一、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ,Ⅱ型胶原及碱性磷酸酶的表达（论文文献综述）
李豫皖[1]（2020）在《Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究》文中提出研究背景/目的:目前在构建骨组织工程中血管形成的作用越来越受到广泛关注,但在构建骨组织工程中,血管形成和成骨分化之间的分子机制目前尚未阐明。人羊膜间充质干细胞（Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC）是一种来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞具有向成骨细胞,成软骨细胞和成脂细胞等多系分化的能力,hAMSCs也具有良好的血管生成能力;Schnurri-3（Shn3）也称为人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白-3（human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 3,HIVEP3）属于BMP/TGF-?的同源物家族。由于Shn3在成骨细胞中的缺失导致Runx2蛋白水平升高进而增强骨形成;骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9）具有显着上调间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）中的各种成骨分化过程中成骨相关因子的表达也能够刺激血管生成相关因子表达。然而,目前Shn3是否能够调节以及如何调节BMP9诱导的hAMSCs在体内外成骨分化和血管形成尚不清楚。基于此,在本课题研究中探讨Shn3是否参与调节BMP9在体内和体外诱导的hAMSCs向成骨分化和血管形成作用的影响及其信号通路和分子机制。方法:（1）胰酶/胶原酶联合消化方法分离并培养hAMSCs,倒置相差显微镜观察其形态改变;使用第3代hAMSCs,通过流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞表面分子标志物的表达;免疫荧光染色鉴定hAMSCs中波形蛋白和CK-19的表达,检测对第3代hAMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化潜能。（2）通过构建重组腺病毒（adenovirus,Ad）外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Red fluorescent protein,RFP）（Ad-RFP）转染第3代hAMSCs后,观察转染效率,并使用qRT-PCR检测Shn3基因在细胞中的表达情况;使用碱性磷酸酶染色和生化定量检测第3、5和7天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的早期成骨分化效应;使用茜素红S染色和骨矿化定量观察第14和21天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的晚期骨矿化的作用,并使用qRT-PCR检测第7天时过表达Shn3对BMP9诱导的成骨相关基因Runx2（Runt related transcription factor 2）、骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）、I型胶原（Collagen type I,COL-I）、和成骨相关转录因子OSX（Osterix）的mRNA表达水平。（3）通过使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染技术,设BMP9组,Sim-Shn3组,BMP9+Sim-Shn3组和BMP9+Shn3组,分别转染第3代hAMSCs在24h后,将细胞打入裸鼠皮下形成裸鼠体内异位骨化的模型,在4周左右时收取异位骨块样本,并通过Micro-CT（μ-CT）对骨块扫描并行分析,对骨块行固定、包埋和切片染色,使用Masson’s Trichrome三色染色、H&E染色（hematoxylin and eosinstaining）对切片行骨小梁数量和分布进行分析,番红O固绿染色（Safranin O-fast green staining）染色观察异位成骨内软骨形成情况。使用免疫组织化学染色对各实验组异位骨块切片行染色观察,主要观察异位骨块内成骨相关指标包括OCN和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）以及血管形成相关分子如血管生成素-1（Angiopoietin 1,ANGPT1）和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在异位骨块中的数量和分布情况。（4）使用细胞免疫组化技术观察过表达或沉默Shn3腺病毒转染细胞后,对BMP9诱导的第3代hAMSCs血管分化指标VEGF的表达及分布。使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,与人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs）在Transwell小室内共培养,其中腺病毒转染的hAMSCs在上层,HUVECs细胞在下层,使用基质胶（Matrigel）铺于板底,观察HUVECs细胞的小管形成能力,简介检测过表达或沉默Shn3对BMP9诱导的hAMSCs血管形成能力。（5）使用电纺聚乳酸-羟基乙酸(poly（lactic-co-glycolic acid,PLGA）共聚物支架材料,将过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）对支架材料的机构和搭载细胞后的细胞长入情况进行观察和分析。通过使用上述支架材料搭载转染腺病毒后的各实验组细胞,在培养48h后,将PLGA-细胞复合物移植入小鼠背部皮下组织内,在5周后,收集小鼠背部皮下移植物样本,并对样本行大体观察移植物在体内的血管长入情况,之后对移植物样本行免疫组织荧光染色,观察其血管性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF）在移植物内的表达和分布。（6）使用蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,其成骨分化相关指标OCN、OPN和Runx2的蛋白表达水平;通过使用Western blot技术,检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对BMP/Smads经典的信号（Smad-1/5/8）进行蛋白印迹检测其表达;通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对成骨相关转录因子Runx2和VEGF的直接作用关系。结果:（1）使用胰酶和II型胶原酶联合消化方法可以一次性获得大量形态均一的hAMSCs;通过细胞传代之后到第3代hAMSCs时,hAMSCs可稳定表达波形蛋白,而低表达CK-19;流式细胞检测第3代hAMSCs细胞表面分子标志物符合MSCs鉴定的表型。第3代hAMSCs具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。（2）重组腺病毒外源性过表达BMP9（Ad-BMP9）、Shn3（Ad-Shn3）和沉默Shn3腺病毒（Ad-Sim-Shn3）以及红色荧光蛋白（Ad-RFP）成功转染第3代hAMSCs后,且qRT-PCR结果显示Shn3在72h左右达到峰值。ALP染色和碱性磷酸酶活性结果显示,在第3、5和7天时,外源性过表达Shn3减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应,而沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应;茜素红S染色和骨矿化定量结果提示在第14和21天时,外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的hAMSCs晚期骨矿化和钙结节的形成;qRT-PCR结果显示在第7天时,外源性过表达Shn3下调了BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关因子包括Runx2、BSP、COL-I和OSX的mRNA表达。（3）在上述Shn3抑制BMP9诱导的hAMSCs体外成骨分化的基础上,进一步研究了Shn3对BMP9诱导的裸鼠皮下异位骨形成的成骨分化的影响。使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染BMP9诱导的第3代hAMSCs细胞后制造的裸鼠异位成骨模型中,大体观察结果和micro-CT结果显示,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组异位成骨的骨体积减小。与其他组相比,BMP9+Sim-Shn3组具有较强的异位成骨能力。Micro-CT的分析结果显示外源性Shn3表达增加了BMP9在hAMSCs中诱导异位骨块的平均骨密度,相反,外源性过表达Shn3降低了BMP9诱导的hAMSCs异位骨形成的平均骨密度。骨组织形态学定量分析显示骨体积/总体积（Bone volume/total volume,BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular number,Tb.N）,骨小梁厚度（Trabecular thickness,Tb.Th）和骨密度（Bone mineral density,BMD）与BMP9组相比,在BMP9+Sim-Shn3组有显着增加,相反,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组的上述参数有不同程度的下降,但骨小梁分离度在各组中无明显差异。组织化学染色结果显示与BMP9组相比,Sim-Shn3可增加了BMP9诱导的异位成骨中小梁骨数量和骨基质的形成。而外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的骨基质形成,同时免疫组化染色结果显示沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的异位骨化中成骨相关因子OCN和OPN以及血管形成相关因子ANGPT1和VEGF的表达,但外源性过表达Shn3基因抑制了此种效应。（4）细胞免疫组化染色结果显示,在第7天是,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs血管分化相关指标VEGF的表达;免疫荧光染色结果显示HUVECs细胞表达内皮粘蛋白（Endomucin,EMCN）、CD31、VEGF和vWF分子的表达;在与HUVECs细胞使用Transwell共培养诱导小管形成实验结果同样显示,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs间接小管形成的能力。（5）在使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜结果显示,细胞在PLGA电纺支架中生长情况良好,多数细胞能够贴壁;PLGA-细胞复合物移植入小鼠皮下的血管形成实验样本大体观察结果显示,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的皮下血管长入,且样本的免疫荧光染色结果提示,较其他各组中,沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的血管形成相关分子vWF的表达。（6）Western blot结果显示,在第7天是,较其他各组,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关指标包括OCN、OPN和Runx2的蛋白水平表达;外源性过表达BMP9增强了Smad1/5/8的磷酸化水平,同时Sim-Shn3显着增强了BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化表达。ChIP分析结果表明,转录因子Runx2能够在BMP9诱导的hAMSC中与VEGF启动子区域相结合。且免疫沉淀和免疫印迹结果表明外源性沉默Shn3的表达能够增强BMP9诱导的细胞中转录因子Runx2对其下游分子VEGF启动子的活性,证明了转录因子Runx2与VEGF分子之间的直接作用关系。结论:（1）人羊膜间充质干细胞具有MSCs的基本表型,具有向多系分化的能力包括成骨、成软骨及成脂细胞的潜能。（2）外源性沉默Shn3基因表达能够增强BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化,而外源性过表达Shn3基因表达则减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化。在外源性沉默Shn3表达后,能够加强BMP9诱导的hAMSCs在体外的血管形成。（3）通过沉默Shn3基因表达可以在体内外促进BMP9诱导的早期和晚期成骨分化以及血管形成的这一过程中,这可能是通过增强BMP/Smads信号来介导,并且Shn3在参与调节BMP9诱导的hAMSCs成骨分化和血管形成的双向效应中,Shn3通过调节关键成骨转录因子Runx2,激活其下游分子VEGF以促进BMP9诱导的hAMSCs的成骨和血管生成方面,Shn3发挥了重要的作用。
