一、Phosphoinositides as ligands of PHD-fingers: implications for chromatin remodeling（论文文献综述）
李瑞哲[1]（2021）在《低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制》文中指出牦牛（Bos grunniens）是青藏高原及其毗邻地区的特色畜种,对当地农牧民的生产生活具有重要的意义,被誉为“高原之舟”。牦牛繁殖的季节性明显,繁殖效率较低,严重制约了产业发展。利用胚胎体外生产等现代繁殖生物技术,能够提升牦牛的繁殖潜力,是提高牦牛产业效率的途径之一。卵母细胞是现代繁殖生物技术的基础材料,卵母细胞质量影响着后续胚胎质量。在人、牛、山羊和小鼠等物种上的研究表明,体外成熟过程中氧分压影响卵母细胞的质量和发育能力,而在牦牛上相关研究还较少。为此,本研究在分析不同氧分压和抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力影响的基础上,分别从卵母细胞和卵丘细胞转录组层面探讨了低氧影响牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的机制。主要研究结果如下:1.不同氧分压对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响研究了5%和20%O2对牦牛卵母细胞体外成熟率,卵母细胞ROS水平和GSH含量,孤雌胚胎和体外受精（IVF）胚胎发育的影响。结果表明:5%O2提高了卵母细胞体外成熟率（P<0.05）和GSH含量（P<0.05）,降低了卵母细胞ROS水平（P<0.01）,提高了孤雌囊胚和IVF囊胚质量。2.不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响研究了卵母细胞成熟液中添加半胱胺、褪黑素、白藜芦醇和维生素C对牦牛卵母细胞体外成熟率,卵母细胞ROS水平、GSH含量和线粒体分布,以及IVF胚胎发育的影响。结果表明:（1）半胱胺提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）;（2）褪黑素提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）、GSH含量（P<0.05）、线粒体均质分布比例（P<0.05）和IVF胚胎卵裂率（P<0.05）,降低了卵母细胞ROS水平（P<0.05）;（3）白藜芦醇和维生素C均提高了卵母细胞GSH含量（P<0.05）和降低了卵母细胞ROS水平（P<0.05）。3.不同氧分压对牦牛卵母细胞转录组的影响对5%和20%O2成熟培养的牦牛MⅡ期卵母细胞,分别进行单细胞转录组测序。鉴定出120个差异表达基因,其中37个基因在5%O2组上调,主要参与缺氧反应、细胞周期/细胞分裂、染色质构象与重塑和细胞骨架,83个基因在5%O2组下调,主要参与能量代谢、蛋白合成、氧化还原平衡和卵丘细胞调控。GO分析表明:上调基因（5%O2 vs 20%O2,下同）富集于核质、以DNA为模板的正向转录调控、ERK1和ERK2级联反应等7个条目;下调基因（5%O2 vs 20%O2,下同）富集于线粒体、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、胞浆大核糖体亚单位和外泌体等7个条目等。KEGG分析表明:上调基因富集于缺氧诱导因子-1信号转导、神经营养因子信号转导、粘附斑、微丝细胞骨架调控和PI3K-Akt信号转导等11个通路;下调基因富集于氧化磷酸化等4个通路。4.不同氧分压对牦牛卵丘细胞转录组的影响对5%和20%O2成熟培养的牦牛COCs,分别收集卵丘细胞,进行转录组测序。鉴定出270个差异表达基因,其中229个基因在5%O2组上调,主要参与缺氧反应、糖酵解、免疫/炎性反应和细胞凋亡,41个基因在5%O2组下调,主要参与抗凋亡和抗炎。GO分析表明:上调基因富集于缺氧反应、糖酵解过程、ATP代谢过程、炎症反应等26个条目;下调基因富集于蛋白同二聚化活性和受体结合2个条目。KEGG分析表明:上调基因富集于神经活性配体-受体互作、c AMP信号通路、糖酵解/糖异生等9个通路;下调基因没有得到富集。本研究分析了不同氧分压和抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及不同氧分压对牦牛卵母细胞和卵丘细胞转录组的影响,得出以下结论:与20%O2培养相比,5%O2培养时牦牛卵母细胞受到的氧化应激减少,卵丘细胞向卵母细胞提供能量代谢底物的能力增强,有利于牦牛卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育。研究结果为继续深入研究氧分压对牦牛卵母细胞成熟、发育能力及卵丘细胞-卵母细胞互作的影响及其作用机制提供了参考数据。
蒋云霞[2]（2021）在《荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究》文中进行了进一步梳理目的:以大鼠肝星状细胞T6细胞株（HSC-T6）为受试对象,探讨并完善荔枝核总黄酮（total flavonoids from Litchi Seed,TFL）拮抗肝纤维化的作用靶点与作用机制。方法:常规培养HSC-T6,分别观察TFL在不同时间和不同浓度对HSC生长增殖率的影响,从中选择最佳的TFL药物浓度进行后续实验;将HSC-T6分为细胞对照组和TFL实验组,细胞对照组的HSC-T6常规培养,TFL实验组采用上述最佳的TFL药物浓度干预HSC-T6,分别使用透射电子显微镜和ELISA方法检测各组HSC-T6的超微结构和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）含量的变化。制备肝纤维化模型大鼠,在大鼠腹部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混悬液0.3 ml/100 g,2次/周,共8周。造模完成后,行肝组织病理染色检测,证实造模成功。将肝纤维化造模完成的大鼠分为模型对照组和TFL实验组,模型对照组大鼠在肝纤维化造模完成后常规饲养,TFL实验组大鼠予灌胃TFL 100 mg/（kg·d）,4周后收集模型对照组和TFL实验组的大鼠血清。检测各组血清对HSC-T6的最大无毒浓度,以最大无毒浓度为最佳诱导剂量孵育HSC-T6,诱导分化14天后提取全蛋白,通过DDA/DIA技术筛选出模型对照组和TFL实验组血清干预后的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO、KOG、PPI、PATHWAY和亚细胞定位等生物信息学分析。结果:1.透射电镜结果显示TFL干预后HSC-T6的超微结构发生变化,细胞间隙变大,胞膜四周纤毛脱落,多角伪足减少,膜表面不平整,细胞浆内线粒体明显变形,线粒体嵴断裂或消失,粗面内质网扁池扩张,核糖体脱落,核内染色质浓缩或边聚,核膜皱缩,可见凋亡小体形成。2.ELISA 结果显示,TFL 干预后 HSC-T6 的 MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量下降。3.生物信息学分析结果显示,模型对照组和TFL实验组的差异蛋白共177个,其中上调蛋白84个,下调蛋白93个。GO分析显示,差异蛋白参与分子功能共10个条目,主要为分子结合和催化活性;细胞组分共18个条目,主要为细胞质和细胞器;生物过程共24个条目,主要为细胞过程、代谢过程、生物调节等。4.KOG注释分析显示,差异蛋白比对到KOG数据库共有23个子类和192条蛋白注释信息,其中细胞过程和信号传递是获得注释信息最多的分类,其次为信息存储与处理、新陈代谢作用和缺乏注释的蛋白等。5.PPI分析结果显示,存在互作关系的上调蛋白28个:SELENOH、C1QC、C1QB、APOE、ANGPTL4、NF1、GPX3、CLU、DMAP1、VTN、MYH14、SELENOM、HRG、PF4、HMOX1、IGH1A、IGG2A、IGHG、PGK2、PLIN2、KDM4C、ITIH4、BAZ2A、C9、ADH7、MGST1、GSTA1、ATP9B等。存在互作关系的下调蛋白42个:RAD51、HELZ2、PBK/TOPK、HMGCS1、UBE2T、UBE2C、DLGAP5、LOC100911660、PTEN、BLM、CYP51A1、MDC1、LRRK1、MVD、NSDHL、IDI1、SPC24、CDCA8、KNSTRN、CCNB2、FAM83D、HMGXB4、STARD4、HLTF、LIPG、UHRF1、KAT8、PCSK9、UBE2S、AMMECR1L、WDR76、ZNRD2、DDX10、MAP3K3、PIMREG、SMAD1、MCL1、MPRIP、FIGNL1、RPAP1、STMN1、SPP1 等。6.PATHWAY富集分析结果显示,KEGG代谢通路分为6个分支,共注释38项条目,分支包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统等,其中差异蛋白占比前三的分支为人类疾病、新陈代谢和有机系统。代谢通路主要包括原发性免疫缺陷、金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、系统性红斑狼疮、哮喘产生IgA的肠道免疫网络、免疫系统、萜类骨架的生物合成、自身免疫性甲状腺疾病、同种异体移植排斥、范可尼贫血途径、造血细胞谱系、非洲锥虫病、胆固醇代谢、类风湿关节炎、矿物质吸收、细胞色素P450对异生物的代谢、病毒性心肌炎、利什曼病、阿米巴病、癌症中的转录失调、扩张型心肌病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、FcεRI信号通路、B细胞受体信号通路、磷脂酶D信号通路、NF-κB信号通路、酮体的合成与降解、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌、药物代谢-细胞色素P450等。7.亚细胞定位结果发现这些差异蛋白主要位于细胞核、细胞质或细胞外,其余则较平均散布于胞质内膜、线粒体、过氧化物酶体、内质网、胞质网丝以及细胞骨架上。结论:1.荔枝核总黄酮（TFL）可下调HSC-T6的MMP-2、ColⅠ和ColⅢ的表达水平,对HSC-T6的生长增殖具有抑制作用。2.本实验基于DDA/DIA模式并通过GO、KOG、PPI、PATHWAY以及亚细胞定位等生物信息学技术分析后发现C1QC、C1QB、C9、SELENOH、SELENOM、GPX3、APOE、CLU、ANGPTL4、NF1、HRG、PF4、ITIH4、ADH7、RAD51、BLM、FIGNL1、MDC1、SPC24、KNSTRN、CDCA8、HELZ2、HMGCS1、MVD、IDI1、CYP51A1、NSDHL、LIPG、PBK/TOPK、FAM83D、DLGAP5、UBE2T、UBE2C、UBE2S、UHRF1、MAP3K3、LRRK1、SMAD、、MCL、等差异蛋白与肝纤维化疾病具有密切相关性;PI3K/Akt通路、NF-κB信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、细胞色素P450可能是TFL抑制HSC-T6生长增殖并诱导HSC-T6死亡的主要信号转导途径。3.TFL可能通过调控多个蛋白和参与多种信号传导通路抑制ECM的形成和诱导HSC-T6死亡,发挥拮抗肝纤维化的生物学效应。
高安博[3]（2021）在《SENP7去类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大》文中进行了进一步梳理Apelin是G蛋白偶联受体家族特异性受体APJ的内源性配体,其编码序列定位在染色体Xq25-q26.1上。Apelin和APJ广泛分布于血管壁细胞、内皮细胞和心肌细胞中,多种复杂因素均可调控Apelin基因表达和分泌,提示其在心血管系统生理或病理生理进程中发挥重要调控作用。课题组前期研究成果揭示,Apelin-13/APJ系统可通过铁自噬-SFXN1依赖性线粒体铁超载途径、Caveolin-1-自噬途径、PI3K/AKT/ERK1/2/p70S6K-自噬途径、内质网应激-自噬途径、线粒体丝氨酸/一碳单位途径、GOLPH3-高尔基体自噬途径等促进心肌细胞肥大发生发展,但确切机制仍有待进一步探究。自噬是普遍存在于机体组织、细胞中的一种较为保守的降解代谢过程,自噬过度激活加剧心脏压力超负荷、导致心肌收缩功能障碍,促进心力衰竭所致的心肌病理性重构。一项涉及多细胞系单一细胞器功能学的研究证实,选择性自噬参与高尔基体的质量控制和形态稳定,并促进高尔基体进入自噬流发生降解,并被命名为高尔基体自噬（Golgiphagy）。课题组研究结果揭示,Apelin-13/APJ系统上调高尔基体应激标志蛋白GOLPH3,诱导高尔基体应激,破坏高尔基体形态结构,高尔基体膜囊与自噬相关蛋白LC3结合并进入自噬流,诱导Golgiphagy发生发展,然而其中所涉及的具体机制尚未阐明。GOLPH3介导高尔基体自噬能否参与Apelin-13/APJ系统促心肌肥厚仍需进一步探明。类泛素化修饰作为蛋白质翻译后修饰方式之一,在心肌肥厚发生发展中起着关键调控作用。类泛素样分子SUMO与靶蛋白氨基酸序列中的赖氨酸残基相互结合,激活或抑制靶蛋白生物学功能、改变其空间定位、促进其溶酶体降解等,在自噬过程中发挥重要激活和调控作用。然而,类泛素化修饰是否参与高尔基体应激,何种SUMO分子参与调控GOLPH3介导高尔基体自噬仍不明确,且Apelin-13/APJ系统在类泛素化修饰中的具体作用仍需进一步探究。据此,我们提出“SENP7去类泛素化修饰AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大”这一科学假说。即Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,介导高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,诱导高尔基体自噬,最终加剧心肌肥厚发生发展。