一、一种新型融合毒素IL15-PEΔ293的构建与体外活性测定（论文文献综述）
方佳成[1]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中研究表明癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
张璐[2]（2020）在《猪IgG Fc嵌合PRRSV Nsp9纳米抗体抑制病毒复制的研究》文中提出猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的母猪繁殖障碍与呼吸困难、仔猪肺炎、生长迟缓、免疫抑制、死亡率增加等症状的高度传染性疾病,目前缺乏有效的疫苗及商品化的抗病毒药物。Nsp9具有病毒RNA依赖的RNA聚合酶活性,是病毒形成转录和复制复合体的核心组件,可作为研发抗PRRSV制剂的理想靶标。本团队前期已经从骆驼体内筛选出了抗PRRSV Nsp9的纳米抗体Nb6,并验证了胞内表达Nb6的Marc-145细胞系感染PRRSV能力下降;连接细胞穿膜肽TAT的Nb6能够有效进入PRRSV易感细胞,并抑制不同基因型PRRSV复制。然而,细胞穿膜肽穿膜的随机性,提示Nb6靶向易感细胞的入胞途径仍需改进。由于PRRSV具备严格的单核巨噬细胞趋向性,在感染时,首先在猪肺泡巨噬细胞（PAM）中复制。单核巨噬细胞高表达Fcγ受体,该类受体是介导巨噬细胞内吞作用的主要受体。基于以上背景,本研究设计并表达了融合猪Ig G Fc的嵌合抗体Nb6-p Fc,使其能靶向PRRSV易感的猪单核巨噬细胞,通过Fcγ受体介导的细胞内吞作用进入细胞发挥抗PRRSV作用。该研究首先对嵌合抗体Nb6-p Fc生物学活性、内吞入PAM的效果以及抗病毒作用进行了探索,同时构建了稳定表达Nb6-p Fc的悬浮293细胞系,为开发抗PRRS药物提供了理论基础。主要研究内容及结果如下:1.猪Fcγ链接的纳米抗体表达及活性验证通过Overlap PCR获得了Nb6-p Fc基因片段,将其插入至毕赤酵母表达载体p PICZαA中,构建p PICZαA-Nb6-p Fc重组质粒,将重组质粒线性化并电转化毕赤酵母X-33菌株,经甲醇诱导,获得了酵母培养上清中表达的Nb6-p Fc。经Protein G亲和层析纯化,得到了高纯度的Nb6-p Fc。通过还原性电泳和非还原性电泳验证,Nb6-p Fc以二聚体的形式存在;ELISA、IFA和免疫沉淀试验证明,Nb6-p Fc与原核表达的Nsp9及宿主编码的Nsp9均具有较强的结合活性,可用于后续研究工作。2.Nb6-p Fc通过FcγR介导的细胞内吞作用进入细胞将不同浓度的Nb6-p Fc与PAM细胞孵育,利用IFA、Western blot、流式细胞术检测不同时间Nb6-p Fc被PAM内吞的情况。结果表明,Nb6-p Fc首先结合到细胞膜上,随后进入细胞。PAM对Nb6-p Fc的内吞具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。经CCK8细胞活性检测试剂盒检测在Nb6-p Fc的浓度低于或等于50μM时,均未影响PAM细胞活力。3.Nb6-p Fc抗PRRSV的功能研究使用不同PRRSV毒株的感染试验来探究Nb6-p Fc的抗病毒功能。结果表明,在0.01MOI病毒感染剂量下,Nb6-p Fc能够抑制基因1型毒株GZ-11、基因2型毒株GD-HD、SD-16、JX-A1、CH-1a以及重组的r SD16/TRS2/clover毒株在PAM上的复制,且随着抗体浓度升高,抑制效果逐渐增强;同时证明Nb6-p Fc与FcγR结合,引起IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40和TNF-α等多种细胞因子m RNA水平的上调,促进了抗病毒效果;多次给药能够提高Nb6-p Fc对r SD16/TRS2/clover的抑制效率。4.稳定表达Nb6-p Fc悬浮293细胞系的构建将带有信号肽的sp-Nb6-p Fc插入至慢病毒表达质粒p Lvx-IRES-Zs-Green,利用HEK-293T细胞包装慢病毒,转导至悬浮293细胞,并验证细胞上清中表达的Nb6-p Fc能够形成二聚体,且具有较好的与Nsp9结合的生物学活性。通过流式细胞仪的分选,得到了能够稳定表达Nb6-p Fc的悬浮293细胞系。综上所述,本研究成功表达了嵌合抗体Nb6-p Fc,该抗体能够通过FcγR介导的细胞内吞作用,针对PRRSV宿主靶细胞发挥抗病毒作用,具有进一步开发为抗PRRSV治疗剂的潜力。
涂丽裙[3]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中指出转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