朱云森[2]（2020）在《骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:正常的骨基质矿化是骨形成和骨修复重建的关键步骤;成骨细胞分泌的I型胶原组成基质的主要成分并提供矿化的基础框架结构,而非胶原蛋白参与并调控羟基磷灰石的有序沉积。骨粘连蛋白（osteonectin,ON）是一种重要的非胶原蛋白,又称为SPARC或BM-40,它对1型胶原和羟基磷灰石有高度的亲和力,参与了细胞外基质矿化的始末过程;同时作为重要的细胞外基质功能调节蛋白,骨粘连蛋白调节细胞外基质和胶原的合成,影响成骨细胞数量和功能,对矿化起重要的调控作用。P38 MAPK是丝裂原活化蛋白激酶,是细胞外信号向细胞内传导的重要通路,也是骨形成的重要信号枢纽,在不同的成骨信号的作用下,p38MAPK可以调节成骨细胞碱性磷酸酶的活性和矿化能力。既往骨粘连蛋白在矿化中的研究多集中于基因敲除的动物实验,本课题的目点是为骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化提供直接的实验依据,同时对p38 MAPK是否是其重要的信号传导途径进行实验研究,为有效干预骨基质矿化提供更多的作用位点。研究方法:第一部分:成骨细胞分离、培养与鉴定取新生SD乳鼠（出生48h内）的颅盖骨,采用酶交替消化法进行成骨细胞分离,利用差异贴壁法进行纯化,获得的成骨细胞使用碱性磷酸酶染色进行阳性率测定,茜素红染色检测矿化结节形成。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞矿化期OCN、OPN、BSP及p38 MAPK基因表达的影响研究分离培养获得的传代成骨细胞进行随机分组,分别加入不同浓度的大鼠重组骨粘连蛋白（SPARC/BM-40）:A组,空白对照组,不添加骨粘连蛋白;B组,0.01μg/ml骨粘连蛋白;C组,0.1μg/ml骨粘连蛋白;D组,1μg/ml骨粘连蛋白;E组,10μg/ml骨粘连蛋白;在第2、5及8d分别取材并提取各组RNA,通过RT-qPCR检测骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）、骨涎蛋白（BSP）及p38 MAPK的基因表达,明确骨粘连蛋白在成骨细胞矿化中的调控作用,并根据实验结果确定实验的最佳适宜浓度（骨粘连蛋白OPTIMA）及取材观察时间。第三部分:骨粘连蛋白对成骨细胞其它矿化指标的影响及SB203580（p38MAPK特异性阻断剂）的阻断效应研究根据第二部分实验结果,我们对骨粘连蛋白在成骨细胞中的正向调控作用进行进一步证实,同时对p38的具体作用进行研究,实验进行重新分组:空白对照组,不添加骨粘连蛋白;骨粘连蛋白OPTIMA组,添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h,再添加骨粘连蛋白OPTIMA;实验增加了小整合素结合配体N-连接糖蛋白家族:细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）、牙本质基质蛋白1（DMP1）和牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因表达的RT-qPCR检测;同时利用流式细胞仪对成骨细胞内钙离子浓度进行了测定;茜素红染色检测矿化结节及电镜下观察成骨细胞的超微结构;Western-blot测定各组p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK（P-p38）的蛋白表达。第四部分:P38 MAPK重组腺病毒载体及p38 MAPK-shRNA慢病毒载体的构建P38MAPK重组腺病毒载体（AD-p38）的构建:根据基因库序列,设计p38MAPK引物,加入酶切位点,以大鼠心脏cDNA为模板进行PCR扩增,经过测序鉴定后,将目的基因片段连入pShuttle-CMV的相应酶切位点,构建重组腺病毒穿梭质粒,酶切线性化处理后将其与AdEasyTM DNA共转化BJ5183感受态菌,抽提重组AdEasyTM质粒制备Ad-p38MAPK DNA转染细胞。P38MAPK-shRNA慢病毒载体的构建:根据p38MAPK基因序列,由公司合成提供3条干扰靶点序列shRNA1、shRNA2、shRNA3及非特异性靶序列,经酶切线性化处理后,通过连结慢病毒穿梭质粒及辅助包装共转染细胞,进行病毒滴度测定,通过效应蛋白表达检测选择干扰程度最大的用于后续试验。第五部分:P38信号通路在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的作用的进一步研究为了进一步探讨p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的信号通路作用,我们通过构建的p38 MAPK重组腺病毒载体转染成骨细胞过表达p38及p38-shRNA慢病毒载体转染成骨细胞来抑制表达p38,并进行实验分组:对照组,仅添加骨粘连蛋白OPTIMA;AD-p38 MAPK组:成骨细胞被AD-p38 MAPK转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;p38阻断剂组,预先在成骨细胞内加入20.0μmol/l的SB203580（p38 MAPK特异性阻断剂）培养2h再添加骨粘连蛋白OpTIMA;p38 MAPK-shRNA组:成骨细胞被p38 MAPK-shRNA转染再添加骨粘连蛋白OPTIMA;使用RT-qPCR和Western-blot法测定各组OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE及p38MAPK基因和蛋白的表达。结果:第一部分:分离培养的成骨细胞通过碱性磷酸酶染色细胞阳性率接近100%,矿化诱导2周后茜素红染色及四环素培养标记的矿化结节观察,结果满意。第二部分:不同浓度的骨粘连蛋白对成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及p38的基因表达均有不同程度的影响;根据实验结果确定1μg/ml骨粘连蛋白为本组实验最佳效应浓度（骨粘连蛋白OpTIMA）,第5天为实验观察取材时间;1μg/ml的骨粘连蛋白组在第5天能显着提高成骨细胞OCN、OPN、BSP及p38的基因表达,与空白对照组比较差异均有统计学差异（OCN,p<0.01;OPN,p<0.05;BSP,p<0.05;p38,p<0.001）;同时我们得出初步结论,骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用,并对p38 MAPK通路有激活作用。第三部分:实验进一步证实了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化中的正向调控作用,p38 MAPK是其重要的信号传导通路。P38 MAPK蛋白测定结果显示骨粘连蛋白OPTIMA组p38及P-p38的蛋白表达均明显增加,与空白对照组比较差异均有统计学意义（p<0.001）;骨粘连蛋白OPTIMA组Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达与空白对照组比较均有明显提高,差异均有统计学意义（DMP1,p<0.01;DSPP,p<0.01;MEPE,p<0.001）;流式细胞仪进行细胞内钙离子浓度测定显示骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较明显提高,差异有统计学意义（p<0.01）;根据茜素红染色及photoshop成像分析,骨粘连蛋白OPTIMA组与空白对照组比较矿化结节面积明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）;电镜下超微结构观察与空白对照组比较,骨粘连蛋白OPTIMA组细胞成骨活性增加,成骨细胞内含有更多的细胞器及富含矿化物的囊泡结构。添加p38阻断剂（SB203580）后与骨粘连蛋白OPTIMA组比较,P-p38的蛋白测定有显着下降（P<0.001）,非胶原蛋白（OCN、OPN、BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因表达也均有明显下降,差异均有统计学意义,电镜下观察成骨细胞活性较骨粘连蛋白OPTIMA组明显受到抑制。第四部分:P38MAPK重组腺病毒载体构建中的基因片段电泳验证及序列测定结果均与基因库一致;p38MAPK-shRNA慢病毒载体通过干扰预实验选择p38MAPK-shRNA3转染成骨细胞（干预性能与对照组比较:shRNA1、shRNA2,P<0.01;shRNA3,P<0.001）,病毒滴度的测定阳性转染组为1.7×108IU/ml（对照组:2 × 108IU/ml）,符合实验标准。第五部分:实验进一步证实了 p38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中的重要作用;结果显示AD-p38组明显上调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因和蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均显着升高,两组差异均有统计学意义;而p38-shRNA组及p38阻断剂组明显下调了骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用,与对照组（骨粘连蛋白OPTIMA）比较,两组的OCN、OPN、BSP、DMP1、DSPP、MEPE的基因、蛋白表达以及P-p38的蛋白表达均明显下降,差异均有统计学意义。结论:骨粘连蛋白通过p38 MAPK通路调控成骨细胞矿化:①骨粘连蛋白对成骨细胞矿化存在正向调控作用:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞非胶原蛋白（OCN,OPN,BSP）及Sibling家族蛋白（DMP1、DSPP、MEPE）的基因和蛋白表达,显着提高细胞内钙离子浓度,促进成骨细胞矿化结节的形成和成骨活性。②骨粘连蛋白可以激活p38 MAPK信号通路:1μg/ml的骨粘连蛋白能显着提高成骨细胞p38 MAPK的基因和蛋白表达。③P38MAPK是骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化的重要信号通路:p38阻断剂的使用及p38-shRNA病毒载体转染的成骨细胞（p38抑制表达）明显下调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用;AD-p38转染的成骨细胞（p38过表达）上调骨粘连蛋白对成骨细胞矿化的正向调控作用。