为验证这一假说,研究内容分为七个部分进行:（1）GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（3）SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（4）去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;（5）Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;（6）GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大;（7）GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展。本项目将阐明抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2靶向高尔基体,类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,破坏高尔基体结构,加剧高尔基体应激,诱导GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促心肌肥厚发生发展的新分子机理。拓展Apelin-13/APJ系统调控AQP4类泛素化修饰、GOLPH3介导高尔基体自噬的新生物学功能,明确Apelin-13/APJ系统参与心肌肥厚进展的具体机制,以期为Apelin-13/APJ系统成为心肌肥厚治疗新靶点提供新的理论依据和实验基础。第一部分GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ对高尔基体GOLPH3蛋白表达的影响,探究Apelin-13/APJ系统促进高尔基体解构象、破坏高尔基体形态,诱导高尔基体自噬发生发展。方法:Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度孵育H9C2大鼠心肌细胞;加入APJ受体拮抗剂F13A或自噬抑制剂3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞后,再次加入Apelin-13;pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3或同时加入自噬激活剂雷帕霉素及3-MA,Western Blot观察LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平。免疫共沉淀实验,分析H9C2大鼠心肌细胞内LC3与GOLPH3相互作用关系。细胞免疫荧光分别标记LC3、高尔基体顺式膜囊标志物GM130及反式膜囊标志物TGN46,观察LC3与GM130和TGN46共定位情况。pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3,透射电镜观察H9C2大鼠心肌细胞内高尔基体形态结构改变、高尔基体与自噬囊泡融合情况、胞内自噬小体形成数量。结果:Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞中LC3、TFE3、SPCA1以及GOLPH3蛋白水平,下调p62蛋白水平;F13A及3-MA抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3、TFE3、SPCA1以及GOLPH3蛋白水平上调和p62蛋白水平下调;免疫共沉淀结果显示,Apelin-13呈浓度和时间依赖性促进GOLPH3与LC3相互作用,而F13A及3-MA抑制Apelin-13促LC3与GOLPH3相互作用;GOLPH3过表达上调LC3、TFE3、SPCA1蛋白水平,下调p62蛋白水平。3-MA显着抑制GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1蛋白水平上调和p62下调;免疫荧光显示,GOLPH3过表达促LC3与高尔基体顺式膜囊标志GM130及反式膜囊标志物TGN46共定位;透射电镜显示,GOLPH3过表达促进H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,高尔基体结构破坏明显、空泡化严重,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合,进入自噬流。小结:（1）Apelin-13/APJ系统加剧高尔基体应激,促进GOLPH3与LC3相互结合,诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展。第二部分Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ对H9C2大鼠心肌细胞高尔基体膜蛋白AQP4表达的影响,探究AQP4参与高尔基体应激及LC3和GOLPH3相互结合的具体作用,明确高尔基体膜蛋白AQP4介导高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积在高尔基体形态结构破坏,高尔基体自噬中具体作用和机制。方法:构建并转染AQP4干扰链,Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度孵育H9C2大鼠心肌细胞;F13A或3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞后,再次加入Apelin-13;pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3或同时加入雷帕霉素及3-MA,Western Blot观察AQP4、LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平。透射电镜观察AQP4敲除对GOLPH3过表达促高尔基体自噬的影响。免疫荧光检测,AQP4敲除后LC3与高尔基体顺式膜囊标志物GM130及反式膜囊标志物TGN46共定位情况。免疫共沉淀实验检测,AQP4敲除对LC3与GOLPH3相互作用的影响。高尔基体绿色荧光探针GolgiGreen标记高尔基体膜囊组分PtdIns（4）P,观察Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体形态、结构、质量的影响。进一步游离H9C2大鼠心肌细胞高尔基体,Western Blot检测Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体上AQP4、LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。免疫共沉淀技术检测,Apelin-13对高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用的影响。过表达GOLPH3或同时加入布雷非德菌素A（BrefeldinA,BFA）,免疫荧光检测LC3与GM130或TGN46共定位情况。CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪分析胞内O2-含量。结果:Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调AQP4蛋白水平,F13A及3-MA 抑制 Apelin-13 促 AQP4 蛋白水平上调;si-AQP4 抑制 Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1及GOLPH3上调及p62下调;透射电镜显示si-AQP4抑制GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,部分恢复高尔基体形态结构、空泡化显着减少,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度降低;免疫共沉淀显示,si-AQP4抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3与GOLPH3相互作用;si-AQP4抑制Apelin-13促进LC3与GM130或TGN46共定位;GolgiGreen标记高尔基体膜囊组分PtdIns（4）P,发现si-AQP4上调高尔基体荧光强度,部分升高高尔基体质量,恢复破碎高尔基体形态结构;Apelin-13（1μM）、F13A（1μM,30min）或 3-MA（5mM,4h）处理 H9C2 大鼠心肌细胞并游离高尔基体,Western Blot检测Apelin-13上调高尔基体上LC3、AQP4蛋白水平,下调p62蛋白水平;免疫共沉淀实验显示,si-AQP4抑制Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用;免疫荧光结果显示,加入BFA后,si-AQP4抑制GOLPH3过表达促LC3与GM130或TGN46共定位;此外,si-AQP4上调高尔基体荧光强度,部分升高高尔基体质量,恢复GOLPH3过表达导致的高尔基体形态结构破碎;CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪进行结果分析,Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞内O2-含量升高,而F13A或3-MA抑制Apelin-13的作用;si-AQP4显着抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促胞内O2-含量升高。小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4蛋白水平,加剧高尔基体应激,促进GOLPH3与LC3相互结合,诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）高尔基体膜蛋白AQP4促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展。第三部分 SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ系统对高尔基体SUMO2表达及类泛素化修饰的影响,探究SUMO2能否促进高尔基体膜蛋白AQP4类泛素化修饰,明确SUMO2类泛素化修饰AQP4具体位点,阐明高尔基体膜蛋白AQP4促超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13促GOLPH3介导高尔基体自噬具体机制。方法:银杏酸孵育H9C2大鼠心肌细胞,过表达GOLPH3或加入Apelin-13,Western Blot 观察 LC3、p62、TFE3、SPCA1 及 GOLPH3蛋白表达变化。免疫共沉淀检测H9C2大鼠心肌细胞GOLPH3与LC3相互作用情况。免疫荧光观察银杏酸对LC3与高尔基体顺式膜囊标志物GM130或反式膜囊标志物TGN46共定位的影响。Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度,或Apelin-13同时加入F13A或3-MA,或3-MA同时GOLPH3过表达孵育H9C2大鼠心肌细胞。Western Blot检测Apelin-13对H9C2大鼠心肌细胞SUMO1、SUMO2及SUMO3蛋白水平影响。游离高尔基体,Western Blot检测Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体SUMO1、SUMO2及SUMO3蛋白水平的影响。利用抗原-抗体反应标记H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2蛋白,免疫胶体金电镜检测Apelin-13或GOLPH3过表达对H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2蛋白水平,以及SUMO2在高尔基体或自噬小体内富集情况。构建并转染SUMO2干扰链,Western Blot观察H9C2大鼠心肌细胞内LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。透射电镜观察SUMO2干扰链对Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体自噬的影响。免疫共沉淀进一步检测SUMO2干扰链对Apelin-13促GOLPH3与LC3相互作用的影响。敲除H9C2大鼠心肌细胞SUMO2并游离高尔基体,免疫共沉淀探究高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用情况。免疫荧光实验观察SUMO2敲除对Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位的影响。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测AQP4与SUMO2之间相互作用关系。同样处理条件下,进一步游离高尔基体,免疫共沉淀实验检测高尔基体上AQP4与SUMO2相互作用关系。构建并转染SUMO2增强型绿色荧光表达质粒EGFP-SUMO2、AQP4红色荧光表达质粒RFP-AQP4,激光共聚焦技术检测SUMO2与AQP4空间定位关系。免疫沉淀技术SUMO2结合并Pull down高尔基体AQP4,常规电泳并送质谱检测,探明SUMO2结合AQP4具体位点。根据该位点构建并转染AQP4野生型质粒或AQP4点突变质粒,Western Blot检测AQP4点突变对H9C2大鼠心肌细胞LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。免疫共沉淀实验检测AQP4点突变能否影响Apelin-13或GOLPH3过表达促AQP4与SUMO2相互作用。此外,AQP4干扰链敲除H9C2大鼠心肌细胞内源性AQP4表达并游离高尔基体,免疫共沉淀技术检测AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体AQP4与SUMO2相互作用关系的影响。免疫共沉淀技术检测AQP4点突变是否影响Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用关系。免疫荧光观察AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位的影响。CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪分别检测SUMO2干扰链对H9C2大鼠心肌细胞内O2-水平的影响,以及AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内O2-水平升高的影响。结果:银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达或雷帕霉素促LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平上调和p62下调;银杏酸抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3与GOLPH3相互作用;银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与GM130、TGN46共定位;Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞中SUMO1、SUMO2、SUMO3 蛋白水平,F13A 或 3-MA 抑制 Apelin-13 作用。GOLPH3过表达上调H9C2大鼠心肌细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白水平,3-MA抑制GOLPH3过表达作用。游离高尔基体,Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调高尔基体中SUMO2、SUMO3蛋白水平,但不影响SUMO1;GOLPH3过表达上调高尔基体中SUMO2蛋白水平,但不影响SUMO1及SUMO3;免疫电镜标记H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2,发现Apelin-13或GOLPH3过表达上调SUMO2蛋白水平,促进高尔基体结构松散、空泡化严重,高尔基体碎片与自噬囊泡融合明显,且SUMO2明显富集于高尔基体膜上;敲除SUMO2抑制Apelin-13促LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白上调和p62下调;敲除SUMO2抑制GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1蛋白上调和p62下调;敲除SUMO2抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,部分恢复高尔基体形态结构、空泡化显着减少,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度降低。SUMO2敲除抑制Apelin-13促LC3与GOLPH3相互作用;进一步游离高尔基体并敲除SUMO2,抑制Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用;敲除SUMO2抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位;Apelin-13或GOLPH3促H9C2大鼠心肌细胞SUMO2与AQP4相互作用;游离高尔基体,Apelin-13或GOLPH3促高尔基体上SUMO2与AQP4相互作用;Apelin-13或GOLPH3过表达促SUMO2和AQP4空间定位率均超过50%,且集中于高尔基体附近;免疫沉淀SUMO2 Pull down高尔基体AQP4,切胶后质谱检测SUMO2通过AQP4第311位赖氨酸促进其类泛素化修饰。构建并转染AQP4野生型（AQP4WT）或 AQP4 点突变型（AQP4K311R）质粒发现,AQP4K311R抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3 蛋白水平升高。AQP4K311R几乎完全阻断Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞AQP4和SUMO2相互作用;游离高尔基体,AQP4K311R抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体上AQP4和SUMO2相互作用;AQP4干扰链敲除H9C2大鼠心肌细胞内源性AQP4表达并游离高尔基体,AQP4K311R抑制Apelin-13促高尔基体上LC3和GOLPH3 相互作用;AQP4K311R抑制Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促高尔基体LC3与GM130及TGN46共定位;CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪检测发现SUMO2敲除抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高;AQP4K311R抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调并靶向SUMO2高尔基体富集;（2）Apelin-13/APJ系统促进高尔基体SUMO2通过第311位赖氨酸基团类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4;（3）高尔基体SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导高尔基体自噬。第四部分去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬目的:观察Apelin-13/APJ系统对去类泛素化修饰酶SENP7蛋白水平的影响,探明SENP7去类泛素化修饰对SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4的具体作用,阐明SENP7去类泛素化修饰参与GOLPH3介导高尔基体自噬的具体分子机制。方法:Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度、F13A或3-MA孵育H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测SENP7蛋白水平。构建并转染SENP7干扰链,Western Blot检测高尔基体SUMO2表达水平。构建并转染SENP7慢病毒表达质粒pLenti-SENP7并游离高尔基体,免疫共沉淀检测AQP4与SUMO2相互作用关系。转染pLenti-SENP7并同时Apelin-13 或 GOLPH3 过表达处理,Western Blot 检测 LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平变化。pLenti-SENP7转染H9C2大鼠心肌细胞过表达SENP7,或同时孵育Apelin-13后透射电镜观察高尔基体形态及自噬的形态学改变。游离高尔基体,免疫共沉淀检测高尔基体上LC3与GOLPH3共定位情况。免疫荧光观察SENP7慢病毒表达质粒pLenti-SENP7对LC3与高尔基体膜囊标志蛋白GM130或TGN46共定位的影响。转染pLenti-SENP7或同时Apelin-13、GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞。CellROX超氧阴离子检测试剂盒行荧光流式分析胞内O2-蓄积情况。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性下调H9C2大鼠心肌细胞SENP7蛋白水平,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;SENP7敲除上调高尔基体SUMO2蛋白水平,促进类泛素化修饰作用;构建慢病毒质粒pLenti-SENP7转染H9C2大鼠心肌细胞,过表达SENP7抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体SUMO2与AQP4相互作用;SENP7过表达抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平上调和p62下调;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞自噬囊泡数量增多,高尔基体结构破坏、空泡化加剧,降低高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度;SENP7过表达抑制Apelin-13促高尔基体LC3与GOLPH3相互作用;SENP7过表达抑制Apelin-13促LC3与高尔基体膜囊标志蛋白GM130或TGN46共定位;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高。小结:（1）Apelin-13/APJ系统抑制SENP7介导的H9C2大鼠心肌细胞去类泛素化修饰;（2）SENP7去类泛素化修饰参与SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积;（3）Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬。第五部分Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬目的:研究Apelin-13/APJ系统对自噬相关蛋白ATG5、ATG8、ATG12蛋白水平的影响,观察Apelin-13/APJ系统能否促进自噬囊泡包裹高尔基体形成自噬小体,阐明Apelin-13/APJ系统通过VPS35介导自噬小体的内体循环机制,明确Apelin-13/APJ系统在自噬小体的延伸及成熟中的具体作用,拓展以溶酶体蛋白LAMP2A介导的高尔基体为底物的选择性自噬降解在Apelin-13/APJ系统促高尔基体自噬中的新生物学功能。方法:Apelin-13以不同浓度梯度、不同时间梯度、F13A、3-MA或银杏酸处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ATG5、ATG8、ATG12蛋白水平。Apelin-13或同时转染SUMO2干扰链、AQP4干扰链、AQP4点突变质粒及SENP7慢病毒质粒处理H9C2大鼠心肌细胞,饱和甲硝唑等密度差速离心法提取自噬小体,Western Blot检测分别检测自噬小体或细胞总蛋白中 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12、GM130、TGN46蛋白水平。转染SUMO2干扰链、AQP4点突变质粒以及SENP7慢病毒质粒,并同时加入Apelin-13孵育H9C2大鼠心肌细胞,免疫沉淀实验检测GOLPH3与ATG5或ATG12结合情况。Apelin-13处理H9C2大鼠心肌细胞,绿色或红色荧光分别标记早期内体标志蛋白EEA1、晚期内体标志蛋白LAMP2A、循环内体标志蛋白RAB11,自噬囊泡形成标志蛋白ATG5、ATG8以及ATG12,成熟自噬小体标志蛋白STX17,同时红色或绿色荧光标记GOLPH3,免疫荧光观察高尔基体在内体循环中的共定位情况。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测VPS35与高尔基体膜囊标志物Giantin、GM130或TGN46相互作用情况。进一步免疫荧光观察VPS35与Giantin胞内共定位情况。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测LAMP2A与高尔基体膜囊标志物Giantin、GM130或TGN46相互作用情况。进一步免疫荧光观察LAMP2A与Giantin胞内共定位情况。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性上调自噬相关蛋白ATG5、ATG12蛋白水平,但不影响ATG8;F13A、3-MA或GA均抑制Apelin-13促ATG5 及 ATG12 蛋白上调;Apelin-13 上调 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12蛋白水平,下调GM130及TGN46蛋白水平,敲除SUMO2、AQP4点突变、SENP7过表达均抑制Apelin-13的作用;Apelin-13上调自噬小体内 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12、GM130 及TGN46蛋白水平,敲除SUMO2、AQP4点突变、SENP7过表达均抑制Apelin-13的作用;免疫共沉淀实验发现Apelin-13促GOLPH3与ATG5及 ATG12 结合,而si-SUMO2、AQP4K311R和SENP7 过表达抑制 Apelin-13作用;免疫荧光显示,GOLPH3分别与EEA1、LAMP2A、RAB11、ATG5、ATG12、STX17共定位,但与ATG8无明显定位关系;Apelin-13或GOLPH3过表达促进VPS35与高尔基体膜囊标志物GM130、TGN46及Giantin相互作用;Apelin-13或GOLPH3过表达促进VPS35与Giantin共定位;Apelin-13或GOLPH3过表达促进LAMP2A与高尔基体膜囊标志物 GM130、TGN46 及 Giantin 相互作用;Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促进LAMP2A与Giantin共定位。小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调H9C2大鼠心肌细胞ATG5、ATG12蛋白水平;（2）Apelin-13/APJ系统通过ATG5-ATG12复合物促进高尔基体与自噬囊泡融合;（3）Apelin-13/APJ系统通过VPS35促高尔基体-自噬囊泡进入内体循环,形成成熟自噬小体;（4）Apelin-13/APJ系统通过LAMP2A促进高尔基体进入溶酶体发生降解。第六部分GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大目的:明确Apelin-13/APJ系统能否通过抑制SENP7去类泛素化修饰促进心肌细胞肥大,探究SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4在心肌肥大过程中的具体作用,阐明GOLPH3介导高尔基体自噬促进心肌细胞肥大发生发展的具体机制。