王亮[4]（2020）在《uPAR促进卵巢癌发生转移及靶向uPAR-CAR-T细胞治疗卵巢癌的研究》文中指出研究背景:卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤中发病率最低,病死率最高的肿瘤类型,具有起病隐匿、进展迅速、早期转移、预后较差等特点。晚期卵巢癌发生盆腹腔广泛种植转移非常常见,往往伴有大量腹水,给临床治疗带来巨大挑战。尽管近年来除传统肿瘤细胞减灭术和化学治疗等方法外,出现了很多新型治疗方法,但临床应用的效果并未显着改善疾病生存率,寻找新的治疗方法尤其关键。免疫治疗,基于细胞免疫和体液免疫的基本原理发展起来,包括细胞因子、单抗隆抗体、肿瘤疫苗、免疫细胞输注、免疫检查点阻断等多项手段。其中,在免疫细胞治疗领域中,嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）逐渐受到关注,其基本原理是特异性识别肿瘤细胞表面的靶抗原并通过胞内信号的激活形成对肿瘤细胞的特异性杀伤。CAR-T细胞在血液肿瘤中的疗效非常显着,抗CD19-CAR-T细胞已有多项产品获得FDA批准,部分患者可达痊愈。但是CAR-T细胞在以卵巢癌为代表的实体瘤上的治疗尚无突破性进展,主要难题和实体瘤的特征有着密切关系,例如,实体瘤微环境复杂,免疫细胞的功能经常受到抑制;实体瘤的肿瘤实质具有高度异质性,免疫靶点的选择存在局限;实体瘤是致密的团块组织,常规免疫细胞难以突破实体瘤的物理屏障。简言之,探究新的卵巢癌免疫治疗方法是非常必要的。同时根本上,免疫治疗的研究也应立足于卵巢癌的疾病特征。尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定膜蛋白,属于纤溶系统的成员之一,在多种恶性肿瘤中,uPAR呈现显着性高表达,通过与尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）特异性结合启动纤溶酶原活化并参与细胞外基质降解,影响肿瘤的增殖、转移、侵袭、耐药及复发等病理过程,是逐渐得到重视的肿瘤标志物之一。现有的研究显示uPAR在卵巢癌组织中特异性高表达,不仅表达在卵巢癌实质细胞上而且表达在肿瘤基质细胞上。那么,不同于传统的肿瘤治疗靶点,靶向uPAR的治疗方法有望同时攻克卵巢癌的基质成分和抑制卵巢癌的实质成分。本研究以uPAR为卵巢癌治疗的靶点,首先验证uPAR对于卵巢癌细胞转移能力的影响,并结合动物模型验证uPAR促进卵巢癌的腹腔种植转移和腹水形成的能力;结合uPAR在卵巢癌中促进卵巢癌进展的功能特点和存在特异性分布的表达特点,设计靶向uPAR的CAR-T细胞用于卵巢癌细胞的杀伤,验证该细胞的杀伤效率和细胞因子的分泌。实验目的:分别构建uPAR基因过表达和基因敲除的稳定转染卵巢癌细胞系;研究uPAR对于卵巢癌细胞转移能力的影响;研究uPAR影响卵巢癌转移过程中上皮间质转化过程各指标的变化情况;建立裸鼠卵巢癌腹腔种植瘤模型,探究uPAR对于卵巢癌腹腔种植和腹水形成的影响;构建靶向uPAR的CAR-T细胞。验证靶向uPAR的CAR-T细胞对于卵巢癌细胞的杀伤能力,为临床上卵巢癌的细胞治疗方法提供新的思路和策略。实验方法:第1部分:uPAR增强卵巢癌的转移能力的体外实验1、通过流式细胞术检测体外培养的卵巢癌细胞系上uPAR蛋白表达情况;2、设计构建uPAR基因过表达质粒载体,转染uPAR阴性细胞系A2780;设计构建靶向uPAR基因的shRNA慢病毒载体,转导uPAR强阳性细胞系ES-2;分别构建并鉴定uPAR基因过表达和敲除的稳定转染细胞系;3、通过细胞划痕实验和Transwell小室实验探究uPAR对于卵巢癌细胞的转移能力的影响;4、利用蛋白质免疫印迹实验检测uPAR变化对uPA、PAI-1的影响和促进卵巢癌转移能力的机制中上皮间质转化过程各指标的变化情况。第2部分:uPAR促进卵巢癌腹腔种植转移和腹水形成的体内实验1、利用ES-2对照细胞系及其uPAR基因敲除的细胞系构建裸鼠腹腔种植瘤模型,验证uPAR对于卵巢癌腹腔种植转移的影响;2、通过测量裸鼠体重及腹围研究uPAR对于裸鼠腹水形成的影响;3、通过HE染色和免疫组化染色的方法探究uPAR基因敲除对于卵巢癌裸鼠的肿瘤病灶及肝、脾等器官的影响。第3部分:靶向uPAR-CAR-T细胞的构建与制备1、利用第三代CAR-T细胞的基本框架设计靶向uPAR的CAR-T细胞,创新性选择靶向uPAR的自然结合片段作为胞外识别区;2、利用三质粒慢病毒包装系统构建CAR慢病毒;3、利用密度梯度离心法提取外周血T淋巴细胞,慢病毒转导法构建CAR-T细胞,并用流式细胞术检测T细胞CD3、CD4、CD8的表达情况。第4部分:靶向uPAR-CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤1、利用靶向uPAR-CAR-T细胞对uPAR阳性卵巢癌细胞系、uPAR阴性卵巢癌细胞系进行效应细胞、靶细胞共孵育实验;2、利用LDH kit方法检测效靶实验的肿瘤裂解率,寻找最佳效靶比;3、在最佳效靶比下,利用CBA kit结合流式细胞仪对于效靶实验的Th细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-5、IL-10进行检测;4、利用ELISA方法检测效靶实验下颗粒酶B的分泌,确定CAR-T发挥细胞毒性的基本规律。实验结果:第1部分:1、流式细胞术显示在不同病理类型的5种卵巢癌细胞系中,有4种细胞高表达uPAR;ES-2细胞是uPAR强阳性细胞系,表达率为95.2%;A2780是uPAR阴性细胞系;2、稳定转染过表达uPAR的A2780细胞及其对照细胞构建完成,过表达uPAR上调uPA、PAI-1的表达;靶向uPAR基因敲除的ES-2细胞及其对照细胞构建完成。稳转细胞系的uPAR蛋白、mRNA水平与对照组相比均存在显着统计学差异。3、划痕实验和Transwell小室实验表明,uPAR的过表达促进卵巢癌细胞的迁移;相反,敲除uPAR则抑制卵巢癌细胞的转移能力。4、uPAR增强卵巢癌细胞的转移能力,上调间质细胞表型蛋白N-cadherin和vimentin并下调上皮细胞表型蛋白E-cadherin,促进上皮间质转化过程。第2部分:1、在裸鼠腹腔种植瘤模型中,基因敲除uPAR后,卵巢癌细胞系sh-ES-2形成腹腔种植瘤和产生腹水的能力均降低;2、基因敲除uPAR的ES-2细胞形成裸鼠卵巢癌模型后,其uPAR阴性表达的特征成功保留。