘤体积是（682.67±144.74）mg,为 siSLC04A1-AS1 组的 2.07 倍（P<0.05）。结论SLCO4A1-AS1在膀胱癌组织和细胞系中高表达,SLCO4A1-AS1表达水平和膀胱癌患者OS、T分期相关;沉默SLCO-AS1显着抑制膀胱癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,并且抑制体内肿瘤的生长。SLCO4A1-AS1靶向mi355-5p,并与其互作。SLCO4A1-AS1与miR-335-5p之间呈负相关。上调 miR-335-5p 抑制 SLCO4A1-AS1 的表达,敲低 SLCO4A1-AS1 上调miR-335-5p 的表达。OCT4 是miR-335-5p 的靶基因。上调 miR-335-5p 抑制 OCT4的表达。沉默SLCO4A1-AS1抑制OCT4的表达,也能被miR-335-5p逆转。过表达OCT4能逆转SLCO4A1-AS1沉默对膀胱癌细胞和肿瘤的抑制影响。总之,我们的研究是揭示了 SLCO4A1-AS1作为膀胱预后生物标志物的潜力,并且阐述了膀胱癌中SLC04A1-AS1通过miR-335-5p/OCT4发挥功能的作用,为今后针对SLCO4A1-AS1作为治疗靶点提供了新的证据和理论支持。
徐志杰[4]（2020）在《CDCA5在膀胱癌中的促癌作用及其分子机制研究》文中认为背景:膀胱肿瘤是中国最常见的泌尿系统肿瘤之一,其每年的发病率和死亡率分别在80.5/100000和32.9/100000。尽管目前膀胱肿瘤的治疗有了很大的提高,其死亡率仍位居所有恶性肿瘤的第13位。根据肿瘤的浸润深度,约3/4的膀胱肿瘤为非肌层浸润性膀胱肿瘤（nonmuscle-invasivebladdercancer,NMIBC）,1/4 的膀胱肿瘤患者在发现时已经发展成肌层浸润性膀胱肿瘤（muscle-invasive bladder cancer,MIBC）。膀胱肿瘤的易进展性和易转移性是目前膀胱肿瘤相关死亡的两大主要原因。目前膀胱肿瘤的临床诊断仍缺少特异性的分子标记物,膀胱肿瘤的发生发展分子机制仍没有明确的定论,因此探寻膀胱癌进展的分子机制和寻找潜在的治疗小分子靶点和药物是目前的研究重点。细胞分裂周期相关蛋白5（Cell division cycle associated 5,CDCA5）是后期促进复合物的底物之一,因此能够发挥调控肿瘤细胞的周期的作用。有很多研究报道了其在多种肿瘤中的表达显着上升。在膀胱肿瘤中,CDCA5的表达、功能以及作用机制目前仍缺少相关系统性的研究。目前局限性的肌层浸润性膀胱肿瘤的5年生存率约60%,而伴有远处转移的肌层浸润性膀胱肿瘤患者5年生存期仅为10%。目前膀胱肿瘤的预后预测主要依靠TNM分期系统,尽管如此,对肌层浸润性膀胱肿瘤的预后预测的准确性仍需要进一步的改善。因此,临床上就需要更加方便,准确性更高的预后模型来指导膀胱肿瘤患者的危险分层,以及寻找特异性的预后相关分子标志物来帮助临床医生的临床决策,来判断哪些肌层浸润性膀胱肿瘤患者适合采用保留膀胱的治疗,哪些患者更加适合做新辅助化疗,哪些患者适合尽快行根治性膀胱切除以及更加个性化的治疗方法的选择。第一部分 CDCA5在膀胱癌膀胱肿瘤组织和膀胱肿瘤细胞系中的表达水平探讨目的:通过对膀胱肿瘤的临床组织样本中的CDCA5进行qRT-PCR检测,利用Western Blot和qRT-PCR检测膀胱肿瘤细胞系中CDCA5的表达情况,探索CDCA5对膀胱肿瘤发生发展的作用机制。通过分析TCGA癌症数据库和Oncomine肿瘤数据库中的膀胱肿瘤数据探索CDCA5在膀胱肿瘤中的表达,与肿瘤分期的相关性以及与预后的相关性。方法:1)通过对20例膀胱肿瘤患者的术后样本及其配对的膀胱肿瘤癌旁组织样本进行qRT-PCR和免疫组化检测CDCA5的表达情况,统计分析CDCA5在膀胱癌和癌旁组织中的表达差异。通过对膀胱肿瘤细胞系（RT4,T24,UMUC3,TCCSUP和5637）和永生化尿路上皮（SVHUC）进行qRT-PCR和Western Blot检测CDCA5在肿瘤细胞系中的相对表达水平。2)利用Oncomine数据库和TCGA数据库分析CDCA5在膀胱肿瘤组织中的表达情况,以及其表达高低与膀胱肿瘤患者生存期的关系。结果:1)在膀胱肿瘤的20对临床样本中,qRT-PCR结果显示肿瘤标本的CDCA5 mRNA水平较癌旁组织表达明显升高;免疫组化分析结果显示CDCA5在膀胱肿瘤中明显高表达。qRT-PCR和Western Blot结果表明CDCA5在膀胱癌细胞系中表达明显高于永生化的尿路上皮细胞。2)Oncomine数据库和TCGA数据库显示CDCA5在膀胱肿瘤中的表达较正常组织中的表达明显升高,且T分期越高CDCA5的表达水平也越高,Kaplan-Meier分析结果表明CDCA5的表达水平与膀胱肿瘤患者总体生存时间具有相关性（P=0.0384）,高表达患者的总体生存时间较低表达患者生存时间短。结论:（1）CDCA5在膀胱肿瘤组织中的表达显着升高,同时在膀胱肿瘤细胞系中的表达也显着高于正常细胞。（2）CDCA5高表达的患者的总体生存率高于低表达患者,同时高表达患者中高级别膀胱肿瘤的比例较低表达患者高,高表达患者发生远处转移的比例高于低表达患者。故我们可以初步认为CDCA5可以作为膀胱肿瘤患者术后预后的危险因素,可以作为膀胱肿瘤诊断的分子标志物。第二部分 CDCA5在膀胱癌中的功能及分子机制研究目的:分别采用敲低和过表达肿瘤细胞中的CDCA5表达量,观察膀胱肿瘤细胞系增殖凋亡及细胞周期的改变。进一步研究CDCA5在肿瘤发展中调控的分子信号通路,寻找潜在的治疗靶点。方法:1)通过转染外源性干扰和过表达的慢病毒,分别构建敲低CDCA5的稳定转染细胞株（T24和5637）或过表达稳定转染细胞株（UMUC3）。通过体外实验,如Cell Counting Kit-8（CCK-8）实验,克隆形成实验,周期凋亡流式实验,来初步研究CDCA5在膀胱肿瘤细胞系中增殖、细胞周期及凋亡的相关作用。2)通过Western Blot探索CDCA5影响膀胱肿瘤细胞周期的可能机制,寻找CDCA的表达和相关周期蛋白的关联。3)通过Western Blot探索CDCA5影响膀胱肿瘤细胞增殖的可能机制,寻找潜在的小分子治疗靶点。4)通过在裸鼠体内的肿瘤细胞皮下成瘤实验,研究CDCA5在体内成瘤过程中的作用和影响。5)通过TCGA膀胱肿瘤数据库中甲基化测序的数据,分析CDCA5启动子区域的甲基化水平改变。结果:1)CCK8和克隆形成实验表明敲低CDCA5的表达水平后,膀胱肿瘤细胞的活性、增殖能力显着降低,而过表达CDCA5后,膀胱肿瘤细胞的活性、增殖能力升高。2)细胞功能学实验结果表明,低表达CDCA5能够通过影响细胞G2/M期进展和促进细胞凋亡来抑制膀胱肿瘤细胞的增殖能力;反之,高表达CDCA5能够促进细胞G2/M期进展和抑制细胞凋亡来促进膀胱肿瘤细胞的生长。3)Western Blot实验结果表明,CDCA5通过上调两个关键的细胞分裂周期相关蛋白——细胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2,CDC2）和周期蛋白B1（cyclin B1）,同时激活Akt信号通路来调控肿瘤细胞的增殖。进一步研究发现CDCA5调控的细胞凋亡主要是通过线粒体凋亡通路的调控来影响肿瘤细胞的增殖。4)采用Akt的小分子激动剂SC-79实验表明,Akt的激活后可以挽救敲低CDCA5后导致的细胞增殖减慢。5)裸鼠的皮下成瘤实验结果表明,CDCA5低表达组的瘤体在重量和体积上均明显低于对照组,免疫组化分析表明低表达组的Ki67,Cyclin B1和p-Akt表达水平较对照组显着降低,而cleaved-Caspase3的表达水平较对照组升高。6)通过TCGA数据库分析CDCA5启动子区域的CpG位点的甲基化水平发现,肿瘤组织中CDCA5启动子区域的甲基化水平较癌旁正常组织显着降低,提示CDCA5在膀胱肿瘤组织中的异常表达可能和其启动子区域的异常甲基化相关。结论:1)CDCA5增强膀胱肿瘤细胞的活性和增殖能力,同时抑制肿瘤细胞的凋亡,体内实验表明其可以促进裸鼠皮下瘤体的生长和增殖。2)在分子水平上,CDCA5通过调节细胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2,CDC2）和周期蛋白B1（cyclin Bl）等周期相关蛋白促进G2/M期进展,并通过调控线粒体凋亡通路相关蛋白（Caspase3,Caspase9,Bax,Bcl2,Bcl-XL等）调控肿瘤细胞的凋亡。3)CDCA5在膀胱肿瘤中通过激活Akt通路,从而促进膀胱肿瘤细胞的增殖和生长。4)裸鼠皮下成瘤实验表明当敲低CDCA5的表达水平后,瘤体的形成受到抑制。5)CDCA5在膀胱肿瘤中的异常表达可能和其启动子区域的甲基化水平改变相关。第三部分 一个基于DNA甲基化的肌层浸润性膀胱肿瘤的预后模型目的:通过对TCGA数据库中的甲基化测序结果（Methylation 450K）,寻找肿瘤组织中和癌旁正常组织中差异甲基化探针,结合统计学分析R语言包和肿瘤患者的预后资料进一步建立能够预测膀胱肿瘤预后的DNA甲基化探针预后模型。方法:通过分析TCGA数据库中的资料,我们建立了一个基于DNA甲基化探针的肌层浸润性膀胱肿瘤总体生存时间（OS）的预测模型。首先,我们筛选出在膀胱肿瘤组织和癌旁正常组织中具有表达差异的甲基化探针,通过COX分析我们进一步筛选出与预后相关的差异性探针,随后我们通过LASSO（Absolute shrinkageand selection operation）建立预后预测模型。这个模型通过计算每个病人的危险评分（Risk score,RS）来评价每个膀胱肿瘤患者是低风险患者或是高风险患者。进一步该模型在验证组中进行了进一步的验证。最终,我们通过对临床上常用的预后评价因子以及RS分别做ROC曲线来比较我们的模型的预测价值。随后,将RS预后模型联合CDCA5的表达水平做亚组的OS生存曲线,观察亚组间的预后差异。结果:通过对TCGA膀胱肿瘤数据库中413例肌层浸润性膀胱肿瘤DNA甲基化测序数据的分析,我们建立了一个基于DNA甲基化探针的预后风险评估模型。该模型由7个甲基化特异性探针构成,它能够把膀胱肿瘤患者进一步分成高风险组和低风险组,高危组和低危组之间的总体生存时间存在显着性差异（训练组（Training）:HR=2.660,95%CI=1.718-4.118,P=0.000011;测试组（Testing）:HR=1.966,95%CI=1.099-3.514,P=0.02）。同时 ROC 曲线的 AUC 值在训练（Training）组（n=276）和测试（Testing）组（n=137）分别为（Training:3 年 AUC=0.73,5年 AUC=0.75;Testing:3 年 AUC=0.65,5 年 AUC=0.65）,这一结果较临床上常用的TNM预测模型（T分期,N分期,Stage等）对膀胱肿瘤患者预后的预测准确性更高。此外,应用该模型能够进一步地将T2、T3-T4膀胱肿瘤患者,NO、N1-N3膀胱肿瘤患者,以及stage Ⅰ-Ⅱ、stageⅢ-Ⅳ膀胱肿瘤患者分成高危组和低危组,且高危组和低危组的OS具有显着性的差异（P值均小于0.05）。结合RS评分能进一步将CDCA5低表达组和高表达组分成低危组和高危组,两组间的OS具有显着性的差异（P值均小于0.05）。结论:基于DNA甲基化的风险评估模型能够提高临床上对膀胱肿瘤患者预后的预测准确性,能够指导临床医生对肌层浸润性膀胱肿瘤患者的治疗方案的选择。