方法:Apelin-13以不同浓度梯度、不同时间梯度、F13A、3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。GOLPH3过表达或3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。AQP4干扰链转染H9C2大鼠心肌细胞或同时孵育Apelin-13或GOLPH3过表达,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。银杏酸、Apelin-13、雷帕霉素、AQP4点突变、SUMO2干扰链、AQP4干扰链或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。转染SENP7慢病毒质粒pLenti-SENP7,或同时Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞ANP、BNP及β-MHC蛋白水平;F13A或3-MA抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞ANP、BNP及β-MHC蛋白水平上调;Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞体积增大,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;Apelin-13促H92大鼠心肌细胞直径增长,体积变大,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;GOLPH3过表达上调ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,促进H9C2大鼠心肌细胞体积增大、直径增长,3-MA抑制GOLPH3过表达作用;AQP4 敲除抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 ANP、BNP 和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调;SUMO2敲除抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;AQP4点突变抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长。小结:（1）GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大;（2）SENP7去类泛素化修饰介导SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促进H9C2大鼠心肌细胞肥大。第七部分GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展目的:明确高尔基体自噬在Ang Ⅱ诱导心肌肥厚中的具体作用,阐明GOLPH3介导高尔基体自噬能否促进心肌肥厚发生发展。方法:26只,6周龄,雄性,体重均200g的Sprague Dawley大鼠（实验过程死亡1只）分为3组:PBS组、Ang Ⅱ组及Ang Ⅱ+AAV9-shGolph3组。构建大鼠心脏靶向特异性GOLPH3敲除腺相关病毒AAV9-shGolph3。尾静脉分别注射等体积PBS溶液或AAV9-shGolph3溶液,待注射14天腺相关病毒达表达高峰后,大鼠皮下植入搭载PBS或预配置Ang Ⅱ溶液的ALZET微渗透泵,植入第42天后取出ALZET微渗透泵,计算大鼠体重及ALZET微渗透泵重量,缝合伤口。待第60天时,处死取材。在饲养大鼠的60天内,每组每只大鼠每5天进行一次体重测量并记录。心脏灌注PBS及多聚甲醛,取材后测量心脏重量、大鼠体重以及胫骨长度。心脏进行组织切片及HE染色,观察心脏心腔扩张、心壁厚度,心肌细胞形态结构、排列顺序及体积变化。免疫组化检测心脏组织切片中LC3、GOLPH3、SUMO2、AQP4及SENP7阳性表达情况。提取心脏组织蛋白,Western Blot检测心脏组织中LC3、p62、GOLPH3、AQP4、SUMO2、SENP7、GM130、TGN46、TFE3、SPCA1、ANP、BNP和β-MHC蛋白水平。结论:1.Apelin-13/APJ系统通过GOLPH3诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;2.Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4蛋白水平,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,加剧GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展;3.Apelin-13/APJ系统促SUMO2靶向高尔基体富集,通过第311位赖氨酸基团类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展;4.Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,参与GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;5.Apelin-13/APJ系统通过ATG5-ATG12复合物促进高尔基体与自噬囊泡融合,通过VPS35促进高尔基体-自噬囊泡延伸,形成成熟自噬小体,通过LAMP2A促进高尔基体进入溶酶体发生降解;6.SENP7去类泛素化修饰介导SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促进H9C2大鼠心肌细胞肥大;7.GOLPH3介导高尔基体自噬参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;8.SENP7/SUMO2/AQP4信号通路调控GOLPH3介导高尔基体自噬参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚。结果:PBS、Ang Ⅱ及Ang Ⅱ+GOLPH3敲除组大鼠体重均随饲养天数呈递增趋势,但组间大鼠体重无明显差异;Ang Ⅱ促进大鼠心脏体重比、心脏胫骨比增加,GOLPH3敲除抑制Ang Ⅱ作用;Ang Ⅱ促进大鼠心脏心腔变小、心壁增厚、心肌细胞明显膨胀肥大,GOLPH3敲除抑制AngⅡ 的作用;AngⅡ 促进LC3、GOLPH3、SUMO2、AQP4 阳性表达,SENP7则明显下调,GOLPH3敲除结果则相反;Ang Ⅱ上调大鼠心脏组织 LC3、SUMO2、AQP4、TFE3、SPCA1、GOLPH3、GM130、TGN46、ANP、BNP和β-MHC蛋白水平,下调p62及SENP7,GOLPH3敲除结果则相反。小结:（1）Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚破坏心肌细胞高尔基体形态结构;（2）GOLPH3参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;（3）GOLPH3介导高尔基体自噬可能参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;（4）SENP7/SUMO2/AQP4信号通路参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚。
阎禹廷[4]（2021）在《第一部分 通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 第二部分 中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常：KMT2D及MYD88突变》文中指出[目的]套细胞淋巴瘤（MCL）是侵袭性非霍奇金淋巴瘤（NHL）的一种罕见亚型,决定其临床预后的遗传学因素尚不明确。目前尚没有MCL的基因组学和转录组学的整合研究,缺乏对疾病的整体认识。且MCL在临床及遗传学存在高度异质性,患者对治疗的反应及预后也相差很大,基于遗传学特点对其区分亚型有助于临床危险度分层并指导精准治疗。[方法]该研究对134例MCL患者的152个DNA样本进行了全外显子测序（WES）,其中包括123例初治和11例复发的患者,以及16例有初诊和复发续贯样本的患者。其中95例患者接受了标准的基于大剂量阿糖胞苷的免疫化疗,48个样本具有匹配的RNA测序数据。研究者们使用GATK,MutSig2CV和GISTIC2.0识别体细胞突变和拷贝数变化,应用MutationalPatterns定义突变特征,并利用ABSOLUTE和PhylogicNDT确定患者的克隆进化的模式;并应用NNMF非负矩阵分解聚类法定义MCL的不同分子亚组,进一步探索不同亚组患者的基因表达谱和临床预后。[结果]每个样本体细胞突变的中位数为29（范围8-72）。该研究共鉴定出34个重现性突变基因,其中包含报道过的驱动突变（TP53,ATM,CCND1,KMT2D,NSD2,SMARCA4,ARID1A,NOTCH1,NOTCH2,BIRC3,TRAF2,UBR5）和新发现的突变（SP140,SVEP1,LRP1B,LRP2,PCDH10）。并检测到7个区域的染色体拷贝数增加和13个区域染色体缺失（频率>10%,q<0.1）。基于无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）的多因素COX模型分析显示,IGHV突变状态,MIPI风险分层,TP53突变/del（17p13）,SP140 突变/del（2q36）以及 NOTCH1、SMARCA4、PCDH10 突变和 del（9p）,均具有显着的独立预后意义。研究进一步探究了 MCL遗传事件的克隆状态和克隆演变模式。Del（11q22）和de1（9p）倾向于表现为主克隆,可能是疾病发生的早期事件,而NSD2、LRP1B和CTNNA2中的突变更可能是亚克隆（q<0.05）。通过对复发前后遗传学异常的动态变化将MCL患者分为三类:69%（11/16）的患者具有显着的克隆演变（CCF变化>0.5）;25%患者具有轻度的克隆演变（0.2≤CCF变化≤0.5）;6%患者无克隆演变（CCF变化<0.2）。具有显着克隆演变的患者与轻度或无克隆演变患者相比,生存时间明显减少（总生存时间为47.5个月vs.未达到,P=0.041;复发后生存时间为17.1个月vs.未达到,P=0.023）。通过对上述重现性体细胞突变和拷贝数变化进行整合分析,将MCL分为四个分子亚型（Cluster,C）,每个亚型具有不同的基因表达谱和临床特征。C1和C2-4分别与MCL的惰性和侵袭性临床特征相关;且两种类型MCL的细胞起源不同,C1和C2-4分别具有丰富的记忆B细胞和CCR6阴性生发中心明区B细胞的基因表达特征。其中C1亚型临床上大多表现为白血病样非结性惰性MCL,具有IGHV突变、SOX11阴性、CCND1突变、amp（11q13）的特征,转录组数据显示此群患者BCR信号通路明显激活。C2亚型以del（11q22）、del（1p21）、ATM突变为主要特征,并且伴有NF-κ B和DNA修复信号通路的上调。C3亚型多表现为SP140、NOTCH1和NSD2突变,并伴有明显的NF-κB和BCR信号通路下调。C4亚型的母细胞型或多形性MCL发生率最高（23.7%,P=0.016）,常伴有 del（17p）、del（13q）、del（9p）以及 TP53 和 TRAF2突变;该亚型还表现为的MYC信号通路的激活及增殖相关基因的过表达。重要的是,这四个分子亚型的患者表现出明显的预后差异,中位PFS在C1亚型中尚未达到,C2亚型为41.2个月,C3亚型为30.7个月,C4亚型为16.1个月（P<0.001）。[结论]该研究首次对MCL的基因组学和转录组学进行整合分析,揭示了 MCL遗传特征图谱,并对MCL患者根据遗传学特征进行分子分型,不同亚型患者表现出特征性基因表达谱和临床预后。该研究揭示了与临床预后相关的遗传学特征,并将指导后续MCL治疗策略的开发。[目的]慢性淋巴细胞白血病（CLL）在欧美白种人中发病率较高,占成人白血病的20-30%,但在中国发病率仅为3-5%,且中国CLL患者还具有起病年龄较早,疾病侵袭性偏高,IGHV突变率较高及使用BCR典型模式偏好性不同等特征。我们推测可能是特征性遗传学改变导致的疾病表型差异。[方法]为了定义中国CLL患者的突变谱,我们通过深度靶向测序（Illumina MiSeq平台）检测了 126例CLL患者（包含中1 17例初诊CLL和9例复发CLL）中的91个CLL驱动基因的突变情况。随后我们把212例CLL患者样本（188例初诊患者和24例复发患者）组成一个验证队列,进一步验证了9个重现性基因突变。通过荧光原位杂交（FISH）和Sanger测序分别分析所有患者的细胞遗传学异常和IGHV突变状态。免疫荧光比较有无KMT2D突变的细胞的H3K4me3荧光强度,药敏试验检验KMT2D突变对伊布替尼和地西他滨的敏感性的影响,并探究两者是否有协同作用。[结果]除了 TP53（17.5%）,SF3B1（14.3%）,ATM（13.7%）,NOTCH1（8.7%）,FBXW7（8.7%）这些已知驱动基因突变以外,中国CLL患者的KMT2D（12.7%）和MYD88（10.3%）突变频率明显高于西方国家（P<0.01）。38个MYD88突变均在未接受过治疗的CLL患者中检测出,其中17个突变（45%）位于L265P热点位置,第二常见的热点区域为V217F（29%）,其次为S219C（13%）。我们发现,有MYD88突变的患者中,男性明显占优势（P=0.002）,且多为IGHV突变型（P<0.001）。此外,我们还发现,多数伴有单克隆丙种球蛋白病（3 IgG,2 IgM,P=0.008）,或伴有乙肝病毒感染（P=0.029）的CLL患者更容易发生MYD88突变。MYD88突变的患者显示出比野生型患者明显更久的首次治疗时间（TTT 5.5 vs.2.9 年,P=0.027）。70%的KMT2D突变是无义,剪接位点或移码插入突变,这些功能丧失性突变会产生C端截短的蛋白质。与IGHV突变状态的整合分析发现,具有KMT2D突变的CLL患者偏好性使用VH4-34和VH4-39（P=0.001,P=0.034）,并且富含子集#8（4/12[33.3%],P=0.012）,这是中国CLL相较于西方CLL的特性性BCR典型子集。与KMT2D野生型相比,KMT2D突变的CLL的预后较差（TTT分别为2.3年和3.7年,对P=0.079）。多变量Cox回归模型纳入IGHV状态,Del（17p）/TP53突变,Rai/Binet期,β 2-微球蛋白后,KMT2D突变仍为早期治疗的独立危险因素（P=0.025）。KMT2D是一种组蛋白赖氨酸特异性甲基转移酶,因此我们通过药敏试验探究9例伴有KMT2D截短突变和6例无KMT2D突变的患者的原代CLL细胞对BTK抑制剂伊布替尼±染色质修饰抑制剂地西他滨或西达本胺的敏感性。KMT2D突变的CLL细胞对伊布替尼的敏感性降低,对地西他滨的敏感性更高,而对西达本胺的敏感性与野生型CLL细胞相似。同时,我们发现伊布替尼和地西他滨有明显的协同细胞毒性,免疫荧光实验证实,KMT2D突变的CLL细胞对染色质修饰抑制剂的敏感可能是由于细胞内H3K4me3的减少所致。[结论]我们观察到中国CLL相较于西方CLL,患者的MYD88和KMT2D突变发生率较高。KMT2D突变的CLL在体外细胞实验中,表现出H3K4甲基化活性降低,且对地西他滨更敏感。伊布替尼联用地西他滨对KMT2D突变的CLL细胞有协同治疗作用。本研究结果首次尝试从分子遗传学角度解释中西方CLL临床特征和表型差异,提出中西方人群之间CLL的发病机制可能存在差异,并为个体化治疗提供理论基础。