HE染色显示uPAR阴性细胞形成的肿瘤病灶中细胞排列紧密、胞核深染、细胞形态呈卵圆形;uPAR阳性细胞形成的肿瘤病灶中细胞排列紊乱、细胞形态呈梭形。第3部分:1、靶向uPAR-CAR-T细胞的胞外识别区采用了uPAR的自然结合片段ATF,命名为ATF-CAR-T细胞。并采用了CD28-CD137-CD3ζ作为胞内区;2、利用外源性添加CD3、CD28抗体、IL-2因子的方法体外扩增、活化人外周血来源的淋巴细胞,CD3阳性比例为99.0%,且CD8阳性的比例明显升高;3、CAR慢病毒的对于T淋巴细胞转导效率为61.0%。第4部分:1、CAR-T细胞对uPAR阳性卵巢癌细胞具有显着杀伤作用,对于uPAR阴性卵巢癌细胞则不明显,说明CAR-T细胞发挥作用具有靶抗原特异性;采用不同梯度的效靶比1:1、5:1、10:1、20:1时发现,CAR-T的杀伤作用具有效应细胞剂量依赖性,随着效靶比的升高杀伤作用逐渐增强。在效靶比为10:1时,ATF-CAR-T细胞对ES-2的裂解率为65.2%±2.7%;在效靶比为20:1时,ATF-CAR-T细胞对ES-2的裂解率可达到70.6%±1.7%。考虑到成本和效果的平衡,10:1为最适宜的效靶比例。2、CAR-T细胞对uPAR阳性细胞产生特异性杀伤时,IL-2、IFN-γ、TNF细胞因子的分泌及颗粒酶B的释放显着升高。实验结论:1、分别成功构建了uPAR稳定过表达、敲除的卵巢癌细胞系;确定了过表达uPAR促进了uPA的上调;过表达uPAR基因增强卵巢癌细胞的转移能力,反之,敲除uPAR基因导致卵巢癌的转移能力降低;2、uPAR通过影响上皮间质转化过程促进了卵巢癌细胞发生转移。uPAR过表达促进间质细胞表型的产生,抑制上皮细胞表型的产生;反之,敲除uPAR基因具有相反作用;3、在裸鼠腹腔卵巢癌模型中,卵巢癌uPAR基因敲除导致腹腔病灶减少、腹水形成减少;4、效靶杀伤实验显示,CAR-T细胞对于卵巢癌细胞具有杀伤作用,且该作用具有uPAR靶抗原特异性和CAR-T细胞剂量依赖性,为临床试验的开展奠定了基础;5、CAR-T细胞发挥杀伤作用时,造成IFN-γ、TNF、IL-2和颗粒酶B释放显着升高。证实了靶向uPAR-CAR-T细胞治疗uPAR阳性卵巢癌的有效性。
陈聪[5]（2020）在《c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究》文中研究说明目的:设计靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）,验证其在胃癌中的有效性及安全性,并对c-Met CAR进行PD1/CD28融合受体优化以改善免疫抑制,提高抗肿瘤效果。方法:使用生物信息学的方法分析TCGA中胃癌数据的c-Met表达情况及其与生存预后的关系。收集手术患者的胃癌肿瘤及癌旁组织标本,用免疫组化的方法检测c-Met的表达。并用PCR、WB、流式细胞计数等方法检测6种不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1的基因和蛋白表达情况。构建c-Met CAR和cMet-PD1/CD28 CAR质粒,包装慢病毒、感染T细胞,制备对应的CAR-T。在体外细胞实验中,检测CAR-T细胞不同亚群和表型的变化,及靶细胞刺激对CAR-T激活和PD-1表达的影响。检测CAR-T的细胞因子分泌水平,并通过乳酸脱氢酶释放实验、7-AAD染色、CD107a脱颗粒反应等方法反映c-Met CAR-T、cMet-PD1/CD28 CAR-T对靶细胞的杀伤能力。在体内动物模型中,通过活体小动物成像等方法观测两种CAR-T对小鼠胃癌皮下移植肿瘤的作用,并通过HE染色的方法检测两种靶向c-Met的CAR-T对小鼠正常器官的脱靶毒性。结果:TCGA数据库和胃癌标本免疫组化结果均显示胃癌组织高表达c-Met,c-Met表达较高的胃癌患者的预后较差。通过PCR、WB、FCM等方法筛选出c-Met表达最高的胃癌细胞系MKN-45和最低的细胞系HGC-27,作为实验细胞,并使HGC-27过表达c-Met构建HGC27-OE作为阳性对照。相对于转染空载体质粒的Mock T,c-Met CAR-T细胞的CD3+CD8+亚群和CD62L+CCR7+中央记忆表型增多,PD1/CD28融合受体结构能够进一步增加CAR-T的CD62L+CCR7+中央记忆细胞的比例,但却未明显改变CD4+、CD8+T细胞亚群。靶细胞的刺激可以使c-Met CAR-T的PD-1表达升高,CD69+、CD71+激活表型增多。相对于Mock T,c-Met CAR-T与靶细胞共培养后能够分泌更多的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子,CD107a脱颗粒反应和对靶细胞的杀伤能力均明显提高,且其杀伤活性依赖于靶细胞c-Met的表达。PD1/CD28融合受体结构能够进一步增强c-Met CAR-T对c-Met阳性胃癌细胞的杀伤能力,此外,还可以降低炎性因子IL-6的释放水平。c-Met CAR-T对小鼠皮下移植胃癌模型肿瘤的生长具有明显的抑制作用,并且对小鼠正常的胃、小肠、心、肝、脾、肺、肾等重要器官没有明显的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构还能进一步增强c-Met CAR-T的远期抗肿瘤效果。结论:c-Met CAR-T对高表达c-Met的胃癌细胞具有良好的杀伤活性,能够明显抑制c-Met阳性胃癌肿瘤的生长,且对正常器官没有严重的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构能够通过逆转PD-1免疫抑制信号,进一步增强c-Met CAR-T的抗肿瘤能力,并且可以减少c-Met CAR-T炎性因子IL-6的分泌,降低细胞因子释放综合征的发生率,具有更高的安全性。