尉春晓[5]（2019）在《核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景膀胱癌的发病率在泌尿生殖系统恶性肿瘤中位居前列,每年全世界大约有43万人被诊断为膀胱癌。如此庞大的患病人群,不仅对泌尿外科、肿瘤科等相关领域的临床和基础工作者提出了严峻的挑战,更是对经济社会发展造成了巨大的负担。因此,如何更早期准确的诊断、更精准有效的治疗成为摆在膀胱癌基础和临床工作者面前的一道难题。膀胱癌的发生、发展、对各种治疗方案的疗效反应和预后,均与其分子生物学特征密切相关。目前,膀胱癌的分子生物学研究已经进入了一个崭新的发展阶段,这得益于膀胱癌基因组学、转录组学和蛋白质组学方面基础理论的不断完善和相关实验技术的迅猛发展。目前膀胱癌的诊断仍主要依赖于膀胱镜检查,但是作为一种有创性检查,膀胱镜检查不仅给患者身体带来不可避免的痛苦,增加了患者的心理负担,而且有尿路感染、出血和尿道损伤的风险。因此,临床上急需一种创伤小、敏感性和特异性均高的无创性检查方法来协助膀胱癌的诊断。尿液脱落细胞学检查作为一种无创性的诊断方法,一开始被寄予厚望,但是由于其敏感性和特异性均不高,尚无法取代膀胱镜在膀胱癌诊断中的主导地位。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,分子肿瘤标记物在膀胱癌无创性诊断中的研究也日新月异,但是目前尚无一种标记物被指南推荐可以取代膀胱镜检查的地位,仍需更多更加深入细致的基础和临床研究来寻找和筛选理想的膀胱癌分子标记物。对于转移性膀胱癌等晚期患者,目前临床上的治疗以全身化疗为主,但是20多年以来膀胱癌的一线全身化疗药物主要是基于顺铂的方案,无明显进展。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,膀胱癌的靶向治疗迎来了发展的新阶段。靶向治疗的目标是干扰肿瘤特异性的信号通路,其中一些靶向治疗的药物已经进入临床试验阶段。但是由于膀胱癌的多样性和个体差异,单纯一种或几种靶向药物无法有效治疗所有的晚期膀胱癌。因此,仍需更多的基础和转化研究来为临床治疗提供更多更有效的靶向药物。PNO1基因位于人染色体2p14,由7个外显子和6个内含子组成,其编码的PNO1蛋白是一种核仁蛋白。核糖体是细胞合成蛋白质的场所,被誉为“细胞的蛋白质工厂”,由大小两个亚基组成,许多蛋白都参与到了核糖体小亚基成熟的晚期阶段,其中就包括PNO1蛋白。目前有关PNO1基因的基础研究非常少,而该基因在人膀胱癌中的表达情况和作用机制,目前尚无深入系统的研究。本研究力求通过研究PNO1基因在膀胱癌中的表达情况和作用机制,能为膀胱癌的分子肿瘤标记物诊断和靶向治疗提供新的、有价值的理论依据和实验基础。研究目的本研究拟通过检测PNO1基因在膀胱癌临床标本和细胞系中的表达情况,分析其与膀胱癌病理分级和临床分期的关系;拟利用RNA干扰技术靶向干扰PNO1基因,然后进行体内外实验以研究其对膀胱癌细胞生物学行为的影响,并探究可能的下游基因和相关通路。实验方法1.PN01基因在人膀胱癌临床标本和细胞系中的表达研究1.1免疫组织化学染色法检测膀胱癌标本中PN01蛋白的表达将石蜡包埋的人膀胱癌临床标本进行免疫组织化学染色,然后在显微镜下观察组织切片,进行视野拍照,并采集图像。根据显微镜下观察到的染色范围和染色程度这两个方面进行评分来判定蛋白表达情况,并研究其与肿瘤的病理分级和临床分期之间的关系。1.2实时定量PCR检测膀胱癌细胞系中PN01基因的表达首先设计合适的PCR反应所需要的引物,再提取人膀胱癌细胞系T24和5637中的RNA,同时提取对照细胞系人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中的RNA,反转录获得cDNA,在配置完成反应体系后,进行实时定量PCR（Real-time PCR）检测,最后采用仪器自带软件进行数据分析。2.干扰PN01基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响和其下游基因及调控通路研究2.1 PN01基因的RNA干扰靶点设计、慢病毒载体构建首先以PNO1基因为模板,设计干扰靶点,再根据干扰靶点序列设计shRNA干扰序列,进行RNA干扰慢病毒载体的构建,获得携带RNA干扰靶点序列的慢病毒载体。2.2 PN01基因的RNA干扰慢病毒包装首先进行质粒转染,然后进行慢病毒收获与浓缩:收集转染后的293T细胞上清液,经高速离心等处理后收获上清,获得PNO1-shRNA慢病毒颗粒,按要求分装在病毒管中,-80℃保存。2.3 PN01-shRNA慢病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞将GFP（绿色荧光蛋白）标记的PNO1-shRNA慢病毒和对照组病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞,感染后72 h左右,使用荧光显微镜观察GFP的表达情况,筛选出细胞状态良好的感染效率合格组,用于下游检测。2.4检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达情况（1）实时定量PCR检测mRNA水平PNO1基因敲减效率将5637和T24人膀胱癌细胞分为两个实验组:shCtrl组（阴性对照病毒感染组）和shPNO1组（PNO1基因shRNA慢病毒感染组）。然后采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后其mRNA的表达量。（2）Western Blotting检测靶点干扰后PN01基因的蛋白水平表达将5637和T24人膀胱癌细胞分为shCtrl组和shPNO1组两个实验组,然后将细胞样本裂解后提取细胞内的总蛋白,再进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹（转膜）、抗体杂交,最后行X光显影。2.5检测干扰PN01基因对5637和T24人膀胱癌细胞生长和增殖的影响（1）Cel igo细胞计数检测细胞生长将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后进行铺板,每天用Celigo细胞计数仪检测一次,准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量,根据细胞计数值和时间点,绘制基于细胞计数值的细胞生长曲线和基于细胞增殖倍数的生长曲线。（2）细胞活力检测先将经过胰酶消化后处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞悬液进行铺板、培养,然后依次加入噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT）和二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒颗粒,最后用酶标仪检测其吸收值,进行数据统计分析。（3）细胞克隆形成检测先将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后,制成细胞悬液、进行接种培养,荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照。最后用多聚甲醛固定细胞、GIEMSA染液染色,用数码相机拍照、计算克隆数。2.6流式细胞仪检测干扰PNO1基因对膀胱癌细胞凋亡的影响首先将shCtrl组和shPNO1组细胞接种于6孔板上,常规培养,诱导凋亡,于感染后第5天用胰酶消化,制成细胞悬液,再进行离心、Annexin V-APC染色,最后上机检测处于凋亡状态的细胞数量来检验PNO1基因与细胞凋亡的关系。2.7筛查PNO1基因的下游基因并进行Western Blotting验证分别提取shCtrl组和shPNO1组的总RNA,体外反转扩增后置入基因芯片中进行杂交、洗染、扫描,获得数据,筛选出有显着差异表现的基因,利用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析软件对差异基因结果进行分析,初步筛查出PNO1基因调控的下游基因,并绘制出基因网络图。最后对筛查出的PNO1基因的下游基因进行Western Blotting验证。2.8研究PNO1基因的下游调控通路使用IPA基因通路分析软件,对基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的800条信号、代谢通路进行整合分析,初步筛查出差异基因富集的信号通路。