何武兵[3]（2020）在《重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用》文中认为背景:组织工程人工骨中骨髓间充质干细胞（BMSCs）、骨生长因子和合适的载体发挥重要作用。研究编码人骨形态发生蛋白2（hBMP2）和转化生长因子β 3（TGF-β3）的慢病毒（LV）对BMSCs的体内外成骨分化,促进骨形成,协同提高脊柱融合效果。方法:构建编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒并转染大鼠BMSCs。转染后BMSCs成骨分子的表达使用qRT-PCR和蛋白质印迹进行检测。构建大鼠腰椎后外侧横突间融合模型。术后通过放射学、手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估融合效果。结果:hBMP2和/或hTGF-β3基因通过聚合酶链反应扩增,DNA测序,以及BLAST分析来确认。编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒感染的BMSCs可有效地过表达hBMP2和hTGF-β3,以及上调培养上清液中hBMP2和hTGF-β3的水平。共转染hBMP2和hTGF-β3比单独转染hBMP2或hTGF-β3更有效地诱导BMSCs成骨分化。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3共转染组（分别编码hBMP2和hTGF-β 3的LV转染的BMSCs混合使用）和LV-hBMP2-hTGF-β3组（编码hBMP2和hTGF-β3融合基因的LV转染的BMSCs）中骨桥蛋白（OPN）,骨钙蛋白（OCN）和骨保护素（OPG）的表达水平显着高于LV-BMP2（LV携带hBMP2转染的BMSCs）组和 LV-hTGF-β3（LV 携带 hTGF-β3 转染的 BMSCs）组（P<0.05）。hBMP2和/或hTGF-β3过表达上调碱性磷酸酶（ALP）活性。大鼠腰椎后外侧植入术后2周、4周、6周、8周通过放射学评估骨生长情况。大鼠腰椎后外侧植入术后8周,通过手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3组1只（共5只）,和LV-hBMP2-hTGF-β3组4只（共8只）大鼠脊柱全部融合;LV-空载体组6只（共7只）,LV-hBMP2组1只（共8只）和LV-hTGF-β3组1只（共10只）大鼠脊柱全部植入处均未见明显骨痂生长;其余各组大鼠脊柱植入处可见部分骨痂,但是无法融合。结论:本研究表明慢病毒载体能够成功转导hBMP2和/或hTGF-β3基因,靶向基因可在BMSCs中成功过表达。我们的体外实验表明,联合使用hBMP2和hTGF-β3基因可以协同诱导骨分化。本实验条件下,慢病毒携带hBMP2和hTGF-β3基因感染的BMSCs,分别单独产生BMP2和hTGF-β3,在免疫活性大鼠模型中能诱导成骨,但是无法获得脊柱融合。hBMP2和hTGF-β3融合基因转染比hBMP2和hTGF-β3混合转染的BMSCs更能诱导成骨,脊柱融合率更高。免疫活性大鼠模型中,hBMP2和hTGF-β3基因可以联合使用、融合基因效果更佳,均能协同诱导成骨、促进脊柱融合,预计这两种细胞因子的组合将在未来作为一种治疗策略。
史怡凡[4]（2020）在《氟化钠对重组人骨形成蛋白-2应用于大鼠异位成骨协同作用的可行性研究》文中提出在口腔颌面外科中,先天性畸形、外伤、感染、肿瘤可以导致骨缺损,需要通过骨移植进行修复。尽管现在已经存在很多种的骨移植技术,但由于附加手术侵袭,自体骨源的限制,异体骨免疫排斥和感染等因素的影响,研发骨诱导材料代替骨移植显得越来越重要。在1965年Urist证明移植脱钙骨可以诱导骨骼肌形成软骨和骨。骨形成蛋白作为一种活性的骨诱导因子已经被证实存在于脱钙骨基质中,促进骨质形成。通过分子生物学技术的发展和应用,现阶段已经研发出十余种重组人骨形成蛋白,其中重组人骨形成蛋白-2和重组人骨形成蛋白-7应用最为广泛,已经在部分骨移植、骨再生领域应用于临床。由于重组人骨形成蛋白-2半衰期较短,为使其能在作用部位长期维持有效浓度,需要将其整合到合适的载体上,减少重组人骨形成蛋白-2的剂量及副作用。天然高分子（胶原、壳聚糖等）、人工合成高分子聚合物（聚乳酸、聚乙烯二醇等）、无机材料（羟基磷灰石、钛合金等）均可作为重组人骨形成蛋白的载体。氟化物对骨质形成过程作用复杂,且存在剂量和时间依赖性。较低浓度的氟化物可以促进骨质形成、骨质矿化,高浓度的氟化物对成骨过程存在抑制作用。本文综述了重组人骨形成蛋白-2的研究概况和目前应用现状,以及氟化物对骨形成过程的作用。拟通过动物试验探究氟化物与重组人骨形成蛋白-2在异位成骨中是否存在协同作用,氟化物能否作为促进重组人骨形成蛋白-2成骨的促进物。实验目的:探讨氟素对重组人骨形成蛋白-2在肌肉中成骨的影响。方法:rhBMP-2与I-型胶原混合体植入8周大的大鼠腹直肌内,大鼠分三组,分别给予蒸馏水、含1mg/L氟化钠,100mg/L氟化钠喂养。形成的新骨摘除后行病理学检查,测定碱性磷酸酶（ALP）活性及钙含量。结果:1.低浓度氟染组（1mg/L）和高浓度氟染组（100mg/L）碱性磷酸酶活性略高于对照组,但没有显着区别（P>0.05）。2.氟染3周后低浓度氟染组与高浓度氟染组碱性磷酸酶活性达同一水平。3.对照组与氟染组的钙含量随时间延长逐渐增加,第3周时低浓度氟染组与高浓度氟染组钙含量无明显差异,但显着高于对照组（P<0.05）。4.氟化物不能改变rhBMP-2异位成骨机制。结论:通过实验我们发现氟作为参与骨质形成的重要元素,在rhBMP-2诱导的异位成骨过程中对于骨化没有明显的影响。虽然本实验在rhBMP-2植入3周后可以发现氟染组新生骨中钙含量存在增高的趋势,但氟能否作为合适的添加物促进rhBMP-2诱导成骨还需要长期观察。
窦晓晨[5]（2019）在《DNCPs促进BMSCs体外成骨及在犬上颌窦底提升同期种植术的成骨效果研究》文中研究说明上颌窦底提升同期种植并行骨增量处理是上颌后区骨量不足的种植患者快速、有效的解决方案。目前常用的骨替代材料往往只有骨传导性,骨诱导性较弱,且吸收降解速率不一,短期内无法促进上颌窦内成骨及种植体周骨矿化。利用组织工程技术在骨替代材料中加入具有骨诱导能力的种子细胞和生长因子,可以改善骨替代材料的成骨能力和降解性能。牙本质非胶原蛋白（Dentin non-collagenous proteins,DNCPs）是由牙本质分泌的一组复合蛋白,包括牙本质特异性蛋白、矿化组织蛋白和各种生长因子,参与成骨微环境的组成,在骨形成和矿化过程中起到调节作用。本实验从犬牙齿中提取DNCPs,复合骨替代材料β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）,联合骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）构建新型组织工程骨,探索其体外成骨能力及在犬上颌窦底提升同期种植术的成骨效果。实验具体内容分为以下四个部分:实验一 β-TCP对BMSCs体外成骨的影响目的:目前,临床上常用的骨替代材料脱蛋白牛骨基质（Deproteinised bovine bone matrix,DBBM）在上颌窦内降解速率慢,新骨形成慢,短期内种植体周围不能形成足够的骨结合;人工合成骨替代材料β-TCP的三维多孔结构与松质骨相似,是较为理想的成骨空间结构。本部分实验在体外比较DBBM和β-TCP对BMSCs的成骨作用,为后续实验筛选合适的支架材料,并探索其促进BMSCs成骨分化的调节因子。方法:取大鼠骨髓体外分离、培养,分别接种至DBBM和β-TCP两种材料表面培养。扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）观察细胞在支架材料上的接种效果;结晶紫染色检测细胞黏附率;细胞增殖与毒性检测试剂（Cell counting kit-8,CCK8）检测细胞增殖能力;碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色及活性检测BMSCs的成骨分化能力;实时荧光逆转录-聚合酶链反应（Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR）检测骨形成相关因子ALP、核心结合因子α1（Core-binding factor alpha1,Cbfa1）、骨钙素（Osteocalin,OCN）的mRNA表达;免疫印迹实验（Western blot,WB）检测ALP,Cbfa1,OCN的蛋白表达。使用短片段干扰核糖核酸（Small interfer RNA,siRNA）转染 BMSCs,沉默骨形成蛋白 1（Bone Morphogenetic Protein,BMP 1）基因,将沉默组和对照组细胞分别接种至β-TCP材料表面,检测骨形成相关因子ALP,Cbfa1,OCN基因和蛋白的相对表达水平。结果.:接种细胞24 h后,β-TCP组的细胞黏附率高于DBBM组（p<0.05）;SEM观察显示两种材料均呈三维多孔结构,β-TCP材料孔径大于DBBM,BMSCs均可黏附于两种材料表面,细胞形态和附着方式未见明显差异;CCK8分析结果显示BMSCs在接种第1 d时,两组间无显着差异（p>0.05）,至第3 d起β-TCP组细胞增殖效率高于DBBM组,差异具有统计学意义（p<0.05）;ALP染色及活性结果显示,接种至两组材料的BMSCs中ALP的表达和活性均随时间显着增强,β-TCP组在各时间点ALP的表达和活性均高于DBBM组（p<0.05）;Real-time RT-PCR 和 Western blot 结果显示 β-TCP 组较 DBBM 组更能上调骨形成相关因子ALP,Cbfa1,OCN的表达（p<0.01）;将沉默BMP1基因的细胞株接种至β-TCP材料表面,骨形成相关因子ALP,Cbfa1,OCN的表达下调（p<0.01）。结论:与DBBM相比,β-TCP是BMSCs适宜的支架材料;BMP1是β-TCP促进BMSCs成骨分化的调节因子。实验二DNCPs对BMSCs体外成骨的影响目的:DNCPs是由牙本质分泌的一组非胶原蛋白,对骨和牙本质的形成起关键作用。目前DNCPs作为复合型生长因子用于组织工程骨报道较少,且DNCPs的成骨促进机制尚不明确。本部分实验探讨DNCPs对BMSCs成骨分化的作用,为后续实验提供生长因子。方法:从犬牙本质中提取DNCPs,通过Western blot检测分析DNCPs的成分。犬髂骨抽取骨髓,密度梯度离心法分离培养BMSCs。以10 pg/mL浓度的DNCPs诱导BMSCs,CCK8法检测细胞增殖能力;ALP染色及活性检测BMSCs的成骨分化能力;茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量检测分析BMSCs矿化能力;Real-time RT-PCR和Western blot检测核心结合因子2（Runt related transcription factor 2,RUNX2）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、I 型胶原（Collagen I,COL-1）的mRNA表达;Elisa试剂盒检测培养液中转化生长因子 1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）的分泌水平;检测 TGF-β1 下游的磷酸化细胞信号转导分子pSmad3的表达水平,并采用抑制剂阻断Smad3磷酸化检测成骨相关因子表达水平,探索DNCPs促进成骨分化的信号通路。结果:Western blot结果显示DNCPs提取物可以表达矿化组织蛋白OPN和骨涎蛋白（Bone sialoprotein,BSP）、牙本质特异性蛋白牙本质基质蛋白1（Dentin matrix protein 1,DMP1）、生长因子 BMP 1。CCK8 结果显示加入 10 μg/mL 浓度的DNCPs实验组和对照组在相同时间点的差异没有统计学意义（p<0.05）;诱导7 d和14 d的ALP染色及活性结果显示,DNCPs可以上调BMSCs中ALP的表达和活性,与对照组相比,组间差异和时间点差异均有统计学意义（p<0.01）;诱导14 d和21 d的茜素红结果显示,DNCPs组在钙结节的数量和尺寸上均优于对照组,钙离子浓度也高于对照组,差异具有统计学意义（p<0.01）。Real-time RT-PCR 和 Western blot 结果显示,DNCPs 可以上调骨形成相关因子RUNX2,OPN,COL-1的表达（p<0.01）。机制分析结果显示,加入DNCPs的实验组中TGF-β1的浓度高于对照组,差异具有统计学意义（p<0.01）;Western blot结果显示DNCPs可以上调TGF-β1下游分子pSmad3的表达水平,与对照组相比差异具有统计学意义（p<0.01）;采用抑制剂SIS3阻断Smad3磷酸化后,DNCPs-SIS3组中骨形成相关因子的表达水平DNCPs组明显下调,差异具有统计学意义（p<0.01）,与对照组相比差异没有统计学意义（p>0.05）。