王建花[5]（2021）在《恶性疟原虫红内期发育过程中的蛋白质翻译后修饰研究》文中指出疟疾是对人类危害最严重的疾病之一。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是致病力最强的疟原虫,其在人体红细胞内48 h的发育期是致病的主要时期。尽管基于青蒿素的治疗法是目前最有效的抗疟手段,然而抗青蒿素虫株的出现及世界性扩散使疟疾疫苗及新型抗疟药的研制迫在眉睫,但在疟原虫的生物学及致病机理还有待深入揭示。蛋白质翻译后修饰（Protein post-translational modifications,PTMs）是调节蛋白质功能的重要环节,参与蛋白质修饰和解除修饰的分子是研制生物药物的重要靶点。目前,针对恶性疟原虫翻译后修饰的研究已有不少,如恶性疟原虫组蛋白乙酰化、甲基化、棕榈酰化、磷酸化、小泛素（SUMO）化,非组蛋白磷酸化、乙酰化、泛素化等。这些研究在一定程度上解释了虫体发育和致病的调控机制,但目前的研究多针对虫体发育过程中的某个时间点的蛋白质翻译后修饰,没有解决虫体在整个发育过程的整体调控机制及各种修饰之间的动态变化与虫体发育繁殖的关系。此外,有关宿主红细胞蛋白质的翻译后修饰在虫体-宿主相互作用的意义还缺乏研究。本研究使用十种翻译后修饰泛抗体（酪氨酸磷酸化,赖氨酸乙酰化、巴豆酰化、2-羟基异丁酰化、泛素化、三甲基化、丙酰化、丙二酰化、戊二酰化、琥珀酰化）对恶性疟原虫红内期发育过程中的动态修饰水平进行了Western blotting鉴定;并采用TMT（Tandem mass tag）标记的方式对虫体发育过程的六个时间点（8,16,24,32,40,48 h）的染虫红细胞及健康红细胞样品进行了质谱鉴定,针对恶性疟原虫及其宿主红细胞六种翻译后修饰（磷酸化、乙酰化、巴豆酰化、2-羟基异丁酰化、泛素化、N-糖基化）的动态丰度变化进行了系统研究,从各修饰的功能、时空分布及相关性,疟原虫红内期发育繁殖调控,疟原虫基因表达调控及致病相关因子的调控四个方面进行生物信息学分析;全面分析了糖酵解、磷酸戊糖途径、嘌呤补救合成三个关键代谢通路相关调控酶的修饰种类和动态变化。本研究绘制了恶性疟原虫红内期虫体及宿主红细胞蛋白质的六种翻译后修饰的动态图谱,从修饰的角度揭示了恶性疟原虫在红内期的发育变化规律。其中,巴豆酰化、2-羟基异丁酰化、N-糖基化三种修饰的研究结果及恶性疟原虫对宿主红细胞蛋白质的动态修饰研究是在疟原虫相关研究方面最新的研究结果。研究发现,翻译后修饰广泛参与了基因表达、裂殖子对红细胞的入侵、红细胞重塑、免疫逃避、营养代谢等重要生物学过程。相比健康红细胞,染虫红细胞蛋白质的磷酸化和泛素化发生了明显变化,且在虫体刚入侵红细胞时这两种修饰最为明显。红细胞的N-糖基化在恶性疟原虫释放和入侵阶段的丰度发生了极其显着的变化,并且非唾液酸依赖的红细胞受体（如CR1,Basigin等）很多被糖基化修饰。本研究绘制了最全面的恶性疟原虫组蛋白及其变体的修饰图谱,并将以前研究中鉴定到的修饰位点进行了标注,为“组蛋白密码”的解析和组蛋白介导的基因表达调控研究奠定了重要基础。此外,我们筛选了调控基因转录与表达相关的蛋白质,针对已知的蛋白质互作关系及修饰位点的丰度变化水平绘制了相互作用网络图。研究发现,在基因表达过程中,含有组蛋白的核小体的结构变化与乙酰化关系最为密切,转录过程以及翻译起始主要被磷酸化调控,而翻译延伸和核糖体加工被多种修饰共同调控。恶性疟原虫代谢通路调控酶的修饰分析表明,糖酵解途径中的限速酶丙酮酸激酶（PK）在滋养体早期被乙酰化和2-羟基异丁酰化修饰。在红内期发育晚期这两种蛋白质被巴豆酰化、2-羟基异丁酰化和磷酸化修饰共同调控;嘌呤挽救途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）发生了2-羟基异丁酰化修饰,乙酰化和巴豆酰化修饰;人体6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD,磷酸戊糖途径关键酶）发生了磷酸化和2-羟基异丁酰化修饰。本研究完成了恶性疟原虫及及所寄生的红细胞蛋白质最为全面的动态表观遗传学分析,从翻译后修饰的角度解析了红内期恶性疟原虫的发育和致病机理,为揭示疟原虫生物学特征和新型抗疟药的研发奠定重要基础。
张颖一[6]（2020）在《胃癌中差异表达mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定分析及核心circRNA circFOXO3的功能与作用》文中指出目的:胃癌（gastric cancer）是一种常见的恶性肿瘤,因起病隐匿,预后较差,严重威胁人类健康。因此,早期诊断极为重要,但临床尚缺乏该病特异性的生物标记。现有的大量研究显示非编码RNA（ncRNA）在人类癌症的发生和发展中起着至关重要的作用,其中lncRNA和circRNA与m RNA通过形成复杂的竞争性内源性RNA（ce RNA）调控网络参与疾病进程。值得注意的是,目前在胃癌中仍然缺乏对lncRNA、m RNA和circRNA的系统鉴定,并且它们在胃癌中构成的复杂调控网络尚未揭示。因此,本课题旨在探索胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,揭露其转录物之间的复杂相互作用,试图为后续胃癌的临床诊断提供理论依据。circRNA由于序列及结构不同于其他ncRNA,从而表现出特有的生物学活性,在许多肿瘤的发生发展中起到关键作用。circ FOXO3是circRNA家族核心成员,已有文献报道显示circ FOXO3通过发挥原癌基因的作用参与了前列腺和脑胶质瘤的发生发展,而其在胃癌中的功能未见报道。本课题拟探究circ FOXO3对于胃癌细胞增殖、周期、转移、侵袭和成瘤的影响以及是否参与胃癌的免疫应答和代谢进程,分析下游靶基因与预后的关系,探索胃癌全新的生物靶标。方法:本课题选用微阵列分析筛选了胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,在11个配对胃癌样本中用q RT-PCR验证了随机选择的6个上调基因的表达,并用STRING系统构建了差异表达的m RNA介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络、lncRNA介导的顺式调节网络以及circRNA介导的ce RNA网络。另外,使用公共数据库Kaplan-Meier Plotter评估差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA,判断其在胃癌中的预后价值。之后采用CCK-8、流式细胞仪、transwell等实验方法检测circFOXO3敲低之后胃癌细胞的增殖,转移和侵袭的变化,并观察其对动物体内成瘤的影响。最后,使用RNA-sequencing技术检测敲低circ FOXO3之后的胃癌细胞中m RNA的表达变化差异,在STRING系统分别构建敲低circ FOXO3后上下调的基因介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络,利用GEPIA数据库探究20个circ FOXO3下游核心基因在胃癌中的表达情况,并使用公共数据库Kaplan-Meier Plotter评估circ FOXO3核心下游基因在胃癌中的预后价值。结果:本课题发现922个m RNA、2112个lncRNA和2896个circRNA在胃癌组织中差异表达,并观察到lncRNA lnc-GLI3-4:1、LMF1、OLFM4、HKDCC1、hsa＿circ＿0058819、hsa＿circ＿0058830在胃癌中的表达相较癌旁组织显着升高。生信分析显示胃癌中差异表达的m RNAs参与调控丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;醛固酮调节钠的重吸收;氨基糖和核苷酸糖代谢;柠檬酸盐循环（TCA循环）;BMP绑定;醛脱氢酶（NAD）活性;胺结合;支链氨基酸分解代谢过程;静脉血管发育。本课题总共鉴定出230个lncRNA-m RNA调节对,KEGG信号通路预测结果显示这些lncRNA参与调控的信号通路包括:粘附连接、醛固酮调节钠的重吸收、轴突指导、B细胞受体信号通路、ARF蛋白信号转导、G蛋白偶联谷氨酸受体结合及L-α-氨基酸跨膜转运。所构建circRNA介导的ce RNA网络共包括34个上调的circRNA,33个下调的circRNA,170个上调的m RNA,153个下调的m RNA和42个mi RNA,生物信息学分析表明这些差异表达的基因与调节支链氨基酸分解代谢过程,糖酵解/糖异生和ARF蛋白信号转导显着相关。通过对已知数据库的分析,Kaplan-Meier生存曲线显示,胃癌患者m RNA中高表达的GPER、COL8A1、GLT25D1、EPOR、ENG、SLC5A5、OMP、NDE1和REM1与较短的总生存时间显着相关;lncRNA中则是高表达的NR＿073084、ENST00000565689、LOXL1-AS1、NR＿110232、ENST00000472494（HOTTIP）和ENST00000469148（PTPRG-AS1）与较短的总生存时间显着相关,其均具有评估预后的价值。本课题发现circ FOXO3在胃癌组织中表达水平显着高于癌旁组织,敲低其能够显着抑制AGS以及N87细胞的增殖、转移和侵袭能力,阻滞细胞周期的进程,并显着抑制动物体内瘤体的增长,故其可能在胃癌中发挥着原癌基因的效应。利用RNA-sequencing技术检测敲低circ FOXO3前后胃癌细胞中m RNA的表达变化,总共得到5104个差异基因。其中2378个基因的表达水平在敲低后显着上调,2726个基因的表达水平在敲低后显着下调。生物信息学预测显示circ FOXO3敲低后上调表达的基因主要富集在防御反应、固有免疫应答、免疫反应、病毒防御反应、免疫效应过程中。circ FOXO3敲低后下调表达基因广泛参与到代谢、翻译、有机物生物合成、生物合成、细胞周期等生物进程。本课题所构建的敲低circ FOXO3后上下调基因介导的蛋白质-蛋白质相互作用网络揭露了三个上调表达/三个下调表达的核心PPI网络,其内20个circ FOXO3下游核心基因中,CDK1、MYC、BRCA1、MCM3、RFC4、MX1、ISG15、OAS1、STAT1、DDX58、IFI35、RSAD2、B2M、DDX60、IFI27在胃癌中显着高表达。有趣的是,高表达的BRCA1、IFI35、MCM3、DDX60与胃癌患者较长的总体生存时间呈现明显相关性,而高表达的MX1、ISG15、DDX58、IFI27、RPS28、RPS20则与较短总生存显着相关。结论:本课题对胃癌中差异表达的m RNA、lncRNA和circRNA进行了综合分析,首次构建了复杂的调控网络以揭示这些RNA之间的相互作用,发现某些核心m RNA和lncRNA的失调与胃癌患者的总生存时间有关,为深入理解胃癌进展的机制以及探索胃癌的潜在治疗和预后靶标提供了有用的信息。通过对调控网络中处于核心地位的环状RNA circ FOXO3的进一步研究,证明了其在胃癌组织中显着高表达,而敲低circ FOXO3则能够显着降低胃癌细胞的增殖、周期、转移、侵袭进程和体内成瘤能力,且得知其可能参与肿瘤的免疫应答和代谢进程相关的信号通路调控,并发现数个circ FOXO3核心下游基因在胃癌中显着高表达且与患者的生存时间显着关联。首次,我们阐明了circ FOXO3在胃癌中的原癌效应,为寻找胃癌全新的生物靶标提供了思路。