然后使用 PathScan（?）Intracellular Signaling Antibody Array Kit（信号通路蛋白抗体芯片）检测和比较shCtrl组和shPNO1组中信号通路关键信号分子的变化,研究PNO1基因在膀胱癌中的相关调控通路。实验步骤包括细胞裂解、孵育,与抗体检测液、HRP、化学发光试剂反应,显影成像和分析。2.9实时定量PCR检测PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因的表达采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达情况,以验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。3.干扰PNO1基因对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究3.1建立膀胱癌的裸鼠移植瘤模型将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组成瘤细胞经过胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,按照每组10只裸鼠将准备好的成瘤细胞注射至裸鼠右侧腋下的皮下组织内,仔细喂养裸鼠并观察生长状况。3.2移植瘤体积重量测量和活体成像检测每周收集两次常规观察指标的数据,包括裸鼠重量、移植瘤瘤体长短径等。在皮下注射成瘤细胞36天后进行活体成像检测,结束后处死裸鼠,取出肿瘤,拍摄裸鼠和移植瘤照片,称重、测量、整理数据。3.3免疫组织化学染色法检测移植瘤组织中Ki-67蛋白的表达情况先将瘤体组织进行石蜡包埋固定,再进行切片、脱蜡和水化处理,然后对瘤体切片进行Ki67抗体标记,经显色与封片后于显微镜下观察,拍照,然后进行数据整理和分析。3.4实时定量PCR检测移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况采用实时定量PCR方法检测膀胱癌移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况,以研究干扰PNO1基因对移植瘤组织细胞凋亡的影响。3.5实时定量PCR检测干扰PNO1基因对移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响采用实时定量PCR方法检测干扰PNO1基因对膀胱癌移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响,在体内条件下验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。4.统计分析使用SPSS 25.0对数据进行统计分析。根据数据类型选择相应的统计分析方法,计数资料选用卡方检验或Fisher精确检验,计量资料选用方差分析或t检验。以平均值±标准差表示计量资料,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果1.1 PN01蛋白在膀胱癌组织中均阳性表达并且与病理分级和临床分期有关免疫组化染色显示PNO1蛋白在正常膀胱组织中表达很少,而在低级别和高级别膀胱癌组织中则均阳性表达。分别按照临床分期和病理分级将膀胱癌标本进行分组对比研究,结果显示临床分期越晚,病理分级越高,PNO1蛋白的表达越高。1.2 T24和5637人膀胱癌细胞中PN01基因的mRNA表达升高采用实时定量PCR方法检测了 T24和563 7这两种膀胱癌细胞中PNO1基因的mRNA表达量,通过与人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中PNO1基因的mRNA表达量进行对比分析,结果显示在T24和5637细胞中PNO1基因均有高丰度的mRNA表达。2.1 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞系的构建成功利用RNA干扰技术构建了 PNO1基因敲减质粒,经慢病毒包装、感染,从而建立了 PNO1低表达的5637和T24膀胱癌细胞系模型。2.2 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达明显下调（1）实时定量PCR方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其mRNA的表达量显着下降实时定量PCR检测结果显示,经PNO1基因shRNA慢病毒感染后,与shCtrl组相比,shPNO1组5637细胞和T24细胞中PNO1基因在mRNA水平的表达量均受到抑制,敲减效率分别达到58.6%和71.5%。（2）Western Blott i ng方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其蛋白表达量显着下降Western Blotting方法检测PNO1基因干扰后5637和T24人膀胱癌细胞中相应蛋白的表达量,结果显示shPNO1组中PNO1蛋白表达水平较shCtrl组显着降低,具有统计学差异。2.3 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的生长和增殖受到明显抑制（1）Celi go细胞计数检测细胞生长Celigo细胞计数仪观察结果显示,自扫板观察的第3天开始,shPNO1组的细胞数量开始逐渐下降,而shCtrl组细胞数量仍然持续增加,表明shPNO1组膀胱癌细胞的增殖受到明显的抑制。（2）细胞活力检测MTT法检测结果显示,shPNO1组膀胱癌细胞在酶标仪对波长490nm光的吸收率明显低于shCtrl组,提示shPNO1组膀胱癌细胞的增殖活力受到明显的抑制。（3）细胞克隆形成检测shPNO1组的克隆形成数量和平均克隆数明显低于shCtrl组,具有统计学差异,表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组细胞的克隆形成能力受到明显的抑制,提示干扰PNO1基因对膀胱癌细胞增殖有抑制作用。2.4 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的细胞凋亡率明显增加流式细胞仪检测结果显示,shPNO1组的细胞凋亡率明显高于shCtrl组,具有统计学差异（p<0.01）。这表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组的细胞凋亡数量增加,提示PNO1基因有抑制膀胱癌细胞凋亡的作用。2.5基因芯片联合IPA分析初步筛查出PNO1基因的下游基因采用基因芯片技术初步筛选出了在shCtrl组和shPNO1组中基因表现有显着差异的基因,结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组的上调基因数有675,下调基因数868。然后在IPA数据分析软件中输入基因芯片分析的差异基因结果,初步筛查出了 PNO1基因调控的下游基因CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,F3,CXCL8 和 FOSL1。2.6 Western Blotting验证后确定PN01基因的下游基因Western Blotting方法检测结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组中除F3蛋白外,CD44蛋白、CCND1蛋白、FOSL1蛋白、PTGS2蛋白、CDK1蛋白和CXCL8蛋白表达均显着下调。这提示PNO1基因在T24膀胱癌细胞通过调控CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8 和 FOSL1 基因发挥作用,F3 基因则被排除。2.7 PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌细胞的增殖通过IPA分析软件整合分析基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的信号通路,初步筛查出包括mTOR信号通路在内的十大信号通路。然后使用抗体芯片检测,结果显示shPNO1组中的多个信号通路关键蛋白均下调,其中mTOR和p70 S6激酶的表达水平显着下调,具有统计学意义。这提示PNO1基因通过调控mTOR、p70 S6激酶所在的mTOR信号通路进而对膀胱癌细胞的增殖产生影响。2.8 PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达下调实时定量PCR检测结果显示,PNO1基因干扰后5637和T24膀胱癌细胞中shPNO1组的mTOR基因mRNA的表达量明显低于shCtrl组。3.1干扰PNO1基因可抑制T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长定期观察shCtrl组和shPNO1组裸鼠的生长状况、测量裸鼠的体重和肿瘤大小,结果显示,随着时间的延长,两组移植瘤模型之间肿瘤体积的差距逐渐加大。shPNO1组的肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于shCtrl组,表明体内条件下抑制PNO1基因的表达,可导致膀胱癌细胞在体内增殖速度减低,同时致瘤能力也受到抑制。3.2活体成像显示干扰PN01基因后T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长受到抑制对两组裸鼠进行了活体成像检测,获得了每只实验裸鼠的区域内总荧光表达量等相关观察指标。