结论:DNCPs可以促进BMSCs的体外成骨分化;TGF-β1/Smad3信号通路是DNCPs促进成骨分化的信号通路。实验三DNCPs-β-TCP复合材料对BMSCs体外成骨的影响目的:将不同质量比的DNCPs与β-TCP复合,筛选蛋白与材料的最佳质量比。检测BMSCs接种在复合材料上的细胞相容性和成骨能力,为后续的犬上颌窦底提升同期种植动物实验提供复合材料。方法:采用混合冷冻干燥法制备DNCPs含量分别为2.5%,5%,10%的DNCPs-β-TCP复合材料。将复合材料置于模拟体液中,检测1～28d DNCPs的释放率,筛选最佳质量比的复合材料。将BMSCs接种至复合材料上,检测其黏附、增殖、分化能力;SABC-Cy3荧光染色观察细胞骨架形态;Real-time RT-PCR和Western blot检测成骨相关因子RUNX2,OPN,COL-1的表达水平。结果:体外模拟释放结果显示DNCPs-β-TCP复合材料前3d突释,至第10 d释放速率较高,然后逐渐减慢,至第28 d三种含量的复合材料内均有未释放的DNCPs;含量为5%的DNCPs-β-TCP复合材料体外释放效果最佳,至第28 d复合材料中仍有较高浓度的DNCPs。材料接种至复合材料表面培养结果显示,DNCPs-β-TCP复合材料与单纯β-TCP对照组在细胞的黏附、增殖、生长上无显着差异（p>0.05）;DNCPs-β-TCP复合材料可以上调BMSCs的ALP活性,促进BMSCs分化,与对照组相比差异具有统计学意义（p<0.05）;荧光染色可见BMSCs在实验组和对照组均生长良好,无显着差异;Real-time RT-PCR和Western blot结果显示,与单纯β-TCP相比,DNCPs-β-TCP复合材料可以上调骨形成相关因子RUNX2,OPN,COL-1的表达（p<0.01）。结论:β-TCP可以作为DNCPs的支架载体,5%含量的DNCPs-β-TCP复合材料体外释放效果最佳;DNCPs-β-TCP与BMSCs之间具有良好的细胞相容性,可以促进BMSCs的体外成骨分化。实验四DNCPs-β-TCP复合材料结合BMSCs在犬上颌窦底提升同期种植术中的成骨效果目的:评价DNCPs-β-TCP-BMSCs组织工程骨在犬上颂窦提升同期种植术中的成骨效果。方法:6只beagle犬均进行双侧上颌第一磨牙M1拔除,3 m后行上颌窦底提升同期种植术。设计双盲对照实验,每只beagle犬双侧上颌窦内分别植入实验组材料DNCPs-β-TCP-BMSCs组织工程骨及对照组材料β-TCP-BMSCs。分别于术中、术后6 w、术后3 m测量种植体颊侧、腭侧、近中、远中、垂直向五个位点的种植体稳定性指数（Implant stability quotient,ISQ）;CT检查种植体骨结合情况及种植体骨界面的骨密度;组织学检测上颌窦腔内的成骨效果及种植体周的骨矿化效果;骨组织形态计量学检测种植体骨结合率。结果:ISQ值显示术后6 w,DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组呈缓慢上升趋势,β-TCP-BMSCs对照组呈下降趋势;术后3 m,实验组明显上升,ISQ值高达78.3±4.3,对照组缓慢上升,ISQ为58.7±7.9,差异具有统计学意义（p<0.01）。CT观察种植体骨结合良好,种植体周无明显放射线透射影,上颌窦内无异常影像;DNCPs-β-TCP-BMSCs 实验组种植体骨界面的 CT值显着高于β-TCP-BMSCs对照组,差异具有统计学意义（p<0.01）。取种植体周上颌窦内植骨材料中心位置骨组织进行脱钙切片 HE染色,结果可见DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组中骨基质排列致密、有序,骨组织成熟,骨髓腔中骨小梁粗大、成形;β-TCP-BMSCs对照组中骨基质排列无序,骨组织不成熟,骨髓腔内骨小梁稀少。带种植体的硬组织切片进行Masson染色,结果可见DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组中种植体螺纹周围多为红染的成熟骨组织,且骨小梁结构清晰,排列有序,可见多处骨髓腔;β-TCP-BMSCs对照组中种植体螺纹周围可见明显的蓝色编织骨条带,骨小梁排列不规则,罕见骨髓腔。骨组织形态计量学检测结果显示DNCPs-β-TCP-BMSCs实验组种植体骨结合率显着高于β-TCP-BMSCs对照组,差异具有统计学意义（p<0.01）。结论:DNCPs-β-TCP-BMSCs组织工程骨可以促进犬上颌窦内早期成骨,促进种植体周围早期骨矿化。
任聪[6]（2019）在《马鹿茸多肽“补肾健骨”作用与机制研究》文中研究指明目的:对马鹿茸多肽进行分离纯化,获得不同分子量的马鹿茸多肽（A～E）。研究马鹿茸多肽（A～E）对MC3T3-E1成骨细胞的增殖及成骨分化作用、对骨髓间充质干细胞的增殖及骨向分化的作用;马鹿茸多肽A对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用,探究马鹿茸防治骨质疏松症的作用机制。通过HPLC-MS联用技术分析马鹿茸多肽A的组分组成,采用原子力显微镜对马鹿茸多肽A的表面结构进行分析和表征,采用网络药理学和生物信息学分析方法,探究马鹿茸多肽A防治骨质疏松症的靶基因和靶蛋白,及相关的作用机制的信号通路,为防治骨质疏松症提供理论依据和科学指导。材料与方法:1材料鹿茸药材购于辽宁西丰药材市场,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室的李峰教授鉴定为鹿科动物马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角;马鹿茸多肽,由实验室自制。2方法2.1马鹿茸多肽（A～E）的分离纯化及分子量的分布测定采用多级膜分离技术分离并纯化得到5种不同分子量的马鹿茸多肽（A～E）;采用高效凝胶过滤色谱法和SDS-PAGE电泳法测定马鹿茸多肽（A～E）的分子量。2.2马鹿茸多肽（A～E）对MC3T3-E1成骨细胞的增殖及分化作用采用MTT法研究马鹿茸多肽对MC3T3-E1成骨细胞的增殖作用;以ALP为指标,采用ELISA法研究马鹿茸多肽（A～E）对MC3T3-E1成骨细胞的分化作用。2.3马鹿茸多肽（A～E）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖及骨向分化作用采用MTT法研究马鹿茸多肽（A～E）对骨髓间充质干细胞的增殖作用;以ALP、BGP、BMP-2为指标,采用ELISA法研究马鹿茸多肽（A～E）对骨髓间充质干细胞的骨向分化作用。分别采用RT-PCR法和Western-blot法检测BMSCs中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因和蛋白的表达。2.4马鹿茸多肽A对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用采用切除雌性大鼠双侧卵巢的方法,建立肾虚型骨质疏松症模型,分别以补佳乐（Progynova）,仙灵骨葆（XLGB）作为阳性对照药,连续给予12周的马鹿茸多肽A。采用骨密度仪测定大鼠的骨密度;采用称量法测定大鼠的子宫指数;采用酶联免疫法（ELISA）检测大鼠血清中的雌二醇（E2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）、骨形成蛋白-2（BMP-2）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）的活性,及骨组织中的BALP、BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2、TGF-β1,以及下丘脑和肾脏组织的TIEG1、TGF?1。分别采用RT-PCR法和Western-blot法检测骨组织BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因和蛋白的相对表达。采用HE染色,观察大鼠股骨、椎骨的形态变化;采用免疫组化法观察大鼠骨组织的形态变化和阳性表达。2.5马鹿茸多肽A的组成与特征采用柱前衍生化的方法,利用氨基酸自动分析仪,测定马鹿茸多肽A水解后的氨基酸的种类和含量。采用HPLC-MS测定马鹿茸多肽A的组分分析。利用原子力显微镜,以粗糙度、表面高度分析、功率谱密度等为参数,测定马鹿茸多肽A的表面形貌。采用GO分析、KEGG分析和String蛋白互作网络等生物信息学方法,分析马鹿茸多肽A的72个多肽片段中,推测与骨质疏松症相关的靶基因和靶蛋白,以及作用机制相关的信号转导通路。结果:1分离纯化得到五种分子量的多肽,即多肽A（200～3000 Da）,多肽B（3000～5000 Da）,多肽C（5000～10000 Da）,多肽D（10000～50000 Da）,多肽E（>50000 Da）。2马鹿茸多肽（A～E）均能促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖及成骨分化,其中分子量为200-3000 Da的多肽A,在浓度为200μg·m L-1,作用48 h后,促成骨细胞增殖及成骨分化的作用最显着。3马鹿茸多肽（A～E）对BMSCs细胞的增殖及分化作用3.1马鹿茸多肽（A～E）均能促进BMSCs的增殖及骨向分化,其中以分子量为200-3000 Da的多肽A,在浓度为200μg·m L–1时,促BMSCs的增殖及骨向分化的作用最显着。3.2马鹿茸多肽（A～E）增强Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2基因、蛋白的表达;多肽A上调Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2基因、蛋白的表达最接近诱导液组,可能跟激活Bmp-2/Smad1、Smad5/Runx2信号转导通路有关。4马鹿茸多肽A对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用4.1血清中骨代谢相关指标检测结果马鹿茸多肽A升高E2、ALP、BGP、BMP-2的水平,并降低TRAP和PPARγ2水平。4.2子宫指数与正常组比较,模型组大鼠的子宫明显萎缩,各组的子宫指数明显小于正常组;与模型组比较,多肽A高、低剂量组、西阳对照组、中阳对照组,与模型组的子宫指数差异无统计学意义。4.3骨密度的检测结果各给药组均能增加大鼠骨密度,马鹿茸多肽A高剂量组的效果最显着。4.4骨组织中相关指标的检测结果与正常组比较,模型组大鼠骨组织中BALP、BGP、BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2、TGFβ1、TIEG1含量显着降低;与模型组相比,马鹿茸多肽A高、低剂量组、西阳对照组、中阳对照组均能显着提高骨组织中BALP、BGP、BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2、TGFβ1、TIEG1的水平,其中多肽A高剂量组的效果最显着。4.5下丘脑中的TGF-β1和TIEG1蛋白的表达各给药组均增强下丘脑中TGF-β1、TIEG1的表达水平,多肽A高剂量组的效果最显着。4.6肾中的TGF-β和TIEG1蛋白的表达各给药组均增强肾中TGF-β1、TIEG1的表达水平,多肽A高剂量组效果最显着。4.7骨组织中相关基因的表达各给药组大鼠骨组织中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因相对表达量显着升高;多肽A高剂量组对BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2基因相对表达量优于其他组。4.8骨组织中相关蛋白的表达与正常组比较,模型组大鼠骨组织中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2蛋白灰度值量显着降低;各给药组均能增加BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2的蛋白表达量,且多肽A高剂量组的效果最显着。4.9骨组织形态学检测的结果4.9.1 HE染色检测结果与模型组比较,马鹿茸多肽A高、低剂量组可见骨小梁增厚,结构紧密,骨髓腔变小,骨外膜可见骨原细胞。