具晟[7]（2020）在《肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷化疗细胞株的建立及其耐药机制的研究》文中研究表明研究背景与目的:肺神经内分泌肿瘤（Lung neuroendocrine tumor）来源于肺神经内分泌细胞,由大细胞神经内分泌癌、小细胞肺癌、肺神经内分泌类癌和不典型类癌组成。肺神经内分泌细胞的比例占肺内细胞比例的1/2500,因此,肺神经内分泌肿瘤的发生比例相对较低,总计约占全部肺癌的10%左右。其生物学行为与来自腺上皮的肺腺癌和来自于鳞状上皮化生的肺鳞癌有巨大的差异,它们极易在早期发生全身广泛转不移。即使被归入不同的肺癌类型,但其治疗均以包括依托泊苷在内的拓补异构酶抑制剂为重要化疗方案。虽然依托泊苷治疗效果较好,但其效果存在瓶颈,即早期发生耐药。本研究的目的,即寻找有效的抑制肺神经内分泌肿瘤耐药的靶点。通过建立耐依托泊苷的肺大细胞神经内分泌癌细胞株和耐依托泊苷的肺小细胞神经内分泌癌细胞株,通过对耐依托泊苷的肺小细胞神经内分泌癌细胞株的二代测序,并在肺大细胞神经内分泌癌细胞株中进行验证。寻找能够导致肺神经内分泌肿瘤耐药的关键分子,以及对于此分子进行调控的关键信号通路。从而为肺神经内分泌的治疗提供新的靶点。研究方法:第一部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定（1）选择肺小细胞神经内分泌癌H446细胞株和肺大细胞神经内分泌癌H1155,通过药物梯度培养法逐步筛选和建立耐依托泊苷细胞系H446R和部分耐依托泊苷细胞株H1155r。（2）观察H446、H446R、H1155、H1155r细胞株的细胞形态和生长趋势,进行细胞增殖试验,分别绘制增殖曲线。（3）使用CCK-8试剂盒检测依托泊苷对H446、H446R、H1155和H1155r的抑制情况,并使用Graphpad prism 7.0绘制抑制曲线,计算其半数抑制浓度（IC50）,鉴定其耐药情况。第二部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析（1）使用特别的细胞分组进行测序,将分组设定为H446、H446R、H446R+VP16三组,再分别进行测序。（2）分析样品碱基位置质量分数分布。（3）基因组分布情况评估。（4）分析其可变剪切分布情况。（5）对样本进行主成分分析及聚类分析,判断标本的同源性。（6）在三个差异基因集中取同向表达基因,排除无效基因的干扰。（7）通过限定基因变化幅度的条件。在有效基因中筛选可能的潜在靶点基因。（8）通过差异基因的PPI网络及HUB基因分析,进一步缩小差异基因的选择范围。（9）通过差异基因的GO及KEGG分析,分析差异表达的潜在靶点基因的可能生物学过程和信号通路。将基因缩小范围至30个左右。第三部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析（1）通过qRT-PCR在备选基因中验证其与二代测序的符合程度,进一步排除不符合基因。（2）使用 si-S100A9、si-ITGB3、si-COL6A2、si-CCL5、si-SH2D2A等干扰基因 ITGB3、SH2D2A、S100A9、CCL5、COL6A2 的 mRNA 表达,并使用CCK-8法对干扰后的细胞系进行细胞耐药曲线的绘制和IC50的计算。（3）使用Western blot对（2）中耐药影响明显的两个基因ITGB3和S100A9进行蛋白表达的验证。（4）在H446细胞株和H1155细胞株中使用慢病毒转染过表达S100A9,qRT-PCR验证S100A9的mRNA表达的变化,Western blot验证其蛋白表达的差异。使用CCK-8对过表达细胞株进行药敏试验,观察其对依托泊苷耐药程度的变化。（5）si-ITGB3干扰H446R和H1155r的ITGB3的表达,qRT-PCR验证ITGB3表达下降对S100A9的mRNA表达量的影响。Western blot验证S100A9蛋白表达的变化。（6）在H446R、H1155r中敲低ITGB3,Western blot验证其对ECM-ITG-PI3K-Akt信号通路的影响最终导致了 S100A9的变化。研究结果:第一部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定（1）从H446细胞株建立了稳定耐依托泊苷的耐药细胞株H446R,IC50约在325.4mg/L,RI>5。（2）从H1155细胞株建立了部分稳定的耐依托泊苷的耐药细胞株H1155r,IC50约在682.8mg/L,3<RI<5。（3）细胞增殖试验绘制增殖曲线,发现H446R、H1155r细胞株的增殖速度均低于H446和H1155原始细胞株,提示耐药细胞的耐药机制是抗凋亡,而不是增殖增强。第二部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析（1）二代测序的测序质量评估提示三组细胞株样品碱基位置质量分数分布可重复性强。每一组内的基因内分布情况和可变剪切分布情况变化不大。测序reads之间在所有表达转录本上呈均一性分布。（2）主成分分析提示样本间的聚类关系区分较好,聚类分析提示组内和组间的同源性与实验设计相符合。（3）对共同差异基因的交集将差异基因减少到了 330个。（4）通过限定基因变化水平,将备选基因范围进一步缩小到了 89个上调基因和31个下调基因中。（5）使用PPI网络和Cytoscape软件中的CytoHubba APP,将基因范围进一步缩小到了 30个备选基因。（6）通过GO及KEGG分析,发现PI3K-Akt信号通路被强化。上述对测序结果的分析缩小了备选基因的范围。第三部分:肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析（1）通过 mRNA 表达的验证,确认 CD68、IL32、CCL5、ITGB3、COL6A2、S100A9、SH2D2A、COL6A1等基因与二代测序结果高度一致。（2）在H446R和H1155r 细胞株中使用 si-S100A9、si-ITGB3、si-COL6A2、si-CCL5、si-SH2D2A 分别敲低相关基因后,si-S100A9、si-ITGB3在H446R和H1155r中均引起了耐药能力的下降。（3）在H446、H1155细胞株中过表达S100A9后,两细胞株对于依托泊苷的耐药程度部分增强了。（4）在H446R和H1155r中敲低ITGB3后,S100A9的表达下降。（5）依托泊苷可以刺激ITGB3表达的上调,通过ECM-ITG-PI3K-Akt信号通路引起S100A9的表达上调。此现象在H446R细胞株中更为明显。研究结论S100A9是耐依托泊苷的肺神经内分泌肿瘤耐药的关键基因,其表达的上调可以使肺神经内分泌肿瘤对依托泊苷的耐受性增加。同时,我们发现ITGB3的表达也和肺神经内分泌肿瘤的耐依托泊苷能力相关。ITGB3表达的改变影响了S100A9的表达。进一步发现,在依托泊苷作用下,ITGB3的表达量增加,其下游的Akt磷酸化水平增加,S100A9的表达也随之增加。因此我们得出结论,在耐依托泊苷的肺神经内分泌肿瘤中,ITGB3的表达上调,ECM-ITG-PI3K-Akt信号通路的活性增强,继而上调了 S100A9的表达引起了耐药。这为肺神经内分泌肿瘤的治疗提供了新的靶点。
侯春英,卢多[8]（2020）在《氧气对基因组的结构与化学影响》文中认为氧气是生命活动的必要元素,主要在线粒体参与能量代谢过程。对于包裹在细胞核里的基因组,氧气可以通过许多渠道对其结构和化学性质进行调控,其中活性氧是一类重要的信使分子,对基因组进行种类繁多的修饰,而铁离子提供了多方面的辅助作用。它们的共同作用影响到基因组复制、转录和损伤修复等几乎所有的生化功能。在此基础上,环境氧浓度的变化,特别是多种主要疾病和重要生理过程相关的低氧环境,可以引起基因组层面的响应。鉴于引起这一系列基因组上变化的因子有可能成为药物靶标,值得系统深入地研究。在此,作者汇总了活性氧、铁离子和细胞低氧对基因组的影响,并简单讨论相关的药物分子。
康新乐[9]（2020）在《蜕皮激素通过G蛋白偶联受体调控昆虫变态发育和易化扩散进入细胞的研究》文中进行了进一步梳理研究背景、存在的科学问题及研究意义昆虫的生长发育由多种激素共同调控,包括20-羟基蜕皮酮（20E）、保幼激素（JH）和胰岛素,20E与JH和胰岛素相互作用调控昆虫生长发育和蜕皮变态。昆虫变态期间体内发生着剧烈的变化,如幼虫中肠的凋亡、成虫中肠的形成、脂肪体的解体和重构、成虫盘的生长和脑结构的重塑等,20E在其中起着非常重要的作用。通常,蜕皮激素通过结合蜕皮激素的核受体（EcR）来发挥作用,起始20E早晚期基因的表达,启动变态程序,即20E基因组信号途径。近年来,越来越多的研究证明在经典的20E基因组信号途径之外,存在20E非基因组途径,即20E通过激活细胞膜上的受体引发胞内钙离子和cAMP水平的快速变化,进而引起一系列蛋白质的翻译后修饰,调控基因转录和变态发育。G蛋白偶联受体（GPCR）是一类七次跨膜的蛋白家族,在传递各种信号中起到重要的作用,是各种药物的作用靶标。研究发现GPCR作为固醇类激素的受体,在20E调控昆虫的变态发育中发挥作用。果蝇多巴胺蜕皮激素受体DmDopEcR可以结合20E类似物,被认为是20E的膜受体,但DopEcR在20E信号途径中的功能并不清楚,并且棉铃虫中还报道了另外两个传递20E信号的GPCR,但没有检测到它们结合20E。前期研究还发现20E进入细胞的量是受到控制的,但机制和生物学效应并不清楚。这些研究打破了 20E是通过自由扩散进入细胞与核受体结合启动相关基因转录的经典理论,其尚待阐明的科学问题对于确立类固醇激素的细胞膜受体及其信号途径的新理论具有重要的支撑意义。本论文用重大农业害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）为模型,研究DopEcR在20E信号途径中的功能并证明GPCR可以结合20E,GPCR控制20E进入细胞的机制和生物学效应,丰富和完善20E非基因组信号途径及调控昆虫变态发育的分子机制。研究结果完全变态昆虫在末龄幼虫的最后阶段停止取食,然后发生变态。但是,幼虫停止取食的机制尚不清楚。使用农业害虫棉铃虫作为模型,揭示了 20E与多巴胺受体（DopEcR）（一种G蛋白偶联受体）结合,以停止幼虫取食并促进化蛹。DopEcR在各种组织中均有表达,并在20E调节下的蜕皮变态过程中表达水平升高。幼虫取食阶段的20E滴度较低,而游走阶段的20E滴度较高。相比之下,多巴胺（DA）滴度在幼虫取食阶段较高,而在游走阶段较低。使用多巴胺受体抑制剂flupentixol阻断多巴胺受体或20E注射均可以减少幼虫的食物消耗和体重。敲降DopEcR可以抑制幼虫的取食、生长和化蛹。20E通过DopEcR促进细胞凋亡,DA通过DopEcR诱导细胞增殖。20E通过抑制DA诱导的细胞增殖和AKT的磷酸化来对抗DA功能。20E通过DopEcR诱导基因表达,并使细胞内钙离子和cAMP水平快速增加。20E诱导DopEcR与Gαs和Gαq相互作用。20E通过DopEcR诱导20E信号途径关键蛋白磷酸化和EcRB1-USP1转录复合物与蜕皮激素响应元件EcRE的结合。DopEcR可以在细胞膜或从细胞膜分离后结合20E。DopEcR结合20E位点的突变降低了 20E结合水平和相关的细胞快速反应。研究结果表明20E通过与DA竞争结合DopEcR,抑制幼虫进食并促进化蛹。在棉铃虫中阐明了一种GPCR（命名为GPCR-3）通过触发G蛋白介导的信号级联并形成四聚体促进20E进入细胞传递类固醇激素20E信号。通过虫体RNA干扰从棉铃虫转录组数据库中筛选出GPCR-3参与20E信号途径。虫体干扰GPCR-3导致延迟化蛹或形成嵌合蛹,抑制幼虫中肠和脂肪体的降解,并抑制20E诱导的基因表达。20E诱导GPCR-3与Gαq和Gαs相互作用,并使细胞内钙离子、cAMP和蛋白磷酸化迅速增加。GPCR-3定位于细胞质膜中,20E诱导下被GPCR激酶2（GRK2）磷酸化后内化降解脱敏20E信号,β-arrestin-1和网格蛋白介导GPCR-3的内化。GPCR-3可在细胞膜中和分离后在体外结合20E。20E与GPCR-3的结合诱导GPCR-3的同源二聚体形成同源四聚体,GPCR-3的同源四聚体促进20E进入细胞并传递20E信号。GPCR-3同源四聚体作为20E细胞膜受体并促进20E扩散进入细胞,控制不同组织中20E的滴度,进而调节变态发育中不同组织的发育命运—调亡或增殖生长。结论及科学意义1.本论文研究了 DopEcR在昆虫取食和化蛹中的双重功能,DA通过DopEcR促进幼虫的进食和生长,20E与DA竞争结合DopEcR,并通过DopEcR作为细胞膜受体之一来传递20E信号,从而促进昆虫变态,揭示了类固醇激素与多巴胺系统的互作,阐明了 20E抑制鳞翅目昆虫取食并促进变态发育的分子机制,为类固醇激素信号途径及其与神经系统互作提供了新的理论,为害虫控制提供了新的生长调节剂的研制靶点。2.证明了 ErGPCR-2可以结合20E,支持了前面的研究结论—ErGPCR-2是20E的细胞膜受体。3.证明了 GPCR-3是20E的细胞膜受体,20E结合并诱导GPCR-3形成同源四聚体传导20E信号,并作为转运蛋白易化20E扩散进入细胞。首次发现GPCR可以通过形成同源四聚体促进20E的细胞导入。
苏瑶[10]（2020）在《JMJD8通过AKT信号通路调控肿瘤细胞生物学进程的作用机制》文中提出JMJD8是含有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶家族成员之一,该家族成员可对多个组蛋白或非组蛋白赖氨酸位点进行去甲基化修饰,广泛参与细胞内各种生物学进程。过去的研究表明,JMJD8定位于内质网,可与PKM2作用参与调控细胞代谢和血管生成。尽管JMJD8在相关生物学进程中起着重要的作用,但其具体的分子作用机制还尚未报道。本研究以JMJD8介导的AKT相关信号通路为核心,首次揭示了 JMJD8作为一个负调控因子,参与肿瘤细胞增殖、DNA损伤修复以及侵袭和转移多个生物学过程。第一部分:JMJD8参与调控肿瘤细胞增殖和辐射损伤修复DNA双链断裂损伤被认为是辐射导致的最重要的染色质损伤。在本研究中,我们发现在肿瘤细胞中抑制JMJD8的表达促进细胞增殖,并且通过增强非同源末端连接修复关键蛋白Ku70和Ku80的表达减弱电离辐射或化疗药物依托泊苷诱导的DNA双链断裂损伤水平。进一步研究发现,JMJD8通过AKT/NF-κB/COX-2信号通路介导Ku70/Ku80的表达,调控电离辐射和化疗药物诱导的DNA双链断裂损伤修复。表明JMJD8可能是提高肿瘤放化疗敏感性的药物靶点。第二部分:JMJD8影响肿瘤细胞的侵袭和转移上皮间充质转化（EMT）可以诱导肿瘤细胞发生侵袭和转移,是肿瘤恶性化的标志性事件之一。在本研究中,我们发现抑制JMJD8的表达诱导AKT及下游GSK3β的磷酸化激活,提高β-catenin Ser552/Ser675磷酸化水平,降低β-catenin Thr33/37/Ser41磷酸化水平,进而增强β-catenin在细胞中的累积和入核。β-catenin的表达可以激活下游靶蛋白MMP9,c-Myc的表达,促进上皮间充质转化,并最终导致肿瘤细胞的侵袭和转移。我们的工作发现并阐述了 JMJD8通过AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控肿瘤细胞上皮间充质转化的分子机制,解析了 JMJD8影响肿瘤侵袭和转移的新途径,为肿瘤的治疗提出一个新的思路和潜在的生物活性标记物。第三部分:JMJD8调控AKT翻译后修饰影响肿瘤细胞相关生物学进程组蛋白甲基化修饰相关的酶不仅可以调控组蛋白的甲基化水平,也可以参与非组蛋白的甲基化修饰。在本研究中,我们发现JMJD8通过调控SETDB1介导的AKT甲基化修饰影响AKT的膜定位和激酶活性。在JMJD8敲低细胞中,由SETDB1介导的AKT1 K142的三甲基化修饰可以促进AKT膜转运,进而促进PDK1与甲基化的AKT1的结合并诱导其磷酸化激活。此外,三甲基化修饰的AKT K142可以招募JMJD2B,JMJD2B作为正调控因子,促进AKT介导的β-catenin磷酸化修饰。本研究表明,JMJD8通过调控AKT翻译后修饰影响肿瘤相关生物学进程,指出组蛋白去甲基化酶JMJD8作为一个潜在靶向位点,用于肿瘤治疗的重要意义。上述研究结果揭示了组蛋白去甲基化酶JMJD8在细胞增殖、DNA损伤修复和肿瘤侵袭与转移过程中的重要作用,为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的标记物和药物靶点。