结果显示shPNO1组的区域内总荧光表达量为明显低于shCtrl组,具有统计学差异,提示干扰PNO1基因可在体内条件下抑制膀胱癌细胞的增殖和移植瘤的生长。3.3干扰PNO1基因后移植瘤中Ki67蛋白表达明显下调利用免疫组化染色法对裸鼠移植瘤瘤体组织中细胞增殖标记物Ki67蛋白表达情况进行了对比分析,结果显示shPNO1组瘤体组织中Ki67阳性细胞百分比明显低于shCtrl组,表明干扰PNO1基因会使膀胱癌细胞在体内的增殖受到抑制。3.4干扰PNO1基因后移植瘤组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高实时定量PCR结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组瘤体组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,提示干扰PNO1基因可在体内条件下促进细胞凋亡。3.5干扰PN01基因后移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达下调实时定量PCR结果显示,shPNO1组瘤体组织中mTOR基因mRNA表达量明显低于shCtrl组,提示在体内条件下PNO1基因通过调控mTOR通路对移植瘤的生长增殖产生影响。实验结论1.在人膀胱癌临床标本和细胞系中,PNO1基因均阳性表达,并且肿瘤的临床分期和病理分级越高,PNO1蛋白的表达量也越高。2.体外实验中干扰PNO1基因后膀胱癌细胞的生长状况、细胞活力和克隆形成能力均受到显着抑制,而凋亡数量明显增加,表明PNO1基因在膀胱癌中具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。进一步的机制研究表明,PNO1基因通过调控mTOR信号通路对膀胱癌细胞的生长增殖产生影响,并且CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8和FOSL1等基因参与其中。3.体内实验中干扰PNO1基因后裸鼠膀胱癌移植瘤的生长状况和活体荧光表达量受到显着抑制,瘤体组织的Ki67蛋白表达水平明显降低,Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,mTOR基因mRNA表达下调,表明体内条件下干扰PNO1基因可通过调控mTOR信号通路,有效抑制膀胱癌细胞的增殖、促进凋亡。
李林锦[6]（2019）在《miR-618在膀胱癌中的作用及机制研究》文中指出膀胱癌是最为常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,目前其发病率正逐年上升。膀胱癌在男性所有恶性肿瘤中排名第四,在女性中排名第十位。根据细胞的生物学特征,膀胱癌可分为肌层浸润型膀胱癌与非肌层浸润型膀胱癌两大类,其中以非肌层浸润型膀胱癌居多。膀胱癌患者早期死亡率不高,一旦出现侵袭、转移死亡率会明显升高。研究显示,在膀胱癌诊断时已经有1/3患者发生转移或者局部浸润,因此,寻找一种能够使我们进一步了解膀胱癌发展、转移的分子标记物迫在眉睫。miRNA是一类非编码RNA,长度约为10-22核苷酸,在人类基因组中约有2000多种。其可通过3’ UTR结合区域与靶基因信使结合,降解靶基因或抑制靶基因的翻译,进而调控基因水平、调控细胞生长、分化。大量研究表明,miRNAs的异常表达与癌症相关,其表达变化可引起胃癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌等多种肿瘤性疾病的发生发展。有研究表明,在膀胱癌中,miRNA也存在表达差异。miRNA可以通过多种途径调控膀胱癌细胞的凋亡、增殖、转移等,对其深入研究,有望发现膀胱癌诊断及治疗的新的临床靶点。miR-618是miRNA家族成员之一,已有多种研究表明,miR-618可通过调节TGF-β2、CBX8信号通路、PI3K/Akt通路,转移foxp2、调控TIMP-1的表达等参与胃癌、肝癌、乳腺癌、甲状腺癌、肺癌等多种肿瘤性疾病的发生发展。但是miRNA-618在膀胱癌中的作用,国内外相关研究报道尚少。本课题旨在观察膀胱癌组织及细胞中miR-618的表达变化情况及miR-618的表达变化对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响,阐明miR-618对膀胱癌发展的作用及其可能的分子机制。本学位论文由以下三部分组成:第一部分miR-618在膀胱癌中的表达特点目的:研究膀胱癌组织及细胞系中miR-618的表达变化。方法:收集膀胱癌患者的膀胱癌组织及其配对癌旁组织;体外培养膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1及HTB-9等膀胱癌细胞系,应用Real-time PCR方法检测膀胱癌组织及细胞中miR-618较对照组的表达变化。结果:1.miR-618在膀胱癌组织中表达较其配对正常癌旁组织明显升高我们应用Real-time PCR检测了所收集的膀胱癌组织及其配对的正常癌旁组织中miR-618的表达情况。结果显示,miR-618在膀胱癌组织中表达水平明显高于其配对的癌旁正常组织中的表达水平。2.miR-618在膀胱癌细胞中表达明显升高我们以人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1为正常对照组,HTB-9、CCC-HB-2等膀胱癌细胞系为实验组,应用Real-time PCR检测了所有细胞中miR-618的表达情况。结果显示,miR-618在膀胱癌细胞中的表达高于正常膀胱上皮细胞。结论:miR-618于膀胱癌组织及HTB-9等膀胱癌细胞系中表达水平增多。第二部分miR-618促进膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化目的:研究升高和敲低miR-618表达对膀胱癌细胞增殖、侵袭及迁移等生物学行为的影响作用和对膀胱癌细胞发生EMT的影响作用。方法:将人工合成的miR-618正义序列（miR-618 mimics）及反义序列（miR-618 inhibitor）转染入膀胱癌细胞系中,以建立miR-618过表达和低表达的膀胱癌细胞系。应用real-time PCR方法检测miR-618表达情况,应用CCK-8、平板克隆实验等方法检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞的活性及增殖能力变化。应用细胞划痕实验检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞迁移能力的变化。应用transwell小室实验检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞侵袭能力的变化。应用细胞免疫荧光实验、westernblotting实验检测miR-618表达改变后膀胱癌细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin、snail等蛋白的表达变化,以观察膀胱癌细胞EMT发生的变化情况。结果:1.成功建立miR-618过表达及低表达的膀胱癌细胞株将miR-618 mimics,miR-618 inhibitor转染入膀胱癌细胞系中,增强或抑制了miR-618的表达,成功在膀胱癌细胞系中过表达及抑制了 miR-618表达。2.上调miR-618表达可促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为①利用CCK-8法检测细胞活性,结果显示出,在同一检测时间点内,转染miR-618 mimics的膀胱癌细胞的细胞活力较转染mimics-NC的细胞明显增高。②平板克隆实验法检测细胞增殖,结果显示出,转染miR-618 mimics的膀胱癌细胞细胞集落数明显高于转染mimic-NC的细胞。③应用创伤愈合实验评估细胞迁移行为,结果显示出,转染mimic-618组的膀胱癌细胞划痕愈合较mimic-NC组划痕愈合明显增快。④应用transwell小室实验评估细胞侵袭行为,结果显示出,转染mimic-618组的膀胱癌细胞侵袭能力较mimic-NC组明显增快。⑤通过应用裸鼠体内的肿瘤增殖实验,评估肿瘤细胞体内的增殖行为,结果显示出,mimic-618组的小鼠体内肿瘤增长速度较mimic-NC组明显增快。这些数据说明,上调miR-618表达可促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为。3.敲低miR-618表达可抑制膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为①利用CCK-8法检测细胞活性,结果显示,在同一检测时间点内,转染miR-618 inhibitor的膀胱癌细胞的细胞活力较转染inhibitor-NC的细胞明显减弱。②平板克隆实验法检测细胞增殖,结果显示,转染miR-618 inhibitor的膀胱癌细胞细胞集落数明显少于转染inhibitor-NC的细胞。③应用创伤愈合实验评估细胞迁移行为,结果显示,转染inhibitor-618组的膀胱癌细胞划痕愈合较inhibitor-NC组划痕愈合明显减慢。④应用transwell小室实验评估细胞侵袭行为,结果显示,转染inhibitor-618组的膀胱癌细胞侵袭能力较inhibitor-NC组明显减慢。这些数据说明,敲低miR-618表达可抑制膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为。4.miR-618表达变化可影响EMT的发生①细胞免疫荧光染色检测E-cadherin、vimentin蛋白的表达,结果显示,转染mimic-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显下降,而Vimentin蛋白的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显增多。