4.9.2骨组织的免疫组化的结果与正常组比,模型组中的Bmp-2、Smad1、Smad 5、Runx2的平均光密度显着下降;与模型组比,各组的Bmp-2、Smad1、Smad 5、Runx2的平均光密度显着高于模型组,马鹿茸多肽A高、低剂量组的Smad1和Runx2的平均光密度显着高于西阳对照组;多肽A高、低剂量组的Bmp-2、Smad1、Smad 5、Runx2的平均光密度接近甚至高于阳性组。5马鹿茸多肽A的组分分析5.1马鹿茸多肽A中氨基酸的种类与含量在水解后氨基酸中含有18种氨基酸,约占26.4%;组氨酸的含量最高,天冬氨酸含量最少,且8种必需氨基酸含量是2071.24mg.g-1占53.04%。游离氨基酸含有18种氨基酸,约占23.6%;苏氨酸的含量最高,脯氨酸含量最少;8种必需氨基酸553.81mg.g-1,占60.18%。结合氨基酸中必须氨基酸含量1517.43mg.g-1,达50.84%。5.2 HPLC-MS法测定马鹿茸多肽A的组分组成分析得到多肽片段共72个,分子量在700～2000 Da,等电点在4.33-11.45之间。5.3马鹿茸多肽A的表面形貌特征5.3.1表面形貌概况马鹿茸多肽A表面呈现有尖锐的椎体状,且不规律分布在表面。且当浓度从0.1μg.m L-1增加到5μg.m L-1,粗糙度Ra/Rq减小,但变化不明显。5.3.2表面高度分布浓度为0.1 ug.m L-1的马鹿茸多肽的表面高度是6.13969 nm;浓度为0.25μg.m L-1的马鹿茸多肽的表面高度是39.4588 nm;浓度为0.5μg.m L-1的马鹿茸多肽样品的表面高度是14.5105 nm;浓度为1 ug.m L-1的马鹿茸多肽样品的表面高度是16.6944 nm;浓度为5μg.m L-1的马鹿茸多肽样品的表面高度是28.6132nm。5.3.3功率谱密度（PSD）当波长为0.208祄,频率为4.80/祄,马鹿茸多肽A的PSD值为水平轴PSD为40.1 nm3,垂直轴PSD为44.7 nm3,二维的PSD分别为75055 nm4;当波长为0.0971祄,频率为10.3/祄,马鹿茸多肽的PSD值为水平轴的PSD为3.29 nm3,垂直轴的PSD为6.3 nm3,二维的PSD分别为2931 nm4。5.4马鹿茸多肽A的网络药理学研究网络药理学研究发现多肽A中的主要的靶蛋白是胶原蛋白α-1（I）链（COL1A1）、有丝分裂蛋白活化蛋白激酶激酶14（MAPK14）、纤维蛋白2（FBN2）等,推测分析可知PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路,FOX信号通路等,可能与马鹿茸的“补肾健骨”的防治骨质疏松症的作用有关,其共同作用,防治骨质疏松症的发生。这些信号通路的发现与推测是对鹿茸多肽防治肾虚型骨质疏松症的作用机制的补充,推测鹿茸多肽“补肾健骨”的作用,可能是这几种信号通路协同作用的结果。结论:1马鹿茸多肽分离并纯化为为五种不同分子量的多肽（A～E）;采用高效凝胶过滤色谱法和SDS-PAGE电泳法测定马鹿茸多肽的分子量的结果基本一致。2马鹿茸多肽（A～E）促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖和分化;且分子量为200-3000 Da的多肽A的促增殖及分化的效果明显优于其他分子量的多肽。3马鹿茸多肽（A～E）促进骨髓间充质干细胞BMSCs的增殖和骨向分化;且分子量为200-3000 Da的多肽A的效果明显优于其他分子量的多肽;其作用机制可能是与其上调Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2信号转导通路有关。4马鹿茸多肽A能防治大鼠肾虚型骨质疏松症。作用机制可能是其激活Bmp-2、Smad1、Smad5、Runx2信号转导通路。5采用HPLC-MS技术分析马鹿茸多肽A有72个多肽片段,结合网络药理学的方法和生物信息学方法,发现了骨质疏松症相关的直接和间接的靶蛋白和靶基因,及其他信号通路,靶基因靶蛋白及多条信号通路协调作用,能预防治疗骨质疏松症的发生。6采用原子力显微镜（AFM）从微观角度分析马鹿茸多肽A的表面结构,表面有凹凸不平的的椎体状,不规律地分布在分子表面,推测可能是多肽的不规则的锥形结构促使多肽A更容易进入细胞,发挥药效作用;且多肽A溶液的的浓度越低,越能清晰地观察的表面形貌。AFM对多肽A结构的深入分析,为研究马鹿茸多肽的构效关系奠定基础。
李丛华[7]（2013）在《重组腺病毒BMP-9对牙囊干细胞成骨向诱导分化的研究》文中进行了进一步梳理牙周炎作为人类最普遍、最古老的疾病之一，是一种慢性感染性疾病；牙菌斑中的微生物引起牙齿支持组织形成炎症、产生深牙周袋、附着丧失与牙槽骨的垂直性或水平性吸收，最终导致牙齿松动和脱落；也是成年人牙齿缺失的主要原因[4]。牙周骨缺损修复和正常生理结构与生理功能的重建是牙周炎治疗的最终目的,目前对骨上袋缺损的再生性修复尚缺乏行之有效的治疗手段，不可能实现真正意义上的牙周生物学修复。牙源性干细胞与牙周组织工程技术为新的生物性修复再生牙周组织及其牙齿提供了可能，即用细胞工程和生物工程化的方法实现牙周组织再生，形成新附着。应用牙源性干细胞和组织工程技术，按照牙周组织生长与发育的基本原理和基本方法来模拟再现牙周组织整个发育过程才能真正地实现牙周组织再生。再生组织工程中，种子细胞的选择具有决定性意义；细胞获取方便，移植入机体后细胞生物学活性稳定，分化增殖能力强等是理想种子细胞必备条件。发育形成牙周组织的牙囊是一种疏松结缔组织，起源于外胚间充间充质，包绕着牙胚期的成釉器和牙乳头。一般认为牙周分泌牙骨质的成牙骨质细胞由靠近正在形成中牙根的牙囊最内层细胞发育而成，而牙周组织中分泌骨基质、形成部分牙槽骨的成骨细胞是邻近牙槽骨的外层牙囊细胞发育而成；成纤维细胞由中间层牙囊细胞发育，产生牙周膜纤维。作为牙周组织前体细胞的牙囊细胞具有自我更新能力和多向分化能力的干细胞特性与异质性，如果能将牙囊干细胞（dental follicle stem cells，DFCs）分离出来，这对研究牙周组织的生长发育形成起着至关重要的作用；对牙齿移植、牙再植及牙再生均具有重要的指导意义；DFCs较强的增殖分化能力也使其成为一种值得考虑的组织工程候选种子细胞。骨形成蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs）是一类糖蛋白，在骨的发育和塑建中起着关键性作用，可通过多种途径多种方式促进细胞向成骨部位定向趋化、募集和促进成骨细胞定向分化，促进血管的生成和组织血管化形成，调节多种局部生长因子的活性，影响生长因子的形成，促进骨组织的形成。在已知对骨再生有促进作用的生长因子中，BMPs是最强的生长因子，目前已经分离出20余种，其中已报道具有成骨潜能是BMPs2、4、6、7、9；BMP9具有诱导和维持胚胎神经元的类胆碱分化功能，能够调节脂肪酸代谢和葡萄糖代谢，能够调节体内铁离子的动态平衡等多种重要生物学功能，但长期以来人们缺乏研究和了解BMP9在骨形成和骨再生中的作用。TC HE系统研究了在骨形成过程中的BMP2至BMP15共14种BMPs所起的生物学作用，结果表明这14种BMPs中，BMP9具有很强的促进软骨形成与成骨活性，作用强于BMP2和BMP7，也是BMPs家族中促进成骨分化的生长因子之一，极具研究潜力和应用前景[64,65]；但在口腔成骨方面和对DFCs的影响未见相关报道。DFCs具有成脂肪、成骨、成神经等多向分化潜能的干细胞特征，在适当的诱导条件下，可以多向分化。然而，由于细胞因子网络性调控和信号通路的复杂性以及研究手段的限制，DFCs的具体分化调控机制尚不明确。本研究旨在着力探讨重组腺病毒BMP-9基因转染大鼠DFCs的可行性及其转染后的成骨向分化与作用机制，以获得可用于牙周骨组织再生工程的基因修饰的种子细胞，为后续牙周组织工程治疗口腔骨缺损奠定基础。研究内容和研究结果如下：1.在解剖显微镜下，从SD大鼠下颌骨牙胚上剥离牙囊，组织块法和酶消化获取牙囊细胞原代培养、有限稀释法克隆纯化、细胞表型鉴定，成骨、成脂肪多向诱导分化，结果表明：DFCs具有成骨、成脂肪等多向分化潜能的干细胞特征，在定向成骨诱导分化过程中，没有出现成脂肪向分化。2.腺病毒介导的BMP-9转染第三代DFCs，设立空白对照组，绿色荧光病毒组（GFP组）、BMP组，成骨诱导组、联合组。通过观察细胞形态和MTT生长曲线变化、荧光显微镜及RT-PCR检测转染后BMP-9基因mRNA的表达；碱性磷酸酶ALP活性、ALP染色及钙茜素红染色测定转染后DFCs的早晚期成骨活性。结果表明：转染的DFCs稳定表达BMP-9，说明转染后的BMP-9基因能成功被转录并表达于DFCs；与未转染对照组相比较，转染组ALP染色及茜素红钙结节染色为阳性；转染组显着高于未转染组，说明DFCs有良好的骨向分化能力，也提示了BMP-9对DFCs有成骨诱导作用。3.应用抑制剂p38蛋白激酶抑制剂SB203580和ERK1/2激酶抑制剂PD98059干扰BMP-9转染的DFCs，用来阻断p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和细胞外信号调节激酶（ERK1/2）胞内信号传递，通过ALP活性及染色检测；Western blot分析；钙茜素红染色实验分析MAPKs信号通路对BMP-9诱导的DFCs成骨向分化过程中的调控和影响。结果表明：抑制MAPKp38的表达后降低了Ad-BMP-9诱导的DFCs的ALP的活性和ALP染色，且减少了钙盐沉积与骨桥蛋白（osteopontin,OPN）和骨钙素（osteocalin,OCN）的表达；抑制ERK1/2的活性后则相反。同时，Western blot分析显示Smad和MAPK通路激活，表明BMP诱导DFCs成骨向分化涉及到两条或可能更多的信号通路激活。研究结论：1.成功获得了大鼠DFCs克隆，合适诱导条件下能够多向诱导分化。2.在腺病毒BMP-9转染DFCs实验中，通过RT-PCR可检测到转染后BMP-9基因mRNA的表达，碱性磷酸酶和钙茜素红染色测定转染后DFCs的早期和晚期成骨活性，说明BMP-9可以成功地转染大鼠DFCs，转染后DFCs高表达BMP-9，且具有明显的成骨作用。3.应用MAPKp38蛋白激酶抑制剂和ERK1/2激酶抑制剂干涉BMP-9转染的DFCs，通过ALP活性及染色检测、Western blot分析、钙盐沉积实验观察BMP-9转染的DFCs成骨向分化可通过ERK1/2和p38信号通路进行调控，为后续试验奠定了基础。
周诺[8]（2012）在《PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究》文中研究说明目的牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）技术是利用骨痂的愈合机理产生新骨,是一种内源性的骨组织工程学技术。自其开始应用于颅颌面领域以来,大量基础和临床研究逐渐开展,随着基础研究的深入以及该技术的改进和成熟,牵张成骨在颌面部整形、肿瘤的术后重建以及牙槽种植修复等方面展现出了广阔的应用前景,成为口腔颌面外科领域的研究热点。虽然DO有许多传统手术不可比拟的优势,已被广泛地应用于各种颅颌面的畸形以及四肢短小畸形的矫治,但其较长的牵张和固定时间,限制了其在临床上的广泛应用。因此如何提高DO的新骨形成的速度,缩短其固定时间,减少其并发症的发生和保证新骨形成质量,正成为目前该领域的研究热点。本课题利用hBMP-2作为促进因子,将基因工程和组织工程的技术结合起来,先把hBMP-2转染入兔BMSCs,构建稳定表达hBMP-2的BMSCs,再与组织工程支架材料Pluronic F-127复合,注射入牵张区内,使hBMP-2能在牵张区内稳定持续地起作用,拟让其能促进兔下颌骨的牵张成骨新骨生成。从组织学水平、蛋白水平、基因水平观察和检测牵张间隙内新骨的形成以及改建的情况,为牵张成骨技术在治疗各种颌面部畸形或骨缺损等疾患上的广泛应用奠定基础。方法1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化:取成年健康新西兰大白兔,穿刺双侧胫骨抽取骨髓,通过密度梯度离心法收集细胞后培养,原代培养8-10d后传代培养,按照1:3传代,每3-4天可传代1次,传到第3代时用地塞米松,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸配制而成的成骨诱导分化液进行成骨诱导14至21天,并分别用茜素红染色,ELISA以及免疫组化的方法检测其矿化结节的形成和ALP、BGP的表达。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs:取第3代BMSCs,用脂质体介导携带hBMP-2基因的pcDNA3.1质粒转染入BMSCs中,观察GFP表达的情况,MTT法检测转染后细胞的增殖和生长的能力,通过RT-PCR检测瞬时转染后hBMP-2 mRNA的表达。