二、Phosphoinositides as ligands of PHD-fingers: implications for chromatin remodeling（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Phosphoinositides as ligands of PHD-fingers: implications for chromatin remodeling（论文提纲范文）
（1）低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 哺乳动物卵母细胞成熟研究进展 |
| 1.1 卵母细胞的发育与成熟过程 |
| 1.2 卵母细胞与外界环境的物质、信息交流途径 |
| 1.3 卵母细胞成熟的分子调控机制 |
| 1.4 影响卵母细胞成熟和发育能力的因素 |
| 2 促进卵母细胞体外成熟和发育能力的措施 |
| 2.1 筛选发育能力较高的卵母细胞 |
| 2.2 增强卵丘细胞-卵母细胞互作 |
| 2.3 优化卵母细胞的培养环境与培养程序 |
| 3 氧分压和ROS对卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 4 牦牛卵母细胞体外成熟研究进展 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 不同氧分压对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试验试剂及其配制 |
| 1.3 试验耗材 |
| 1.4 试验仪器 |
| 1.5 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同氧分压对牦牛卵母细胞成熟率的影响 |
| 2.2 不同氧分压对牦牛卵母细胞ROS水平和GSH含量的影响 |
| 2.3 不同氧分压对牦牛孤雌胚胎发育的影响 |
| 2.4 不同氧分压对牦牛IVF胚胎发育的影响 |
| 2.5 不同氧分压对牦牛IVF囊胚基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞成熟率的影响 |
| 2.2 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞ROS水平的影响 |
| 2.3 不同抗氧化剂对卵母细胞GSH含量的影响 |
| 2.4 不同抗氧化剂对牦牛卵母细胞线粒体分布的影响 |
| 2.5 不同抗氧化剂对牦牛IVF胚胎发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 单细胞测序分析不同氧分压对牦牛卵母细胞转录组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 测序数据质量分析 |
| 2.2 比对分析 |
| 2.3 基因表达分析 |
| 2.4 差异表达基因GO分析 |
| 2.5 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.6 差异表达基因验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 高通量测序分析不同氧分压对牦牛卵丘细胞转录组的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 卵巢来源 |
| 1.2 试剂与耗材 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 测序数据质量分析 |
| 2.2 比对分析 |
| 2.3 转录本组装与新转录本预测 |
| 2.4 基因表达分析 |
| 2.5 差异表达基因GO分析 |
| 2.6 差异表达基因KEGG分析 |
| 2.7 差异表达基因验证 |
| 2.8 不同氧分压对卵母细胞和卵丘细胞转录组影响的对比分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论、创新与不足 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 不同氧分压条件下牦牛卵母细胞DEGs(5% O_2 vs20% O_2) |
| 附表2 不同氧分压条件下牦牛卵丘细胞DEGs(5% O_2 vs20% O_2) |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及传代 |
| 2.2 检测TFL药物对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.3 透射电子显微镜观察HSC-T6的超微结构 |
| 2.4 ELISA检测MMP-2、ColⅠ、ColⅢ的含量变化 |
| 2.5 肝纤维化动物造模分组及含药血清的制备 |
| 2.6 检测含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.7 含药血清干预后蛋白质的收集与提取 |
| 2.8 DDA检测 |
| 2.9 DIA检测 |
| 2.10 主要数据库和数据指标 |
| 2.10.1 NR数据库和UniProt蛋白数据库 |
| 2.10.2 STRING蛋白互作数据库 |
| 2.10.3 GO数据库 |
| 2.10.4 KOG数据库 |
| 2.10.5 KEGG数据库 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TFL药物对HSC-T6生长抑制率的影响 |
| 3.2 TFL药物对HSC-T6超微结构的影响 |
| 3.3 TFL药物对HSC-T6的MMP-2、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 |
| 3.4 肝纤维化动物造模结果 |
| 3.5 不同浓度的含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 3.6 肽段与蛋白的定量质控分析 |
| 3.7 DDA/DIA检测结果 |
| 3.8 GO富集分析 |
| 3.9 KOG注释分析 |
| 3.10 PPI分析 |
| 3.11 PATHWAY富集分析 |
| 3.12 亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 理论基础 |
| 4.1.1 肝纤维化与肝星状细胞的理论基础 |
| 4.1.2 差异蛋白质组学的理论基础 |
| 4.1.3 中医药对肝纤维化认识的理论基础 |
| 4.1.4 荔枝核总黄酮(TFL)治疗肝纤维化的理论基础 |
| 4.2 TFL对HSC-T6生长增殖的影响 |
| 4.3 TFL对HSC-T6的ECM形成相关因子的影响 |
| 4.3.1 基质金属蛋白酶2(MMP-2) |
| 4.3.2 Ⅰ型胶原(ColⅠ) |
| 4.3.3 Ⅲ型胶原(ColⅢ) |
| 4.4 TFL对HSC-T6部分差异蛋白功能的讨论 |
| 4.4.1 上调蛋白 |
| 4.4.2 下调蛋白 |
| 4.5 TFL对HSC-T6差异蛋白部分信号通路的分析 |
| 4.5.1 PI3K/Akt通路 |
| 4.5.2 NF-κB信号通路 |
| 4.5.3 胆固醇代谢与合成 |
| 4.5.4 补体和凝血级联 |
| 4.5.5 细胞色素P450 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 荔枝核总黄酮防治肝纤维化相关细胞因子及信号通路的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
（3）SENP7去类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩略语索引 |
| 绪论 |
| 1.1 Apelin/APJ系统促进心肌肥厚 |
| 1.2 自噬参与心肌肥厚进展 |
| 1.3 Apelin-13/APJ系统促进心肌细胞高尔基体自噬 |
| 1.4 科学假说 |
| 第一部分 GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 第二部分 Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三部分 SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四部分 去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五部分 Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六部分 GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七部分 GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.4 实验结果 |
| 7.5 讨论 |
| 7.6 小结 |
| 第八部分 全文总结 |
| 第九部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Sestrin2 as a potential therapeutic target for cardiovasculardiseases |
| References |
| 攻读学位期间所获科研成果 |
| 课题资助 |
| 致谢 |
（4）第一部分 通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 第二部分 中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常：KMT2D及MYD88突变（论文提纲范文）
| 第一部分通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常:KMT2D及MYD88突变 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 样本与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 套细胞淋巴瘤分子发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件1 缩略词表 |
| 附件2 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）恶性疟原虫红内期发育过程中的蛋白质翻译后修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 恶性疟原虫生物学概述 |
| 1.1.1 疟疾及恶性疟原虫 |
| 1.1.2 恶性疟原虫对人体宿主细胞的入侵 |
| 1.1.3 恶性疟原虫对红细胞的重塑 |
| 1.2 恶性疟原虫发育繁殖的调控 |
| 1.2.1 疟原虫基因组及基因水平的调控 |
| 1.2.2 疟原虫基因的转录后调控 |
| 1.2.3 疟原虫表观遗传学修饰 |
| 1.2.4 疟原虫蛋白质的翻译后修饰调控 |
| 1.3 恶性疟原虫蛋白质翻译后修饰研究进展 |
| 1.3.1 磷酸化 |
| 1.3.2 泛素化与类泛素化 |
| 1.3.3 甲基化 |
| 1.3.4 乙酰化 |
| 1.3.5 棕榈酰化 |
| 1.3.6 糖基化 |
| 1.3.7 巴豆酰化和2-羟基异丁酰化 |
| 1.3.8 其他酰化修饰 |
| 第二章 恶性疟原虫及宿主红细胞蛋白质动态翻译后修饰水平的初步鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 红内期不同时间点染虫红细胞样品制备方法 |
| 2.1.2 蛋白质提取和质控方法 |
| 2.1.3 蛋白质翻译后修饰泛抗体Western blotting检测方法 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蛋白质提取的质控结果 |
| 2.3.2 蛋白质翻译后修饰泛抗体检测结果 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 恶性疟原虫及宿主红细胞蛋白质六种翻译后修饰联合分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 红内期不同时间点染虫红细胞样品制备方法 |
| 3.1.2 蛋白质组与翻译后修饰组的质谱鉴定方法 |
| 3.1.3 蛋白质组和翻译后修饰组生物信息学分析方法 |
| 3.2 技术路线 |
| 3.3 数据可信性分析 |
| 3.3.1 质谱质控检测 |
| 3.3.2 生物学重复性分析 |
| 3.4 恶性疟原虫及宿主红细胞六种翻译后修饰联合分析结果 |
| 3.4.1 恶性疟原虫及宿主红细胞蛋白质组和修饰位点鉴定结果 |
| 3.4.2 六种修饰的主要功能、时空分布及相关性 |
| 3.4.3 翻译后修饰对恶性疟原虫红内期48h内的发育繁殖调控 |
| 3.4.4 翻译后修饰对恶性疟原虫基因表达的调控 |
| 3.4.5 翻译后修饰对恶性疟原虫致病相关分子的调控 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 翻译后修饰对恶性疟原虫关键代谢通路的调控及修饰酶抑制剂的抗疟作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 恶性疟原虫的体外培养 |
| 4.1.2 修饰酶抑制剂的抗疟活性检测方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 翻译后修饰对恶性疟原虫关键代谢通路的调控 |