反之,转染inhibitor-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显上升,而Vimentin蛋白的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显下降。②Westernblotting方法检测E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表达情况,结果显示,转染mimic-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显下降,而N-cadherin和Snail蛋白的表达较转染mimic-NC的膀胱癌细胞明显增多。反之,转染inhibitor-618的膀胱癌细胞中E-cadherin的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显上升,而N-cadherin和Snail蛋白的表达较转染inhibitor-NC的膀胱癌细胞明显下降。5.miR-618通过促进EMT的发生促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭应用EMT抑制剂抑制膀胱癌细胞EMT的发生后,再次分别应用mimic-618及mimic-NC转染该膀胱癌细胞,与转染mimic-NC的膀胱癌细胞相比,转染mimic-618的膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭能力无明显比变化。该结果提示,miR-618通过促进EMT发生来促进膀胱癌细胞的增殖、迁徙及转移等生物学行为。结论:升高miR-618表达,可以促进膀胱癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮间充质转化的发生。反之,抑制miR-618表达可抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭、迁移及上皮间充质转化的发生。miR-618通过促进EMT的发生促进膀胱癌细胞增殖、侵袭、迁移。第三部分miR-618通过TGF-β1/Smad通路促进EMT发生目的:探究miR-618促进膀胱癌发展的分子机制。方法:应用RNA沉淀（pulldown）技术及液质联质谱分析（liquidchromatography-mass spectrometry,LC-MS）寻找miR-618在膀胱癌细胞中特异结合的蛋白。应用Western Blotting及Real-time PCR实验检测目标蛋白及EMT发生过程中关键蛋白的变化情况。结果:1.miR-618在膀胱癌细胞中可与TGF-β1特异结合RNA pull down实验得到miR-618及考马斯亮蓝染色,发现与对照组蛋白溶液相比,miR-618组蛋白溶液中存在特异的蛋白条带。应用质谱分析方法检测发现miR-618可与TGF-β1特异结合。对TGF-βl进一步研究,Western Blotting及RIP实验进一步证实miR-618与TGF-β1特异结合。这些数据表明,miR-618可与TGF-β1特异结合。2.miR-618促进TGF-β1蛋白的分泌2.1上调miR-618表达可促进TGF-β1蛋白分泌Western Blotting 及 Real-time PCR 结果显示,上调 miR-618 表达不影响 TGF-β1蛋白的表达。ELISA结果显示,上调miR-618表达可促进TGF-β1蛋白分泌。这些数据表明,上调miR-618表达可促进TGF-β1蛋白分泌。2.2敲低miR-618表达可抑制TGF-β1蛋白分泌Western Blotting 及 Real-time PCR 结果显示,敲低 miR-618 表达不影响 TGF-β1蛋白的表达,ELISA结果显示,敲低miR-618表达可抑制TGF-β1蛋白的分泌。这些数据表明,敲低miR-618表达可抑制TGF-β1蛋白分泌。3.上调miR-618表达可通过TGF-β/Smad通路诱导EMT发生Western Blotting结果显示,上调miR-618表达后,膀胱癌细胞中Smad蛋白表达增多,E-cad蛋白表达减少,N-cad及Snail蛋白表达增多。上述实验结果表明,miR-618表达可通过TGF-β/Smad通路诱导EMT发生。结论:miR-618可通过与TGF-β1特异结合,促进EMT发生,以促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
金柯[7]（2019）在《miR-381-3p抑制膀胱癌的增殖及迁移作用的机制研究》文中研究表明膀胱癌在泌尿系统的恶性肿瘤疾病中发病率位居第二,每年在全世界范围内有两百万人罹患此病,近年来随着治疗技术的进步死亡率逐渐降低,但膀胱癌的进展与转移仍然危害着众多的患者。越来越多的研究显示DLK-DI03印记域的miRNA簇上的microRNA在多种肿瘤中发挥着作用。然而miR-381-3p作为其中的一类在膀胱癌上的作用机制尚无研究阐明。本研究发现了该印记域上MEG3的差异甲基化能调控膀胱癌细胞中miR-381-3p的表达量。我们也通过体外和体内实验发现过表达miR-381-3p可以抑制膀胱癌细胞增殖与迁移能力。我们通过生物信息学分析,Western Blot实验和双荧光素酶报告基因实验验证了 CDK6、CCNA2、MET是miR-381-3p直接的作用靶点。除此之外,我们发现miR-381-3p靶点中的CCNA2以及CDK6两者对细胞周期及增殖起调控作用。我们也验证了CCNA2经ROCK/AKT/β-catenin/SNAIL通路影响膀胱癌细胞的EMT进程,并根据此前报道的MET/AKT/GSK-3 β/SNAIL/EMT通路,我们认为SNAIL是miR-381-3p影响EMT进程的最终共同作用位点。进一步动物实验也证明了 miR-381-3p在体内同样发挥作用。总的来说,我们发现miR-381-3p对膀胱癌细胞的增殖迁移有抑制作用,并验证了其可能通过靶点CDK6、CCNA2、MET介导的通路发挥在膀胱癌中的生物学作用,这些结果为未来提供更新更可靠的膀胱癌治疗方法提供了思路。
叶挺宇[8]（2019）在《长链非编码RNA-linc00346在膀胱癌中的表达及其功能和机制的研究》文中提出研究背景长链非编码RNA（LncRNA）是指序列长度大于200个核苷酸、但无编码蛋白功能的一类RNA。LncRNA在多种恶性肿瘤中存在异常表达,并参与了对肿瘤发生发展的调控作用。目前关于膀胱癌中LncRNA的研究尚不多,其可能的作用机制仍不清楚。目的了解膀胱癌中LncRNA的表达情况,探索LncRNA-linc00346对膀胱癌细胞生物学行为的影响,并揭示其可能的作用机制。方法1.在6对膀胱癌及癌旁正常膀胱组织标本中进行基因芯片检测,观察LncRNA的差异表达情况,采用qRT-PCR验证基因芯片结果,并进行基因功能和信号通路等生物信息学分析,构建差异基因共表达网络。2.根据生物信息学分析结果,选出linc00346作为目标LncRNA进行深入研究。通过qRT-PCR在52例临床膀胱癌组织标本和膀胱癌T24、SW780细胞系中再次验证linc00346的差异表达情况。3.应用慢病毒载体介导的shRNA技术沉默linc00346在膀胱癌T24和SW780细胞系中的表达,然后进行一系列细胞功能试验,通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验、流式细胞术、Western Blot、裸鼠移植瘤模型等来研究沉默linc00346表达对膀胱癌细胞系生物学行为的影响。4.通过Western blot检测沉默linc00346后T24和SW780细胞系中PI3K/Akt通路PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达变化情况,并加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002进行进一步验证,初步探索linc00346影响膀胱癌细胞的机制。结果1.经过基因芯片筛选,得到了差异表达LncRNA共2548条（FC值>2.0）,其中在膀胱癌中表达上调的1539条,下调的1009条;明显表达差异（FC值>10）的LncRNA上调的有126条,下调的有103条。生物信息学分析显示LncRNAs和rmRNAs之间存在着密切的共表达关系,并选出了在膀胱癌中显着表达上调的linc00346进行功能及机制研究。2.linc00346在膀胱癌组织中表达水平较其癌旁正常组织明显上调,膀胱癌T24和SW780细胞系中linc00346的表达量均显着高于对照的正常人膀胱上皮HUM-CELL-0046细胞系。3.CCK-8、克隆形成实验、Ki67免疫组化、裸鼠移植瘤实验结果显示沉默linc00346可以抑制膀胱癌细胞的增殖能力;流式细胞术、Western blot检测发现沉默linc00346可以影响膀胱癌细胞周期,使肿瘤细胞停滞于G0/GI期,并加剧肿瘤细胞的凋亡;Transwell侵袭实验结果提示沉默linc00346能够削弱膀胱癌细胞的迁移及侵袭能力。4.沉默linc00346能够显着降低PI3K、Akt的磷酸化水平,即减弱了PI3K/Akt通路的激活。联合应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002时,其对PI3K、Akt磷酸化的抑制作用更加显着。结论1.膀胱癌组织中存在大量差异表达的LncRNAs,这些异常表达的LncRNAs可能与膀胱癌的发生和进展有关。2.linc00346在膀胱癌中表达显着上调,并且能够促进膀胱癌细胞增殖、减少细胞凋亡、增加癌细胞侵袭性和肿瘤转移等生物学行为。3.linc00346可能是通过激活PI3DK/Akt通路磷酸化来对膀胱癌细胞产生影响的。