范文韬[6]（2019）在《雌激素受体对玉米赤霉烯酮诱导的肠道炎症反应的影响及其调控机制研究》文中认为玉米赤霉烯酮（Zearelenone,ZEA）是一种由镰刀菌属菌株产生的霉菌毒素,广泛存在于饲料和谷物中,严重威胁人类、家禽及家畜的健康。目前关于ZEA毒性的研究主要集中在其生殖毒性的研究,而关于ZEA的其他毒性研究仍比较匮乏。众所周知,肠道是机体营养物质消化吸收的重要部位,也是抵御病原体、食物污染物、化学药物以及天然毒素的第一道屏障。在长期的进化过程中,动物肠道建立了完备免疫系统。当外源致炎物质（如细菌细胞壁、病毒、毒素等）通过消化道进入机体后,可以刺激肠道上皮细胞过度分泌细胞因子,并导致肠道炎症反应的发生。那么饲料中污染的ZEA是否能够激活机体肠道炎症反应并损害肠道的屏障功能尚不清楚。本文首先对ZEA引起的猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）细胞氧化应激及炎症反应进行研究;然后建立ZEA致小鼠肠道炎症反应模型,并利用该模型探究了 ZEA导致肠道炎症反应的作用机理。基于上述结果,进一步研究了 ZEA对葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠肠道炎症反应的影响。与预期相反,结果显示ZEA没有促进3%DSS诱导的肠道炎症反应,反而缓解了 3%DSS诱导的肠道炎症,并且抑制了 NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3,NLRP3）炎性小体表达,另外研究表明ZEA协同3%DSS处理小鼠时表现的炎症缓解作用与雌激素受体（Estrogen receptor,ER）亚型表达差异有关。进一步,通过染色质免疫共沉淀、凝胶阻滞和双荧光素酶报告基因实验证明了 ERα可以直接调控NLRP3基因的转录,而ERβ对NLRP3基因的转录无明显调控作用。而且蛋白质免疫印迹和蛋白免疫荧光实验证实ERα的特异性激动剂可以促进NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Procaspase-1）表达和组装。本课题主要研究内容和结果如下:1.ZEA诱导猪小肠上皮细胞炎症反应本研究首先通过细胞活性试验确定ZEA在IPEC-J2细胞中的半数抑制浓度（IC50）为13.59±0.044 μg/mL,且ZEA浓度<6 μg/mL时,几乎无细胞毒性,而ZEA浓度>8μg/mL时,有明显的细胞毒性（P<0.05）。另外细胞内抗氧化酶（CAT、T-SOD、GSH-PX）活性随ZEA浓度增加而显着降低（P<0.05）,而脂质过氧化物丙二醛（MDA）随ZEA浓度增加而明显增加（P<0.05）。细胞内氧化还原失衡就会导致活性氧（ROS）的大量累积,并对线粒体膜结构尤其是线粒体内膜的损伤最严重,最终导致线粒体膜电位下降、通透性增加、线粒体损伤。本研究利用荧光探针DCFH-DA和JC-1分别进行细胞内活性氧和线粒体膜电位检测。结果显示,高剂量ZEA（8 μg/mL）孵育细胞24 h后,ROS显着升高（P<0.05）,细胞皱缩,低剂量组较对照组变化不明显。高浓度ZEA显着降低了细胞线粒体膜电位（P<0.05）,透射电镜结果也显示线粒体内外膜融合,线粒体嵴少且紊乱,部分线粒体肿胀,损伤线粒体数增加。研究表明,ROS和受损的线粒体会激活NLRP3炎性小体,加工并使半胱天冬酶-1（Caspase-1）成熟,调节白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）等促炎细胞因子的成熟与释放。免疫印迹和ELISA试验结果显示,高浓度的ZEA可以显着激活IPEC-J2细胞中NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达（P<0.05）,并促进 IL-1β 和 IL-18 的释放（P<0.05）。综上所述,在IPEC-J2细胞中,ZEA可以通过降低抗氧化酶活性,破坏机体的氧化平衡,引起机体氧化应激和线粒体损伤,并进一步激活NLRP3炎性小体,促进炎性细胞因子成熟释放。2.ZEA诱导小鼠肠道炎症反应本部分试验利用3%DSS诱导的小鼠肠道炎症反应为阳性模型,研究了高浓度ZEA（4.5mg/kg）对小鼠肠道炎症反应的作用。结果显示,ZEA处理小鼠的疾病活动指数（disease activity index,DAI）显着增加（P<0.05）,ZEA 处理小鼠的 DAI 低于 3%DSS处理小鼠。ZEA处理小鼠的结肠明显缩短（P<0.05）,小鼠的肠道组织的隐窝萎缩、断裂,炎性细胞浸润增加,黏膜层和黏膜下层都有明显的炎性灶。炎性细胞因子IL-1β和IL-18及中性粒细胞标志物MPO含量也显着升高（P<0.05）,进一步炎性小体表达检测结果也显示NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达明显增加（P<0.05）。综上结果表明高浓度ZEA可以引起小鼠肠道组织明显的炎症反应,且该炎症反应由NLRP3炎性小体信号通路介导。为了验证小鼠肠道组织炎症反应中NLRP3炎性小体激活的机制,本研究分离了小鼠的腹腔巨噬细胞,并检测了 ZEA处理后小鼠腹腔巨噬细胞中炎症反应情况。