| 4.2.2 翻译后修饰酶抑制剂的抗疟作用 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 第五章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 5.3 创新点 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
（6）胃癌中差异表达mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定分析及核心circRNA circFOXO3的功能与作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 胃癌中差异表达的mRNA、lncRNA和circRNA调控网络的构建及分析 |
| 一、实验方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 circFOXO3在胃癌增殖和转移进程中的功能 |
| 一、材料和试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷化疗细胞株的建立及其耐药机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| 1. 细胞株 |
| 2. 慢病毒表达载体 |
| 3. 实验试剂及仪器 |
| 4. 常用试剂的配置 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 耐药细胞株的建立 |
| 3. 细胞或组织中中总RNA的提取 |
| 4. 反转录操作步骤 |
| 5. 蛋白提取/western blot检测 |
| 6. 使用干扰RNA瞬时转染细胞敲低基因表达 |
| 7. S100A9过表达载体pcDNA的构建和转染 |
| 8. RNA的提取和测序 |
| 9. 差异基因的生物信息学分析 |
| 10. 统计分析 |
| 三、实验结果 |
| 第一部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定 |
| 1.1 肺神经内分泌肿瘤耐药细胞构建过程的镜下表现 |
| 1.2 验证原始细胞株和构建的耐药细胞株之间对于依托泊苷化疗的耐受程度差异。 |
| 第二部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析 |
| 2.1 肺神经内分泌肿瘤耐药细胞的分组测序 |
| 2.2 对于测序结果的生物信息学分析 |
| 第三部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析 |
| 3.1 对测序数据的qRT-PCR验证 |
| 3.2 不同基因对细胞耐药的作用 |
| 3.3 过表达S100A9基因对耐药的作用 |
| 3.4 ITGB3对S100A9表达的调节 |
| 四、讨论 |
| 第一部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的培养和鉴定 |
| 第二部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的测序和分析 |
| 第三部分: 肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷细胞株的靶点分析 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肺类癌和肺大细胞神经内分泌癌的分子特征及其对临床治疗的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 附录: 缩略词表及注释 |
| 致谢 |
（8）氧气对基因组的结构与化学影响（论文提纲范文）
| 1 ROS对基因组结构的影响 |
| 1.1 细胞核内ROS |
| 1.2 ROS作用于基因组 |
| 2 铁对基因组结构的影响 |
| 2.1 铁硫簇作用于基因组 |
| 2.2 血红素作用于基因组 |
| 3 缺氧对基因组结构的影响 |
| 4 结语与展望 |
（9）蜕皮激素通过G蛋白偶联受体调控昆虫变态发育和易化扩散进入细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 激素调控昆虫变态发育 |
| 2 20E作用的分子机制 |
| 2.1 蜕皮激素及其对蜕皮变态的调控 |
| 2.2 20E基因组信号途径 |
| 2.3 20E非基因组信号途径 |
| 2.4 20E的运输方式 |
| 3 存在的科学问题,研究方案和意义 |
| 第二章 蜕皮激素竞争结合多巴胺/蜕皮激素受体抑制鳞翅目昆虫取食并促进化蛹的研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 在20E调节下,DopEcR在大脑中高表达 |
| 3.2 20E抑制幼虫取食,DA参与幼虫取食 |
| 3.3 干扰DopEcR可以减少幼虫进食并延迟化蛹 |
| 3.4 20E拮抗多巴胺功能 |
| 3.5 DopEcR参与20E信号途径 |
| 3.6 DopEcR与Gαq和Gαs相互作用以调节蛋白质的磷酸化 |
| 3.7 DopEcR结合20E的结构模拟 |
| 3.8 DopEcR结合20E |
| 4 讨论 |
| 4.1 20E与DopEcR结合导致幼虫停止进食并传导化蛹信号 |
| 4.2 GPCR结合20E |
| 4.3 20E上调DopEcR表达 |
| 4.4 多个GPCR传输20E信号 |
| 5 结论 |
| 第三章 蜕皮激素诱导G蛋白偶联受体3形成同源四聚体传递信号并通过该受体易化扩散进入细胞 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 GPCR-3参与20E信号途径 |
| 3.2 GPCR-3变态过程中表达上调 |
| 3.3 GPCR-3干扰抑制20E诱导的化蛹、组织重塑和基因表达 |
| 3.4 GPCR-3参与了20E诱导的快速细胞反应和蛋白质磷酸化 |
| 3.5 20E诱导GPCR-3的磷酸化和内化 |
| 3.6 GPCR-3结合20E |
| 3.7 GPCR-3以同源二聚体存在,并通过20E诱导为同源四聚体 |
| 3.8 GPCR-3促进20E进入细胞 |
| 4 讨论 |
| 4.1 20E通过GPCR-3传输信号和终止信号 |
| 4.2 多个GPCR结合20E的细胞膜受体 |
| 4.3 20E促进GPCR-3形成同源四聚体易化20E进入细胞 |
| 4.4 GPCR-3四聚体增加组织中20E滴度进而促进细胞凋亡 |
| 5 结论 |
| 第四章 论文创新点总结及意义 |
| 4.1 论文创新点总结及意义 |
| 4.2 后期工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）JMJD8通过AKT信号通路调控肿瘤细胞生物学进程的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 表观遗传学 |
| 1.1.1 表观遗传学概述 |
| 1.1.2 表观遗传学与肿瘤 |
| 1.1.3 组蛋白甲基化修饰 |
| 1.2 JMJD8 |
| 1.2.1 组蛋白去甲基化酶 |
| 1.2.2 组蛋白去甲基化酶与肿瘤 |
| 1.2.3 JMJD8的结构与功能 |
| 1.2.4 JMJD8的作用机制 |
| 1.3 DNA损伤修复与甲基化修饰 |
| 1.3.1 辐射损伤修复概述 |
| 1.3.3 DNA损伤修复与甲基化修饰 |
| 1.4 上皮-间充质转化(EMT) |
| 1.4.1 EMT的概述 |
| 1.4.2 EMT与肿瘤 |
| 1.4.3 Wnt/β-catenin信号通路和EMT进程 |
| 1.5 AKT |
| 1.5.1 AKT的结构与功能 |
| 1.5.2 AKT与肿瘤 |
| 1.5.3 AKT介导的相关信号通路 |
| 1.6 论文研究的目的和主要内容 |
| 1.6.1 论文研究的目的 |
| 1.6.2 论文研究的主要内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 细胞系及培养基 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 细菌培养相关试剂 |
| 2.1.5 抗体 |
| 2.1.6 核酸序列 |
| 2.1.7 实验仪器 |
| 2.1.8 实验试剂 |
| 2.1.9 主要溶剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞辐照 |
| 2.2.3 克隆存活实验 |
| 2.2.4 构建稳定转染细胞株 |
| 2.2.5 RNAi干扰技术 |
| 2.2.6 细胞增殖检测 |
| 2.2.7 裸鼠荷瘤实验 |
| 2.2.8 细胞划痕实验 |
| 2.2.9 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.2.10 RT-PCR检测基因表达 |
| 2.2.11 免疫荧光实验 |
| 2.2.12 细胞组分分离实验 |
| 2.2.13 蛋白质水平检测 |
| 2.2.14 免疫共沉淀实验 |
| 2.2.15 分子克隆实验 |
| 2.2.16 数据统计与分析 |
| 第三章 JMJD8调控肿瘤细胞增殖、辐射损伤修复和侵袭与转移 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 构建JMJD8稳定敲低细胞系和过表达质粒 |
| 3.2.2 JMJD8对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 3.2.3 JMJD8对肿瘤细胞克隆存活的影响 |
| 3.2.4 JMJD8对肿瘤细胞侵袭和转移的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 JMJD8通过AKT/NF-κB/COX-2途径参与非同源末端连接介导的DNA损伤修复 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 抑制JMJD8降低电离辐射导致的DNA双链断裂损伤 |
| 4.2.2 COX-2介导JMJD8敲低细胞中非同源末端修复相关蛋白Ku70/Ku的上调 |
| 4.2.3 抑制JMJD8促进NF-κB入核调控COX-2的表达 |
| 4.2.4 电离辐射和依托泊苷处理激活JMJD8敲低细胞中AKT/NF-κB/COX-2信号通路 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 JMJD8通过AKT/GSK3β/β-catenin途径调控肿瘤细胞上皮间充质转化(EMT) |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 抑制JMJD8促进肿瘤细胞上皮-间充质转化 |
| 5.2.2 抑制JMJD8促进β-catenin的累积及下游相关蛋白和基因的表达 |
| 5.2.3 AKT/GSK3β参与调控抑制JMJD8诱导的β-catenin的累积 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 JMJD8调控AKT翻译后修饰影响肿瘤细胞侵袭和转移 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 JMJD8调控AKT1的膜转运 |
| 6.2.2 JMJD8与AKT1相互作用影响SETDB1介导的AKT1甲基化修饰 |
| 6.2.3 AKT1甲基化招募PDK1促进AKT1磷酸化修饰和激活 |
| 6.2.4 JMJD8调控SETDB1介导的AKT1 K142甲基化修饰 |
| 6.2.5 JMJD2B与AKT1相互作用促进AKT介导的β-catenin磷酸化 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 研究总结 |
| 7.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
四、Phosphoinositides as ligands of PHD-fingers: implications for chromatin remodeling（论文参考文献）
- [1]低氧对牦牛卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及其作用机制[D]. 李瑞哲. 甘肃农业大学, 2021
- [2]荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究[D]. 蒋云霞. 广西中医药大学, 2021(01)
- [3]SENP7去类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大[D]. 高安博. 南华大学, 2021
- [4]第一部分 通过基因组和转录组分析建立套细胞淋巴瘤预后相关的分子分型 第二部分 中国慢性淋巴细胞白血病的特征性遗传学异常：KMT2D及MYD88突变[D]. 阎禹廷. 北京协和医学院, 2021(02)
- [5]恶性疟原虫红内期发育过程中的蛋白质翻译后修饰研究[D]. 王建花. 沈阳农业大学, 2021
- [6]胃癌中差异表达mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定分析及核心circRNA circFOXO3的功能与作用[D]. 张颖一. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [7]肺神经内分泌肿瘤耐依托泊苷化疗细胞株的建立及其耐药机制的研究[D]. 具晟. 苏州大学, 2020(06)
- [8]氧气对基因组的结构与化学影响[J]. 侯春英,卢多. 药学学报, 2020(08)
- [9]蜕皮激素通过G蛋白偶联受体调控昆虫变态发育和易化扩散进入细胞的研究[D]. 康新乐. 山东大学, 2020(08)
- [10]JMJD8通过AKT信号通路调控肿瘤细胞生物学进程的作用机制[D]. 苏瑶. 中国科学技术大学, 2020(01)