秦杰[9]（2019）在《miR-424-3p在膀胱癌中的表达和顺铂耐药性关系的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究通过检测miR-424-3p在膀胱癌组织中的表达并分析其与膀胱癌患者临床病理参数的关系,同时通过体外细胞实验探讨miR-424-3p对膀胱癌细胞顺铂耐药性的影响以及相关机制,旨在明确miR-424-3p在膀胱癌细胞对顺铂耐药具体作用机制,为寻找新的膀胱癌治疗分子靶标、逆转膀胱癌顺铂耐药奠定理论和实验基础。方法:本研究选取40例膀胱癌组织和癌旁相应正常组织,检测其中miR-424-3p的表达,分析其与膀胱癌患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、复发等的关系。采用逐步递增顺铂浓度的方法建立膀胱癌顺铂耐药细胞系（T24/DDP）。采用MTT法检测该耐药细胞系的药物敏感性,检测该细胞系与亲本细胞系（T24）中miR-424-3p的表达。将miR-424-3p inhibitor转染T24/DDP细胞,对转染后的T24/DDP细胞利用MTT法检测其细胞增殖活性,并采用流式细胞技术对细胞凋亡率进行研究检测,之后利用transwell小室法及细胞划痕实验分别对细胞的侵袭能力和迁移能力进行检测分析。运用在线Targetscan与MicroCosm数据库查找miR-424-3p可能的靶基因,miR-424-3p通过miRBase数据库检索获得。3’UTR序列通过检索UCSC Genome Browser获得,同时利用pubmed进行blast比对进行确认。分别将携带有双荧光素酶报告基因的PTEN-MUT、PTEN-WT质粒与miR-424-3p共转染T24细胞,检测上述各组细胞中荧光素酶的活性。将miR-424-3p mimic转染T24/DDP细胞,检测细胞中PTEN mRNA和蛋白的表达。后续将T24细胞随机分为control组、DDP组、DDP+miR-424-3p组、DDP+miR-424-3p+PTEN组。对上述各组细胞分别采用MTT法检测其IC50,然后利用流式细胞技术检测细胞凋亡率,最后采用western blot法检测上述各组细胞中PTEN、PI3K、AKT、p-AKT蛋白的表达。结果:与癌旁正常组织相比,膀胱癌组织中miR-424-3p的表达显着增高。miR-424-3p的表达与膀胱癌患者的年龄、性别无关,而与肿瘤大小、组织学分级、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、1年内复发有关,即膀胱肿瘤越大、恶性化程度越高,则miR-424-3p的表达量也越高,1年内复发率也越高。本研究采用顺铂药物浓度递增的方法对T24细胞进行体外诱导,最终获得0.6μg/mL顺铂作用下稳定生长的耐药细胞系T24/DDP。MTT试验结果显示,T24/DDP细胞对顺铂的耐药指数（resistance index,RI）为9.55。T24/DDP细胞中miR-424-3p的表达水平较T24细胞明显增高（P<0.05）。在顺铂的作用下,miR-424-3p inhibitor组细胞的增殖活性较control组降低,其中在第72h和96 h时细胞的增殖活性明显低于control组（P<0.05）;miR-424-3p inhibitor组细胞的凋亡率较control组显着增高（P<0.05）,侵袭细胞数显着减少（P<0.05）,细胞迁移率明显降低（P<0.05）。经过检测PTEN为miR-424-3p的靶基因,miR-424-3p在PTEN上所绑定的位置位于3’UTR区域。在荧光素酶活性检测方面,与control组相比,PTEN-WT+miR-424组的活性显着降低（P<0.05）,而PTEN-MUT+miR-424组的荧光素酶活性则无明显变化（P>0.05）,提示PTEN为miR-424-3p的靶基因,其表达受到miR-424-3p的负调控。与control组相比,miR-424-3p-in组细胞中PTEN mRNA和蛋白的表达水平均显着增加（P<0.05）。与control组相比,DDP组细胞的IC50有所下降,但差异不显着（P>0.05）;DDP+miR-424-3p组较DDP组细胞的IC50显着增高（P<0.05）;与DDP组相比,DDP+miR-424-3p+PTEN组细胞的IC50显着降低（P<0.05）。与control组相比,DDP组细胞的凋亡率有所增高,但差异不显着（P>0.05）;DDP+miR-424-3p组较DDP组细胞的凋亡率显着降低（P<0.05）;与DDP组相比,DDP+miR-424-3p+PTEN组细胞的凋亡率显着增高（P<0.01）。在蛋白检测方面,与control组相比,DDP组细胞中PTEN、PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达无显着差异（P>0.05）;与DDP组相比,DDP+miR-424-3p组细胞中PTEN蛋白的表达水平显着降低（P<0.05）,PI3K和p-Akt蛋白的表达水平显着增高（P<0.05）,但Akt蛋白则无明显变化（P>0.05）;与DDP组相比,DDP+miR-424-3p+PTEN组细胞中PTEN蛋白的表达水平显着增高（P<0.05）,PI3K和p-Akt蛋白的表达水平显着降低（P<0.05）,但Akt蛋白则无明显变化（P>0.05）。结论:miR-424-3p通过抑制其靶基因PTEN的表达,调控PI3K/Akt信号通路,降低膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。
盖强强[10]（2019）在《miR-4324反馈环对膀胱癌生长的影响及机制研究》文中研究指明目的:通过收集中南医院泌尿外科膀胱癌组织和临近癌旁组织,进行微小RNA（micro RNA,miRNA）基因芯片检测,鉴定膀胱癌的有效miRNA指标,其中miR-4324的表达差异显着。然而,miR-4324在膀胱癌中的作用及分子机制并不明确。本研究旨在探讨miR-4324对膀胱癌细胞生长和转移等恶性生物学行为的影响及多柔比星耐药的作用,并探讨miR-4324的作用机制。方法:采用细胞功能实验检测miR-4324过表达对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,观察miR-4324在膀胱癌对多柔比星化疗敏感性的作用。建立体内异种移植模型探讨过表达miR-4324在体内对膀胱癌发生和转移的影响。采用生物信息学方法（miRNA靶基因预测数据库）和双荧光素酶报告基因检测等方法鉴定miR-4324的直接靶基因。通过寻找转录因子,探讨miR-4324的上游调控机制。结果:膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为被过表达的miR-4324抑制,miR-4324过表达可增强膀胱癌细胞对多柔比星的敏感性。miR-4324可通过与RACGAP1 mRNA转录本的3’-UTR结合而降低RACGAP1蛋白的表达。ESR1可能是正向调控miR-4324表达的转录因子,ESR1的表达降低引起miR-4324表达的降低。ESR1蛋白的低表达主要由于膀胱癌中ESR1基因启动子的异常甲基化。p-STAT3可通过与ESR1启动子结合诱导DNMT3B蛋白的富集,并进一步引起ESR1启动子的甲基化。RACGAP1可以诱导STAT3蛋白的磷酸化并促进其向细胞核的转运,从而进一步促进ESR1启动子的甲基化。结论:miR-4324、RACGAP1、STAT3和ESR1蛋白可形成负向反馈环,在抑制膀胱癌细胞的恶性生物学行为中发挥重要作用,miR-4324具有成为膀胱癌诊断、治疗以及判断预后的潜在靶标分子。
二、PTEN基因mRNA在膀胱癌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PTEN基因mRNA在膀胱癌中的表达（论文提纲范文）
（1）Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肿瘤转移 |
| 1.2 膀胱癌概述 |
| 1.3 Pokemon在肿瘤中的研究进展 |
| 1.4 IGFBP3在肿瘤中的研究进展 |
| 1.5 拟采取的技术路线 |
| 第2章 Pokemon在膀胱癌组织中的表达及生物学功能 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验步骤和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Pokemon在膀胱癌组织和细胞中明显上调 |
| 2.3.2 Pokemon表达水平与临床病理特点的联系 |
| 2.3.3 siRNA和过表达质粒的转染成功敲低/过表达Pokemon |
| 2.3.4 Pokemon促进膀胱癌细胞的侵袭迁移 |
| 2.3.5 Pokemon影响膀胱癌细胞的粘附作用 |
| 2.3.6 Pokemon促进膀胱癌细胞抵抗失巢凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Pokemon通过调控IGFBP3表达影响膀胱癌转移 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验步骤与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IGFBP3在膀胱癌中低表达 |
| 3.3.2 IGFBP3与临床病理特征的关系 |
| 3.3.3 siRNA和过表达质粒的转染成功敲低/过表达IGFBP3 |
| 3.3.4 IGFBP3抑制膀胱癌细胞的侵袭迁移 |
| 3.3.5 IGFBP3影响膀胱癌细胞的粘附能力 |
| 3.3.6 IGFBP3抑制膀胱癌细胞的失巢凋亡抵抗能力 |
| 3.3.7 IGFBP3影响黏着斑的形成 |