转染后再用G418筛选2周,筛选出稳定转染的阳性细胞,收集备用。将经过筛选后的BMSCs培养4周后,对其进行BMP-2的免疫组织化学以及Western Blot检测。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养:利用Pluronic F-127低温下为水溶液,室温可凝固的特点,冰浴中制备凝胶并消毒后与转染hBMP-2的BMSCs复合,调整细胞浓度,使细胞浓度达到2.5×107个/ml,MTT法检测Pluronic F-127的细胞毒性。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型的建立:取成年健康新西兰大白兔6只,依据其下颌骨的解剖结构设计牵张器。利用传统单线骨皮质切开的术式,在右侧下颌骨第二和三磨牙间行骨切开术,固定牵张器。术后潜伏期为5天,第6天开始牵张,每天牵张2次,每次0.5mm,共牵张7mm,随后固定。于牵张固定2周、6周后分别摄X线片以观察新生骨愈合以及改建情况。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究:取健康新西兰白兔48只随机分为4组,每组12只,于固定期第2天进行干预。实验分组:A组:牵张间隙内注射200 u 1 hBMP-2基因修饰的BMSCs/Pluronic F-127凝胶复合物;B组:注射200μ1 hBMP-2基因修饰的BMSCs液;C组:注射200μ1 BMSCs液;D组:注射200μ1生理盐水。分别于牵张结束固定2w、6w各组处死动物6只,通过大体病理、摄X线片、扫面电镜、HE染色组织切片、免疫组化等手段检测新骨形成和改建情况。结果1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化结果:BMSCs培养8-10d后即可长满瓶底,并可传代,传代后细胞生长状态良好,可一直维持BMSCs的典型形态以及生长状态,细胞呈现长梭形形状,旋涡式的排列并可成功向成骨方向诱导。其中钙结节茜素红染色见阳性结节染色。ALP含量逐渐升高,并在2周后达到最高,与未诱导组有显着差异（p<0.05）。BGP免疫组化也呈阳性染色。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的结果:利用脂质体介导携带hBMP-2的pcDNA3.1质粒成功转染BMSCs,转染效率约30%;转染24h能观察到弱荧光表达,48h后荧光强度增强;MTT法显示转染后的BMSCs生长增殖能力无明显变化;RT-PCR也检测到了hBMP-2 mRNA的表达。用G418成功筛选出稳定转染的细胞,该细胞培养4周可用免疫组织化学以及Western Blot方法检测到BMP-2蛋白地稳定表达。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的结果:Pluronic F-127在4℃时为水溶液,37℃下为凝胶状,其与转染hBMP-2基因的BMSCs复合后,MTT检测结果见复合物中的BMSCs生长增殖能力无明显变化（p>0.05）。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的结果:所有的实验动物都成功地完成了手术,术区与口内无穿通,无感染,并能顺利牵张。实验动物全部存活至预定时间,体重皆有不同程度地增加。从手术至取材,应用于体内的牵张器均固位良好,无断裂以及脱钉现象。X线片见新骨形成在时间段有明显变化,符合临床上牵张成骨的成骨规律。动物模型构建成功。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究结果:通过大体病理、X线、扫描电镜和HE染色组织切片观察,新骨形成质量由高到低排列为:A组>B组>C组=D组;通过免疫组化观察并经过灰度值统计软件分析,在固定期第2周和6周A组牵张区骨质量明显高于B组（p<0.05）,B组牵张区骨质量明显高于C组与D组（p<0.05）,在各期C、D两组间无明显差异（p>0.05）。结论1.密度梯度离心法简便、易行,可大量扩增、纯化兔骨髓间充质干细胞,所获细胞经过诱导后可向成骨细胞分化。2.通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因导入BMSCs,并使其获得基因及蛋白的表达。3.组织工程支架材料Pluronic F-127具有低温下为水溶液,室温可凝固的特点,细胞相容性良好。4.兔子不仅性情温顺,饲养方便,对手术耐受性好,易于操作,而且术后愈合效果好,是一个稳定可靠的实验模型动物,可适合较大样本的实验研究。5.hBMP-2基因修饰BMSCs复合可注射骨组织工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成,为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供了一定的理论依据以及技术参考。
贾春蓉,冯兴华,刘宏潇,李敏,吴志奎[9]（2011）在《补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达的影响》文中研究表明[目的]探讨补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎（AS）成纤维细胞成骨型表达的影响。[方法]以体外培养的AS髋关节囊组织的成纤维细胞为实验对象,观察在细胞因子BMP-2与TGF-β的诱导刺激下,AS成纤维细胞成骨型表达标志物ALP活性、胶原含量、骨钙素含量的变化。[结果]细胞因子作用后,AS成纤维细胞的ALP活性、胶原含量、骨钙素含量较正常对照组与AS对照组有明显提高（P<0.01）。药物作用后,补肾强脊颗粒含药血清对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞ALP、胶原含量、骨钙素含量活性有明显的抑制作用（P<0.01）;而兔空白血清组SASP含药血清组则作用不明显（P>0.05）。[结论]补肾强脊颗粒可以通过抑制细胞因子对成纤维细胞成骨型标志物的影响而达到抑制成纤维细胞进一步向成骨型的分化。
詹玉林[10]（2008）在《基因枪介导BMP-2基因转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究》文中研究指明目的:通过骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP-2）基因转染以增加组织细胞BMP-2蛋白的分泌量,提高BMP-2蛋白在生物体骨折局部组织中的浓度,达到促进骨折愈合的目的已经成为现实。但是,如何提高质粒对于靶组织的转染效率、寻求一种高效、简便的转染手段,如何缩短鉴定转染是否成功的时间,以及在基因转染促进骨愈合的过程中,采用不同的转染时间、不同的转染频率和不同的转染剂量与促进骨折愈合效果之间的关系,一直未得到很好的阐明。本研究包括:1)建立稳定的、基因序列正确的、检测方便的、含有BMP-2基因的pIRES2-增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein, EGFP）-BMP-2真核表达质粒并检测其转染NIH3T3细胞的效率及转染后的生物学活性;2)从兔的股骨、胫骨中获得骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells, BMSCs）,培养、传代后使用pIRES2-EGFP-BMP-2质粒进行转染,以了解该质粒转染兔骨髓间充质干细胞的效率及转染后的生物学活性;3)探讨使用基因枪对兔桡骨骨折周围组织进行pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染、导入的有效性,并研究在不同时间、采用不同剂量、不同导入频率进行基因枪介导的BMP-2基因转染与兔桡骨骨折愈合之间的关系。方法:1)本课题第一部分:将BMP-2cDNA基因片段和pIRES2-EGFP载体两种质粒分别用EcoR I、BglⅡ作双酶切,采用T4DNA连接酶连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α。扩增提取重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2,纯化处理后,用限制性核酸内切酶进行酶切、电泳鉴定,并送上海生工生物工程技术服务有限公司作测序鉴定。复苏NIH3T3细胞,传代、培养后采用LipofectamineTM2000转染试剂介导进行pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染NIH3T3细胞,转染24小时后取部分细胞在倒置荧光显微镜下观察结果。其余部分用含G418的DMEM培养液筛选后搜集细胞,进行BMP-2蛋白的western blot检测,对其转染效果进行鉴定。2)本课题第二部分:采用取自2只新西兰大白兔的新鲜股骨、胫骨标本,剪除骨骺端后,穿刺骨髓、抽取骨髓经离心后获取单个核细胞,传至第3代时进行Lipofectamine TM 2000介导的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染。转染24小时后取部分细胞在倒置荧光显微镜下观察结果。其余部分用含G418的DMEM培养液进行筛选,4周后搜集细胞,进行BMP-2蛋白的western blot检测。3)本课题第三部分:采用健康新西兰大白兔119只,随机分为7组,每组17只。采用耳缘静脉麻醉后,手术区域剔除毛发,强力碘消毒、铺无菌巾单,取左前臂背侧3厘米切口逐层切开,采用微创显露技术以尽量少干扰骨折周围组织,直至切开骨膜,显露桡骨中段,以线锯造成桡骨中段的横行骨折。所有动物模型制作均由同一位操作者完成。根据不同的组别施以干预措施。5μg组:手术造成骨折后立即给予5μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织;10μg组:手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织; 3天后10μg组:手术当时仅造成骨折,然后关闭手术切口。3天后再次沿原手术切口切开显露骨折部位,给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织;3天后0μg组:手术当时仅造成骨折,然后关闭手术切口。3天后再次沿原手术切口切开显露骨折部位,给予10μg pIRES2-EGFP空白质粒轰击骨折区及周围组织;14天后再次10μg组:本组大白兔在手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织,14天后再次沿原手术切口显露骨折,再给予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒的轰击;14天后再次0μg组:本组大白兔在手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP- BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织,14天后再次沿原手术切口显露骨折,再给予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP空白质粒的轰击。对照组（0μg组）:手术造成骨折后立即给予不含BMP-2基因的10μg pIRES2-EGFP空白质粒轰击作为对照。各组于手术后1周时,随机处死2只实验动物,取骨折区周围软组织,行BMP-2蛋白的Western blot检测,观察BMP-2蛋白表达情况。术后4、6、8和12周进行X光片摄片观察骨折线变化、骨痂生长及骨髓腔再通情况,并在X光片提示骨折已经愈合（骨折线消失）时随机处死该骨折愈合组中2只动物,进行大体标本的观察。结果:1)重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2经EcoRI BglⅡ双酶切、电泳后,出现了1.2kbp和5.3kbp两条带,分别为BMP-2cDNA片段和pIRES2-EGFP载体片段,说明目的基因片段已连接到载体上;合成的质粒测序结果经NCBI中的BLAST软件分析,其核酸序列与Gene Bank中hBMP-2的mRNA序列（NM 001200）的编码序列相符,说明构建质粒的hBMP-2基因序列正确。