结果显示炎性细胞因子IL-1 β和IL-18含量显着升高（P<0.05）,NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达也明显增加（P<0.05）。对小鼠腹腔巨噬细胞的氧化应激研究显示,细胞中的抗氧化酶活性、MDA含量、活性氧水平变化趋势与IPEC-J2细胞结果一致,且变化显着（P<0.05）。高浓度ZEA也引起小鼠腹腔巨噬细胞线粒体明显的损伤。当细胞中加入抗氧化剂（NAC）后,炎性细胞因子IL-1β和IL-18含量,NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Caspase-1）的表达都明显降低（P<0.05）。综上所述,体内外试验结果共同表明ZEA被摄入后会引起机体的氧化应激和线粒体损伤,并进一步激活NLRP3炎性小体,促进炎性细胞因子成熟和释放,最终导致肠道炎症反应。这些结果表明,养殖场中非传染性持续性腹泻可能与饲料中ZEA污染有关。3.ZEA对3%DSS诱导的肠道炎症反应的影响本部分试验进一步建立了 ZEA协同3%DSS处理IPEC-J2细胞和小鼠的肠道炎症反应模型。结果却显示ZEA协同3%DSS处理小鼠的DAI较3%DSS单独处理组显着降低（P<0.05）,剖检结果显示,ZEA协同3%DSS处理小鼠的结肠明显长于3%DSS单独处理组小鼠结肠（P<0.05）。病理组织的染色结果表明ZEA协同3%DSS处理小鼠的结肠隐窝萎缩、断裂,炎性细胞浸润增加情况减轻。体内外试验中炎性细胞因子IL-1β和IL-18及中性粒细胞标志物MPO含量结果也比单独处理组显着降低（P<0.05）,进一步炎性小体表达检测结果则显示NLRP3炎性小体中NLRP3表达受到显着抑制（P<0.05）,而ASC、Caspase-1的表达无显着变化。综上,ZEA并没有增加3%DSS引起的肠道炎症反应,反而具有一定的缓解作用,且该缓解作用是由于NLRP3表达受到抑制。ZEA不同于其他真菌毒素的特殊之处是该毒素具有类雌激素样作用,能激活不同雌激素受体（ERα,ERβ）的表达。因此本部分试验进一步检测了 ER在不同ZEA处理中的表达情况,结果显示正常组、低浓度ZEA组和3%DSS组仅ERα表达,而高浓度ZEA组和ZEA+3%DSS组仅ERβ表达。4.雌激素受体对NLRP3炎性小体信号通路调控研究本部分试验首先通过生物信息学分析发现NLRP3启动子序列中有ER的识别基序（AGGTCACNNNNTGGCCT）,也就是NLRP3可能是ER的靶基因。进一步通过染色质免疫共沉淀实验（ChIP-qPCR）,凝胶阻滞实验（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验证明了 ERα可以直接调控NLRP3基因的转录,而ERβ对NLRP3基因的转录无明显调控作用。采用蛋白质免疫印迹和蛋白免疫荧光实验证实ERα的特异性激动剂可以促进NLRP3炎性小体（NLRP3、ASC、Procaspase-1）表达和组装。综上研究证明ER是NLRP3的一种转录调节因子,可以直接调控NLRP3的转录。此外ER还可以进一步促进NLRP3炎性小体各配体的表达和组装,进一步调节炎性反应。为了进一步验证试验结论,我们观察了特异性ERα拮抗剂（AZD9496）对3%DSS处理的小鼠结肠炎的影响,发现特异性ERα拮抗剂可以显着缓解3%DSS引起的肠道炎症反应。综上所述,本研究证明了 ZEA可以通过引起机体氧化应激和线粒体损伤,激活NLRP3炎性小体并引起肠道炎症反应;而当机体内炎症反应增强时,ZEA会改变ER亚型的表达情况。基于此,本研究初步阐明了 ER对NLRP3基因的转录调控机制及对NLRP3炎性小体表达和组装的影响。该课题进一步完善了 ZEA的肠道免疫毒性以及ER对肠道炎症反应的调控机制,并为临床中ZEA毒性研究及人类炎症性肠病的合理用药提供理论依据。
游凤涛[7]（2019）在《CD7-CAR-NK-92MI细胞靶向治疗T细胞肿瘤及双特异CAR-T细胞靶向治疗B细胞肿瘤》文中提出近几年,嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法在B细胞恶性肿瘤的临床研究中展现出非常好的临床疗效,但是,针对T细胞肿瘤的CAR-T疗法仍然面临着很大的挑战,我们很难找到一个针对T细胞肿瘤的合适靶点,大部分在T细胞肿瘤细胞上高表达的抗原,在正常T细胞上也会表达,这会导致CAR-T细胞产生自相残杀的现象。CD7分子在大部分的T淋巴细胞白血病细胞中是高表达的,但在一小群正常T淋巴细胞中是不表达的,有研究表明CD7不会对T细胞的发育和功能产生关键的影响。暗示CD7分子可能是T淋巴细胞白血病的一个理想靶点,但是,由于CD7分子在大部分正常T细胞上也表达,在制备过程中CD7-CAR-T细胞也会产生自杀现象,因此在体外很难制备成功。另外,我们也很难从T淋巴细胞白血病患者的体内获得足够的没有被肿瘤细胞污染的正常T细胞来制备CD7-CAR-T细胞。虽然最近有报道显示,在动物模型中,可以通过同时敲除了CD7和T细胞受体的异体CD7-CAR-T来治疗T细胞恶性肿瘤,但在临床实际应用中不能保证100%的基因编辑效率,因此,异体CD7-CAR-T仍然存在移植物抗宿主病（GVHD）的风险。自然杀伤（NK）细胞在对抗恶性细胞的先天免疫防御中发挥着重要作用,也是过继性免疫治疗的理想效应细胞。NK-92细胞系来自于一名非霍奇金淋巴瘤患者外周血中的单核细胞,它是唯一的一株被批准用于临床试验的NK细胞系。