| 3.3.8 Pokemon可以通过调控IGFBP3的转录表达促进膀胱癌转移 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 Pokemon调控IGFBP3的表观遗传学机制及对RIG-1 通路的调控作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验步骤与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Pokemon影响IGFBP3启动子甲基化程度 |
| 4.3.2 Pokemon通过IGFBP3调节RIG-1信号通路 |
| 4.3.3 Pokemon-IGFBP3通路可以调节膀胱癌体内转移 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）BAG2通过PINK1/PTEN轴促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 实时荧光定量PCR实验 |
| 2.5 Western Blot实验 |
| 2.6 瞬时细胞转染实验 |
| 2.7 划痕实验 |
| 2.8 Transwell细胞迁移、侵袭实验 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 BAG2与膀胱癌的不良预后相关且表达越高预后越差 |
| 3.2 BAG2在膀胱癌组织和细胞中呈现明显的高表达 |
| 3.3 siBAG2可以明显下调BAG2的表达水平 |
| 3.4 沉默BAG2后膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力降低 |
| 3.5 沉默BAG2后PINK1表达水平下调而PTEN表达水平升高 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 BAG2与PTEN在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）长链非编码RNA SLCO4A1-AS1通过靶向miR-335-5p促进膀胱癌生长和侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 SLCO4A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 三、结果 |
| (一) SLCO4A1-AS1在膀胱癌组织和细胞系中高表达 |
| (二) SLCO4A1-AS1的表达和膀胱癌患者OS、T分期相关 |
| (三) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制膀胱癌细胞的增殖 |
| (四) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制膀胱癌细胞的克隆形成 |
| (五) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭 |
| (六) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制体内膀胱癌生长 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 SLCO4A1-AS1与靶标MIR-335-5P的关系 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 三、结果 |
| (一) 生物信息学预测SLCO4A1-AS1靶向miRNA |
| (二) miR-335-5p在膀胱癌组织和细胞系中低表达 |
| (三) miR-335-5p是膀胱癌预后的生物标志物 |
| (四) SLCO4A1-AS1与miR-335-5p之间呈负相关 |
| (五) 上调miR-335-5p抑制SLCO4A1-AS1的表达 |
| (六) 敲低SLCO4A1-AS1上调miR-335-5p的表达 |
| (七) miR-335-5p直接与SLCO4A1-AS1相互作用 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 SLCO4A1-AS1通过靶向MIR-335-5P上调OCT4表达 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 三、结果 |
| (一) 生物信息学预测miR-335-5p候迭靶基因 |
| (二) OCT4在膀胱癌组织和细胞系中高表达 |
| (三) OCT4是膀胱癌预后的生物标志物 |
| (四) miR-335-5p与OCT4、SLCO4A1-AS1与OCT4相关性分析 |
| (五) 上调miR-335-5p抑制OCT4的表达 |
| (六)miR-335-5p直接与OGT4相互作用 |
| (七)沉默SLCO4A1-AS1抑制OCT4的表达 |
| (八)过表达OCT4逆转SLCO4A1-AS1沉默对膀胱癌细胞的影响 |
| (九)过表达OCT4逆转SLCO4A1-AS1沉默对体内肿瘤的影响 |
| (十)抑制miR-335-5p能逆转SLCO4A1-AS1沉默对OGT4的作用 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 全文小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（4）CDCA5在膀胱癌中的促癌作用及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 CDCA5在膀胱癌膀胱肿瘤组织和膀胱肿瘤细胞系中的表达水平探讨 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CDCA5的mRNA和蛋白表达水平在膀胱癌组织中升高 |
| 3.2 CDCA5在膀胱肿瘤数据库中的表达情况,与临床特征、预后的相关性 |
| 3.3 CDCA5在膀胱癌细胞系中的表达量显着升高 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CDCA5在膀胱癌中的功能及分子机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Knock-Down慢病毒和过表达慢病毒的转染效率验证 |
| 3.2 CDCA5的表达对膀胱肿瘤细胞活性的影响 |
| 3.3 CDCA5的表达改变对膀胱肿瘤细胞增殖功能的影响 |
| 3.4 CDCA5的表达改变对膀胱肿瘤细胞周期的影响 |
| 3.5 CDCA5的表达改变对膀胱肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 3.6 CDCA5能够通过PI3K/AKT信号通路调控膀胱癌细胞的增殖 |
| 3.7 CDCA5对裸鼠皮下成瘤实验的影响 |
| 3.8 膀胱肿瘤中的CDCA5启动子区的甲基化水平改变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一个基于DNA甲基化的肌层浸润性膀胱肿瘤的预后模型 |
| 1 前言 |
| 2 方法 |
| 2.1 数据处理和分析 |
| 2.2 风险评估模型的建立 |
| 2.3 生存分析 |
| 2.4 联合CDCA5和RS对肌层浸润性膀胱肿瘤的预后预测 |
| 3 结果 |
| 3.1 TCGA膀胱肿瘤数据库中的数据获取和病人的临床资料及特征 |
| 3.2 DNA甲基化预后预测模型的建立 |
| 3.3 基于DNA甲基化探针的肌层浸润性膀胱肿瘤预后模型在训练组中的预测作用及在测试组中的进一步验证 |
| 3.4 基于DNA甲基化探针的肌层浸润性膀胱肿瘤预后模型对患者的预测准确性较临床上常用的指标要更准确 |
| 3.5 联合基于DNA甲基化的Risk score和临床指标能够进一步提高膀胱肿瘤预后的准确性 |
| 3.6 联合RS模型和CDCA5的表达水平对肌层浸润性膀胱肿瘤患者预后的预测评估 |
| 4 讨论 |
| 5 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 PI3K/AKT信号通路在膀胱肿瘤中的研究和治疗进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（5）核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 PNO1基因在人膀胱癌临床标本和细胞系中的表达研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 第二部分 干扰PNO1基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响和其下游基因及调控通路研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 第三部分 干扰PNO1基因对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 结果讨论 |
| 实验结论 |
| 研究总结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 膀胱癌的分子生物学研究进展及其应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（6）miR-618在膀胱癌中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分: miR-618在膀胱癌中的表达特点 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分: miR-618促进膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分: miR-618通过TGF-β1/Smad通路促进EMT发生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 博士期间发表论文及参加课题 |