经pIRES2-EGFP-BMP-2转染后的NIH3T3细胞在倒置荧光显微镜下观察显示增强绿色荧光蛋白阳性,Western blot检测显示在相对分子质量（Mr）为30×103处显现单一特异性条带,证明有BMP-2蛋白的表达。2 )从实验动物兔股骨及胫骨中成功获得了兔骨髓间充质干细胞, LipofectamineTM2000介导的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞24小时后,倒置荧光显微镜下显示转染后的兔骨髓间充质干细胞内可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布。Western blot检测显示转染后的兔骨髓间充质干细胞在相对分子质量（Mr）为30×103处显现单一特异性条带,说明有BMP-2蛋白的表达。3)经基因枪介导pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染的实验动物,在骨折后7天,实验动物骨折部位周围软组织的Western blot检测显示BMP-2蛋白表达阳性,并且量明显增多。实验动物桡骨骨折愈合过程的X线4周、6周、8周、12周观察显示,5μg组、对照组（0μg组）较10μg组的骨折线消失时间延长、骨痂形成量差、骨髓腔再通时间延长;3天后10μg组与3天后0μg组相比,3天后10μg组骨折线消失时间缩短、骨痂形成量好、骨髓腔再通时间缩短:3天后10μg组与10μg组相比,在骨折线消失的时间、骨痂形成的质量及骨髓腔再通的时间上无明显差异;14天后再次10μg组与14天后再次0μg组相比,在骨折线消失的时间、骨髓腔再通的时间上无明显差异,但是在骨痂的形成质量上优于14天后再次0μg组及其他各组。结论:1)含有BMP-2基因序列的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒构建成功并具有转录活性。2)兔骨髓间充质干细胞可被真核表达质粒pIRES2-EGFP-BMP-2转染并能在骨髓间充质干细胞中翻译、表达产生BMP-2蛋白。3)含有BMP-2基因的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒可以被基因枪成功导入兔桡骨周围的组织细胞中,并可在其内翻译、表达BMP-2蛋白。使用基因枪将BMP-2基因导入兔桡骨骨折周围组织以促进骨折愈合时,可以明显缩短骨折的愈合时间、提高骨痂的生成质量、缩短骨髓腔的再通时间。分别采用0μg、5μg、10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入促进骨折愈合时,在骨折愈合时间、骨痂生成量、骨髓腔再通时间上,随导入质粒剂量的增加而效果逐渐明显。延迟于骨折当时3天进行10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入时,其在骨折愈合时间、骨痂生成量、骨髓腔再通时间上与骨折当时进行质粒导入没有区别。骨折当时、骨折后14天两次进行10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入以促进骨折愈合时,骨折愈合时间、骨髓腔再通时间上与骨折当时、单次质粒导入没有区别,但是该实验组动物骨痂的生成质量得到了改善。
二、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ,Ⅱ型胶原及碱性磷酸酶的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ,Ⅱ型胶原及碱性磷酸酶的表达（论文提纲范文）
（1）Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 羊膜间充质干细胞分离、提取与鉴定及其多向分化潜能的实验研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 Shn3对BMP9 诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成的作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成中的信号机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述:成骨分化和血管形成中分子的偶联机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的主要学术成果 |
（2）骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 成骨细胞的分离、培养与鉴定 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 骨粘连蛋白影响成骨细胞矿化期非胶原蛋白基因的表达 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 骨粘连蛋白对其它矿化指标的影响及SB203580的阻断效应 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四部分 AD-p38及p38-rhRNA病毒载体构建 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第五部分: P38 MAPK在骨粘连蛋白调控成骨细胞矿化中信号通路作用的进一步研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 生物矿化及仿生的机制研究及应用 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士期间发表文章一览表 |
| 致谢 |
（3）重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 构建hBMP2、hTGF-β3以及hBMP2-hTGF-β 3真核表达质粒、病毒的包装和转染BMSCs细胞 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SD大鼠的BMSCs的提取、体外培养和鉴定 |
| 1.2.2 构建PCDH-CMV-EGFP-hBMP2、PCDH-CMV-EGFP-hTGF-β3以及PCDH-CMV-EGFP-hBMP2-hTGF-β3真核表达质粒,并筛选、鉴定、扩增和抽提 |
| 1.2.3 包装病毒的过程 |
| 1.2.4 慢病毒携带重组质粒单个和联合转染BMSCs细胞 |
| 1.2.5 检测经过转染的BMSCs细胞中的目的基因表达 |
| 1.2.6 转染后BMSCs细胞形态变化 |
| 1.2.7 转染后的BMSCs细胞成骨分子的表达 |
| 1.2.8 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 大鼠BMSCs的形态学观察 |
| 1.3.2 大鼠BMSCs的表型鉴定 |
| 1.3.3 目的基因PCR扩增产物电泳分析 |
| 1.3.4 酶切验证重组质粒 |
| 1.3.5 重组质粒经公司测序后结果 |
| 1.3.6 慢病毒包装结果 |
| 1.3.7 慢病毒介导的重组目的质粒感染BMSCs细胞 |
| 1.3.8 免疫印记分析检测目的基因的表达 |
| 1.3.9 实时荧光定量PCR检测BMSCs中目的基因的表达 |
| 1.3.10 感染后的细胞形态变化 |
| 1.3.11 利用细胞爬片和免疫组化染色检测各组细胞转染后的细胞形态和目的蛋白表达 |
| 1.3.12 转染后各组BMSCs的成骨分子的表达 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 慢病毒介导的BMP2和TGF-β3重组质粒感染BMSCs后对大鼠脊柱融合的协同成骨作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定 |
| 2.2.3 各组LV转染大鼠BMSCs移植材料的准备 |
| 2.2.4 手术方法 |
| 2.2.5 标本收集 |
| 2.2.6 观察指标 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 X线片观察 |
| 2.3.2 手动测量评估 |
| 2.3.3 微计算机断层扫描(Micro-CT)分析 |
| 2.3.4 组织学观察标本 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）氟化钠对重组人骨形成蛋白-2应用于大鼠异位成骨协同作用的可行性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 骨缺损的修复简介 |
| 1.2 RhBMP-2 概述 |
| 1.3 rhBMP-2 载体概述 |
| 1.4 双释放系统的研究 |
| 1.5 rhBMP-2 的应用 |
| 1.5.1 rhBMP-2 在骨科的应用 |
| 1.5.1.1 rhBMP-2应用于长骨骨折及骨缺损治疗的相关研究 |
| 1.5.1.2 rhBMP-2 应用于股骨头坏死治疗的研究 |
| 1.5.2 rhBMP-2 在脊柱融合术中的应用 |
| 1.5.3 rhBMP-2 在脑外科的应用 |
| 1.5.4 rhBMP-2 在软骨修复中的应用 |
| 1.5.5 rhBMP-2 在口腔领域的应用 |
| 1.5.5.1 rhBMP-2应用于颌面部骨缺损修复的相关研究 |
| 1.5.5.2 rhBMP-2应用于颌面部牵张成骨的相关研究 |
| 1.5.5.3 rhBMP-2应用于口腔种植的相关研究 |
| 1.6 氟化物在成骨过程的作用 |
| 1.6.1 氟对成骨细胞的影响 |
| 1.6.2 氟对破骨细胞的影响 |
| 1.6.3 氟对骨形成相关激素的影响 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植入材料 |
| 2.3.2 外科手术 |
| 2.3.3 一般状态观察 |
| 2.3.4 生化检测 |
| 2.3.5 组织学分析 |
| 2.3.6 数据处理和统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 一般状态 |
| 3.2 氟化物对rhBMP-2 诱导的异位成骨的钙含量改变 |
| 3.3 氟化物对rhBMP-2 诱导的异位成骨的碱性磷酸酶活性改变 |
| 3.4 氟化物对rhBMP-2 诱导的异位成骨组织学改变 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 后记和致谢 |
（5）DNCPs促进BMSCs体外成骨及在犬上颌窦底提升同期种植术的成骨效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 引言 |
| 第一部分 β-TCP对BMSCs体外成骨的影响 |
| 1.1 研究背景及目的 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 支架材料对BMSCs黏附、增殖的影响 |
| 1.3.2 扫描电镜观察结果 |
| 1.3.3 ALP染色及活性检测结果 |
| 1.3.4 支架材料对BMSCs中骨形成相关因子基因和蛋白相对表达水平的影响 |
| 1.3.5 BMP1基因对β-TCP调控BMSCs成骨分化的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 骨替代材料的比较 |
| 1.4.2 骨替代材料的成骨相关特性 |
| 1.5 结论 |
| 第二部分 DNCPs对BMSCs体外成骨的影响 |
| 2.1 研究背景及目的 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 实验动物 |
| 2.2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.2.1.3 主要实验器材 |
| 2.2.1.4 主要试剂材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 DNCPs的提取和分析 |
| 2.2.2.2 犬BMSCs的分离和培养 |
| 2.2.2.3 细胞增殖检测 |
| 2.2.2.4 ALP染色及活性检测 |