NK-92MI细胞来自NK-92细胞系,通过稳定转染白细胞介素-2（IL-2）基因,使其不依赖于IL-2。在本课题中,我们使用我们实验室自主开发的CD7纳米抗体序列构建了单价的CD7-CAR-NK-92MI和二价的dCD7-CAR-NK-92MI细胞,靶向治疗T淋巴细胞白血病。目的:（1）使用我们实验室自主研发的CD7纳米抗体序列,构建靶向CD7的单价CD7-CAR-NK-92MI和二价dCD7-CAR-NK-92MI稳定细胞株;（2）体外检测CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对CD7阳性肿瘤细胞的细胞毒性;（3）体外筛选2种CAR-NK-92MI细胞的单克隆细胞株,比较不同单克隆细胞株的细胞活性,获得细胞活性最好的一株CAR-NK-92MI单克隆细胞株（mdCD7-CAR-NK-92MI）;（4）评估 mdCD7-CAR-NK-92MI 细胞对 T 淋巴细胞白血病细胞的体内抗肿瘤效果。方法:为了构建CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞株,我们首先设计、合成并构建了 CD7-CAR和dCD7-CAR表达质粒,通过电转方法构建了CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞株,利用细胞流式和 western bloting 的方法对 CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞进行了鉴定。然后通过CSFE/7AAD的体外杀伤方法,检测了 2种CAR-NK-92MI细胞对T淋巴细胞白血病细胞的体外细胞毒性。使用流式细胞分选仪进行了单克隆细胞的分选,并通过CSFE/7AAD细胞毒性检测方法和CBA细胞因子检测方法,比较了不同单克隆细胞的细胞活性,获得活性最好的单克隆细胞株（mdCD7-CAR-NK-92MI）,最后通过T淋巴细胞白血病原代肿瘤细胞建立的小鼠模型,评估了mdCD7-CAR-NK-92MI细胞的体内抗肿瘤作用。结果:我们成功构建了单价的CD7-CAR-NK-92MI和二价的dCD7-CAR-NK-92MI 细胞株,CD7-CAR-NK-92MI 和 dCD7-CAR-NK-92MI 细胞对T细胞白血病细胞系和原代肿瘤细胞都显示出显着的抗肿瘤活性。通过细胞流式分选获得了 8种单价的CD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞和6种二价的dCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞,并通过细胞毒性实验和细胞因子释放实验获得了活性最好的二价mdCD7-CAR-NK-92MI细胞株。我们观察到二价的mdCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞对原代T-ALL肿瘤细胞具有显着的细胞毒性。同时,我们也观察到,与对照NK-92MI细胞相比,mdCD7-CAR-NK-92MI细胞与CD7阳性的原代T-ALL细胞孵育后,有显着的干扰素γ和颗粒酶B的释放升高。小鼠实验的结果表明mdCD7-CAR-NK-92MI对PDX小鼠模型中的肿瘤细胞具行明显的抑制作用,显着延长了小鼠的生存期。结论:我们构建了基于CD7纳米抗体序列的CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞,并通过一系列的实验证明了对T-ALL肿瘤细胞的抗肿瘤效果。不仅通过体外实验证实了 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL细胞系和原代肿瘤细胞的特异性细胞毒性,而且还通过动物实验证明了 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞可以显着抑制T-ALL原代肿瘤细胞构建的异种移植小鼠模型中的肿瘤进展。总之,我们构建的CD7-CAR-NK-92-MI细胞为T淋巴细胞白血病的治疗提供了一种新的方法或策略。虽然CD19-CAR-T疗法在治疗B细胞恶性肿瘤,特别是B细胞急性淋巴细胞白血病取得了重大的进展,表现出惊人的临床疗效,但是用CD19-CAR-T治疗后的复发率依然很高,肿瘤复发的机制之一是肿瘤细胞可以通过下调肿瘤细胞表面CD19抗原的表达,来逃避CD19-CAR-T细胞的杀伤。解决CD19阴性复发的策略之一是使用靶向B细胞肿瘤细胞上其它分子的CAR-T细胞。除了 CD 19外,CD22、CD20、CD123也是靶向B细胞肿瘤的理想靶点。但类似于CD19,靶向单一抗原依然可能会出现由于抗原丢失导致的肿瘤逃逸。因此,构建可以同时靶向癌细胞上两个抗原的CAR-T细胞,可能是解决由于单抗原丢失导致的肿瘤复发的一种新策略。目的:（1）开发人源化的CD 19和CD20抗体序列,构建hCD 19-hCD20-CAR载体;（2）构建人源化的双特异 hCD19-hCD20-CAR-T细胞和hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞;（3）检测 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞是否可以被CD 19阳性或CD20阳性靶细胞特异性活化;（4）评估hCD19-hCD20-CAR-T细胞对CD19过农达肿瘤细胞或CD20过表达肿瘤细胞的生物学功能;（5）评估hCD1 9-hCD20-CAR-T细胞对天然表达CD19和CD20抗原的B细胞肿瘤细胞株的生物学功能。