| 致谢 |
（7）miR-381-3p抑制膀胱癌的增殖及迁移作用的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 1. 绪论 |
| 1.1 miRNA的生物学特性 |
| 1.2 膀胱癌的流行病学及治疗方法 |
| 1.3 miRNA在膀胱癌中的应用 |
| 2. miR-381-3p对膀胱癌细胞生物学行为的作用及分子机制 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 研究思路 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 结论 |
| 3. miR-381-3p靶基因调控膀胱癌生物学功能的机制探讨 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 研究思路 |
| 3.3 研究方法 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 总结 |
| 4. 探究miR-381-3p调控EMT的共同靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 研究思路 |
| 4.3 研究方法 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 结论 |
| 5. miR-381-3p在生物体内对膀胱癌的抑癌作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 研究思路 |
| 5.3 材料与方法 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 结论 |
| 6. 讨论与总结 |
| 6.1 评估了miR-381-3p在膀胱癌中的表达模式 |
| 6.2 评估了miR-381-3p在膀胱癌中的生物学功能并发现其直接靶点CDK6,CCNA2, MET |
| 6.3 miR-381-3p的靶基因CCNA2能同时抑制细胞周期和细胞的EMT进程 |
| 6.4 miR-381-3p靶点CDK6敲低抑制膀胱癌细胞增殖能力 |
| 6.5 发现SNAIL是miR-381-3p调节EMT进程的共同靶点 |
| 6.6 验证了miR-381-3p在生物体内同样对膀胱癌有抑制作用 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNA对肿瘤细胞周期的调节作用 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（8）长链非编码RNA-linc00346在膀胱癌中的表达及其功能和机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 膀胱癌差异表达长链非编码RNA的筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 linc00346在膀胱癌组织和细胞系中的表达及临床意义 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 linc00346对膀胱癌细胞生物学行为的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 linc00346对膀胱癌调控机制的初步研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 缩略词简表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间成果取得的成果 |
| 致谢 |
（9）miR-424-3p在膀胱癌中的表达和顺铂耐药性关系的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、miR-424-3p在膀胱癌中的表达及临床意义 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 临床患者组织样本 |
| 1.1.2 实验试剂及配置方法 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性 |
| 1.2.2 膀胱癌组织中miR-424-3p的表达显着增高 |
| 1.2.3 miR-424-3p与膀胱癌患者临床病理参数关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、miR-424-3p对顺铂耐药膀胱癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验所用细胞株及miR-424-3p inhibitor |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 主要实验试剂配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 T24和T24/DDP细胞对顺铂的敏感性 |
| 2.2.2 T24/DDP细胞中miR-424-3p的表达水平明显增高 |
| 2.2.3 转染后T24/DDP细胞中miR-424-3p表达检测 |
| 2.2.4 转染后细胞增殖活性检测 |
| 2.2.5 转染后细胞凋亡检测 |
| 2.2.6 转染后细胞侵袭能力检测 |
| 2.2.7 转染后细胞迁移能力检测 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、miR-424-3p靶向PTEN抑制膀胱癌顺铂耐药机制的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验所用细胞系 |
| 3.1.2 miR-424-3p mimic |
| 3.1.3 质粒 |
| 3.1.4 主要实验试剂 |
| 3.1.5 主要实验仪器 |
| 3.1.6 主要实验试剂配制 |
| 3.1.7 实验方法 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PTEN为 miR-424-3p的靶基因 |
| 3.2.2 PTEN表达受到miR-424-3p的负调控 |
| 3.2.3 miR-424-3p表达下调后T24/DDP细胞中PTEN mRNA和蛋白表达均显着增加 |
| 3.2.4 miR-424-3p靶向PTEN影响T24/DDP细胞IC50 |
| 3.2.5 miR-424-3p靶向PTEN影响T24/DDP细胞凋亡 |
| 3.2.6 miR-424-3p靶向PTEN影响PI3K/Akt通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 miRNA在膀胱癌中的研究进展及展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）miR-4324反馈环对膀胱癌生长的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分:膀胱癌miRNA基因芯片的筛选 |
| 1 材料及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分:miR-4324对膀胱癌生长影响的体外、体内研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分:miR-4324对膀胱癌影响的机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分:调控miR-4324表达的机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研学习成果 |
| 致谢 |
四、PTEN基因mRNA在膀胱癌中的表达（论文参考文献）
- [1]Pokemon靶向调控IGFBP3对膀胱癌转移的影响及其作用机制研究[D]. 韩健松. 吉林大学, 2021(01)
- [2]BAG2通过PINK1/PTEN轴促进膀胱癌细胞的迁移和侵袭[D]. 钱小锐. 中国医科大学, 2021
- [3]长链非编码RNA SLCO4A1-AS1通过靶向miR-335-5p促进膀胱癌生长和侵袭的机制研究[D]. 杨宇. 山东大学, 2020(10)
- [4]CDCA5在膀胱癌中的促癌作用及其分子机制研究[D]. 徐志杰. 浙江大学, 2020(01)
- [5]核糖体组装调控因子PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌增殖的机制研究[D]. 尉春晓. 山东大学, 2019(02)
- [6]miR-618在膀胱癌中的作用及机制研究[D]. 李林锦. 苏州大学, 2019(04)
- [7]miR-381-3p抑制膀胱癌的增殖及迁移作用的机制研究[D]. 金柯. 浙江大学, 2019(03)
- [8]长链非编码RNA-linc00346在膀胱癌中的表达及其功能和机制的研究[D]. 叶挺宇. 南方医科大学, 2019(09)
- [9]miR-424-3p在膀胱癌中的表达和顺铂耐药性关系的机制研究[D]. 秦杰. 天津医科大学, 2019(02)
- [10]miR-4324反馈环对膀胱癌生长的影响及机制研究[D]. 盖强强. 武汉大学, 2019(06)