| 2.2.2.5 茜素红染色及定量检测 |
| 2.2.2.6 Real-time RT-PCR检测 |
| 2.2.2.7 Western blot检测 |
| 2.2.2.8 TGF-β1/smad3信号通路 |
| 2.2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 DNCPs分析结果 |
| 2.3.2 DNCPs对BMSCs增殖的影响 |
| 2.3.3 ALP染色及活性检测结果 |
| 2.3.4 茜素红染色及定量检测结果 |
| 2.3.5 DNCPs对BMSCs中骨形成相关因子基因和蛋白相对表达水平的影响 |
| 2.3.6 TGF-β1/smad3信号通路对DNCPs促进BMSCs成骨分化的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三部分 DNCPs-β-TCP复合材料对BMSCs体外成骨的影响 |
| 3.1 研究背景及目的 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 实验动物 |
| 3.2.1.2 主要实验仪器 |
| 3.2.1.3 主要实验器材 |
| 3.2.1.4 主要试剂材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 DNCPs-β-TCP复合材料制备 |
| 3.2.2.2 DNCPs-β-TCP复合材料模拟释放 |
| 3.2.2.3 细胞黏附和增殖的检测 |
| 3.2.2.4 扫描电镜观察 |
| 3.2.2.5 SABC-Cy3荧光染色观察细胞形态 |
| 3.2.2.6 ALP活性检测 |
| 3.2.2.7 Real-time RT-PCR和Western blot检测 |
| 3.2.2.8 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 DNCPs-β-TCP复合材料中DNCPs的释放率检测结果 |
| 3.3.2 DNCPs-β-TCP复合材料对BMSCs黏附和增殖的影响 |
| 3.3.3 扫描电镜观察结果 |
| 3.3.4 DNCPs-β-TCP复合材料对BMSCs的影响 |
| 3.3.5 ALP活性检测结果 |
| 3.3.6 DNCPs-β-TCP复合材料对BMSCs中骨形成相关因子基因和蛋白相对表达水平的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四部分 DNCPs-β-TCP复合材料结合BMSCs在犬上颌窦底提升同期种植术中的成骨效果 |
| 4.1 研究背景及目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 实验动物 |
| 4.2.1.2 主要实验仪器 |
| 4.2.1.3 主要实验器材 |
| 4.2.1.4 主要试剂材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 动物准备 |
| 4.2.2.2 细胞与支架材料复合 |
| 4.2.2.3 beagle犬上颌窦底提升同期种植模型的构建 |
| 4.2.2.4 ISQ测量 |
| 4.2.2.5 动物处死及标本制备 |
| 4.2.2.6 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 ISQ数值分析 |
| 4.3.2 CT观察及CT值测量结果 |
| 4.3.3 HE染色观察结果 |
| 4.3.4 Masson染色观察结果 |
| 4.3.5 骨组织形态计量学检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 上颌窦内的成骨机制 |
| 4.4.2 上颌窦底提升术中植骨材料的应用及不足 |
| 4.4.3 组织工程骨在上颌窦内的应用 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（6）马鹿茸多肽“补肾健骨”作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 肽的分离与纯化 |
| 第一节 肽的分离与纯化 |
| 第二节 高效凝胶过滤色谱法测定马鹿茸多肽的分子量 |
| 第三节 SDS-PAGE法测定马鹿茸多肽分子量的分布 |
| 第二章 马鹿茸多肽对成骨细胞的增殖和分化的作用 |
| 第三章 马鹿茸多肽对骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化的作用 |
| 第一节 马鹿茸多肽对骨髓间充质干细胞的增殖和分化的作用 |
| 第二节 马鹿茸多肽促骨髓间充质干细胞骨向分化的机制研究 |
| 第四章 马鹿茸多肽对大鼠肾虚型骨质疏松症的作用 |
| 第五章 马鹿茸多肽A的组分研究 |
| 第一节 马鹿茸多肽A中的氨基酸的组分分析 |
| 第二节 HPL-MS测定马鹿茸多肽A的组分分析 |
| 第三节 马鹿茸多肽A的表面结构研究 |
| 第四节 马鹿茸多肽A的网络药理学研究 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述一 中药防治骨质疏松症的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 多肽类物质的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）重组腺病毒BMP-9对牙囊干细胞成骨向诱导分化的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠 DFCs 的分离培养和纯化鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 重组腺病毒 BMP-9 转染的 DFCs 成骨向诱导分化研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 重组腺病毒 BMP-9 转染的 DFCs 成骨向诱导分化调控机制的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 文献综述：骨形成蛋白和干细胞重建颅颌面骨缺损的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 参加会议和学习培训 |
| 攻读博士期间的课题申报 |
（8）PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文前言 |
| 第一章: 兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第二章: 脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第三章: 支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图表 |
| 6. 讨论 |
| 第四章: 兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第五章: Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 1. 颌骨牵张成骨研究进展 |
| 参考文献 |
| 2. 可注射支架材料在骨和软骨组织工程中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间所发表论文 |
| 攻读博士学位期间所主持的科研项目及课题 |
（9）补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达的影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 组织取材 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 成纤维细胞的体外培养 |
| 1.3.2 补肾强脊颗粒含药血清制备 |
| 1.3.2. 1 药物与动物 |
| 1.3.2. 2 分组给药及血清制备 |
| 1.3.3 分组与给药 |
| 1.3.4 碱性磷酸酶 (ALP) 活性检测 |
| 1.3.5 细胞上清液胶原含量测定 |
| 1.3.6 细胞上清液骨钙素 (OC) 含量测定 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞ALP活性的影响 |
| 2.2 补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞上清液胶原含量的影响 |
| 2.3 补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的AS成纤维细胞上清液OC含量的影响 |
| 3 讨论 |
（10）基因枪介导BMP-2基因转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 pIRES2-EGFP-BMP-2 质粒的构建及其转染活性的测定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要材料及试剂 |
| 1.2 pIRES2-EGFP-BMP-2 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1.3 脂质体介导的pIRES2-EGFP-BMP-2 转染和阳性克隆筛选培养 |
| 1.4 BMP-2 在NIH3T3 细胞内的表达 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 pIRES2-EGFP-BMP-2 质粒转染兔骨髓间充质干细胞及其表达活性的测定 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验动物、试剂与菌种 |
| 1.2 实验步骤 |
| 1.3 检测BMP2 在骨髓间充质干细胞内的表达情况 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 基因枪介导pIRES2-EGFP-BMP-2 质粒转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 实验过程 |
| 1.3 观察方法及指标 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、TGF-β增强rhBMP-2诱导成骨中Ⅰ,Ⅱ型胶原及碱性磷酸酶的表达（论文参考文献）
- [1]Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究[D]. 李豫皖. 重庆医科大学, 2020(01)
- [2]骨粘连蛋白通过p38MAPK通路调控成骨细胞矿化的研究[D]. 朱云森. 苏州大学, 2020(06)
- [3]重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用[D]. 何武兵. 南方医科大学, 2020
- [4]氟化钠对重组人骨形成蛋白-2应用于大鼠异位成骨协同作用的可行性研究[D]. 史怡凡. 吉林大学, 2020(08)
- [5]DNCPs促进BMSCs体外成骨及在犬上颌窦底提升同期种植术的成骨效果研究[D]. 窦晓晨. 山东大学, 2019(02)
- [6]马鹿茸多肽“补肾健骨”作用与机制研究[D]. 任聪. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [7]重组腺病毒BMP-9对牙囊干细胞成骨向诱导分化的研究[D]. 李丛华. 重庆医科大学, 2013(03)
- [8]PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究[D]. 周诺. 广西医科大学, 2012(08)
- [9]补肾强脊颗粒对细胞因子诱导下的强直性脊柱炎成纤维细胞成骨型表达的影响[J]. 贾春蓉,冯兴华,刘宏潇,李敏,吴志奎. 浙江中医药大学学报, 2011(06)
- [10]基因枪介导BMP-2基因转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究[D]. 詹玉林. 新疆医科大学, 2008(03)