方法:为了构建双特异的hCD19-hCD20-CAR载体,我们首先开发了人源化的CD19scFv和CD20scFv序列,然后设计、合成并构建了hCD19-hCD20-CAR表达质粒,并制备了 hCD19-hCD20-CAR慢病毒,对于T细胞或Jurkat细胞进行转染,制备hCD19-hCD20-CAR-T 细胞和 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞株。我们通过检测与K562-CD19 或 K562-CD20细胞孵育后hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞表面CD69的表达情况,初步评估hCD19-hCD20-CAR是否可以被CD19或CD20抗原特异性激活。然后我们通过细胞杀伤实验检测了 hCD 19-hCD20-CAR-T细胞对K562-CD19,K562-CD20,K562-CD19-CD20,Raji,Nalm-6 细胞的细胞毒性,并通过检测细胞因子的分泌和细胞表面活化分子的表达,进一步验证了hCD19-hCD20-CAR-T是否可以被靶细胞特异性活化。结果:我们成功开发了人源化的CD19抗体和CD20抗体,获得了人源化的CD19scFv 和 CD20scFv 序列,构建了 hCD19-hCD20-CAR-T 细胞和hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞。hCD19-hCD20-CAR-Jurkat 细胞与 K562-CD19 或K562-CD20细胞孵育后,CD69有显着升高,而与K562细胞孵育后,hCD1 9-hCD20-CAR-Jurkat细胞表面CD69没有显着升高,说明我们构建的hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞既可以被CD19阳性肿瘤细胞激活,也可以被CD20肿瘤细胞特异性激活。hCD19-hCD20-CAR-T细胞对K562-CD19和K562-CD20细胞的杀伤结果表明,我们构建的hCD19-hCD20-CAR-T对CD19阳性或CD20阳性的肿瘤细胞都具有特异性杀伤,可以同时杀伤CD19阳性肿瘤细胞或CD20阳性肿瘤细胞,此外,与K562-CD19和K562-CD20细胞孵育后,与T细胞组相比,hCD19-hCD20-CAR-T组的细胞因子释放有显着升高,CD25的表达也有显着增高,说明hCD19-hCD20-CAR-T细胞可以被K562-CD19或K562-CD20细胞特异性激活。hCD19-hCD20-CAR-T细胞对Raji细胞和Nalm-6细胞的体外功能实验结果也显示hCD19-hCD20-CAR-T细胞对Raji细胞和Nalm-6细胞也具有显着的特异性杀伤,而且hCD19-hCD20-CAR-T细胞也可以被Raji或Nalm-6细胞特异性激活。结论:我们成功构建了基于人源化CD19scFv和CD20scFv的hCD19-hCD20-CAR-T细胞,通过一系列体外实验证明了 hCD19-hCD20-CAR-T细胞对CD19阳性肿瘤细胞或CD20阳性肿瘤细胞都具有显着的靶向杀伤作用,因此我们构建的人源化hCD19-hCD20-CAR-T细胞可能可以作为一种靶向治疗B细胞肿瘤的新型治疗手段,或者作为CD19-CAR-T治疗后肿瘤复发的一种补救手段。
张瑾[8]（2019）在《新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究》文中研究表明研究背景:感染是引起新生儿死亡及严重后遗症的主要原因之一。其中,新生儿细菌性脑膜炎病死率高,即便恢复亦伴发神经系统损伤后遗症,为家庭和社会造成严重的负担。大肠杆菌K1（Escherichia coli K1,E.coli K1）是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体,超过80%患者是由该菌感染所致。外膜蛋白A（Outer membrane A,OmpA）是E.coli K1的关键致病因子,其胞外Loops在E.coli K1抵抗免疫系统的损伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染过程中发挥决定性的作用。新生儿感染性肺炎是新生儿期最常见的感染性疾病和重要死亡病因,即使感染控制后亦可造成不可逆损伤,严重影响大脑和身体发育。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是引起新生儿感染性肺炎的三大主要病原菌之一。PA致病因子繁多,其中外毒素A（Exotoxin A,ETA）是PA发现最早、毒力最强、也是最经典的毒力因子。它主要通过细胞识别、跨膜转位和催化活性等过程发挥其细胞的致死效应,在PA引起的新生儿感染性肺炎中发挥重要作用。随着E.coli K1和PA耐药日趋严重,常规抗感染治疗手段已捉襟见肘。因此选择合适的抗体是治疗PA,尤其对耐药PA感染的是有效替代疗法。历史经验证明:疫苗是预防与控制病原菌流行、感染及致病的最佳科学手段;抗体是中和病原菌毒素、治疗感染性疾病的特效药物。若能成功研制针对E.coli K1 OmpA和PA ETA的特异性疫苗或抗体药物,必将有效控制上述细菌的传播和致病。因此本研究针对新生儿常见病原菌Ecoli.K1和铜绿假单胞菌的严峻防控形势,研究新型疫苗和抗体为核心的免疫干预策略和药物,以期为预防新生儿感染的发生、提高其救治水平打下基础。第一部分基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制研究目的:本研究针对新生儿细菌性脑膜炎常见病原菌Ecoli.K1的严峻防控形势,针对其关键毒力因子OmpA研制新型疫苗,以期为预防新生儿Ecoli.K1脑膜炎的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.本课题拟在前期发现Vo抗原具有良好的免疫保护效果的基础上,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（1actide-CO-glycolide）PLGA）和壳聚糖（Chitosan,CS）为辅料,构建包裹Vo的纳米粒疫苗。以复乳溶剂挥发法和直接吸附法制备空白纳米粒,通过检测纳米粒的形态、粒径、分散性指数等重要参数,评价PLGA、丙酮、二氯甲烷及不同修饰方法对纳米粒的影响,筛选出空白纳米粒的最优处方;通过测定不同条件下纳米粒包裹Vo蛋白的包封率,获得最大载药量Vo纳米粒（Vo nanoparticles,VoNP）的最优处方;通过检测VoNP冻干前后的外观、形态学、粒径、电位、物理及化学稳定性等参数的变化,评价冻干工艺对VoNP质量的影响,获得VoNP的最佳制备工艺;按照最佳工艺制备VoNP,通过透射电镜、扫描电子显微镜和原子显微镜,粒度和电位分析仪,质谱仪等考察纳米粒疫苗的基本理化特征及其稳定性。2.以L929国家标准细胞毒性细胞为模型,评价VoNP的体外细胞毒性;以BALB/c小鼠为模型,肌肉注射VoNP后观察心、肝、脾、肺、肾组织病理改变,评价其体内毒性;将VoNP于0,7和14天三次免疫小鼠,检测血清中抗Vo特异性抗体的水平及类型,评价VoNP的免疫原性;致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察小鼠生存率、体重变化情况评价VoNP的保护效果,亚致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察脾、血细菌定植量,初步评价VoNP的免疫保护机制;将制备的VoNP4℃保存180天后按上述方法评价其免疫原性和免疫保护效果,与同样处理的Al（OH）3佐剂吸附的Vo疫苗相比较,评价VoNP长期稳定性。研究结果:1.纳米粒的最适配方为:以丙酮为溶剂壳聚糖修饰的PLGA纳米粒;VoNP的最大载药量为1mg,其包封率为59%;冻干过程（冷冻3h,干燥22小时）对VoNP的形态,粒径和分散性无明显影响;最佳工艺制备的VoNP的平均粒径为250.8±2.13 nm,分散性指数为0.09±0.01,电位为0.6110±0.0267 mV,VoNP呈球状、表面光滑,无明显聚集现象,分散性好;通过MALDI-TOF MS研究证实Vo蛋白在纳米粒疫苗中稳定存在;4℃放置180天的VoNP的粒径、分散性及Zeta电位未发生明显变化,稳定性良好。2.VoNP对L929细胞无明显细胞毒性作用;肌肉注射VoNP的BALB/c小鼠7天内无死亡及不良反应的发生情况,心、肝、脾、肺和肾脏器无明显病理组织学改变,表明VoNP对BALB/c小鼠无明显毒性作用;VoNP免疫小鼠后可引起较强的体液免疫应答反应,且其免疫应答类型以Th2型免疫应答为主。在攻毒保护实验中,VoNP的免疫能通过降低外周血及脾脏中的细菌定植,减轻体重变化等方式抵抗E.coli K1的感染,提高小鼠的生存率。通过动物实验证实长期保存（180天）VoNP不仅具有稳定的理化性质,且其免疫原性和免疫保护效果未见显着变化。表明,VoNP安全性较好,质量稳定。研究结论:本研究成功建立并优化了VoNP的制备工艺,获得了质量稳定、安全性较好的VoNP疫苗,动物实验表明该疫苗具有长期稳定的免疫原性和免疫保护效果,这些发现为进一步成功研发E.coli K1疫苗奠定了基础,并对促进新生儿脑膜炎E.coli K1感染的免疫干预策略研究具有重要的推动作用。第二部分抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究研究目的:本研究针对新生儿铜绿假单胞菌肺炎治疗的难题,研究以免疫球蛋白为核心的干预策略和药物,以期为预防新生儿PA感染的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.建立以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法,检测320份健康的志愿者血清中ETA特异性抗体浓度;通过Protein A亲和层析法纯化含高效价ETA抗体的免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIG）;用L929细胞模型评价抗ETA抗体对ETA毒素的中和活性;对BALB/c小鼠腹腔注射抗ETA抗体,后予致死剂量的ETA攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量ETA攻毒小鼠,观察肝脏细胞因子及病理组织改变,探索其保护机制。2.BALB/c小鼠腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,1小时后致死剂量PA103菌气管注射攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;致死剂量PA103菌气管注射攻毒BALB/c小鼠3小时后,腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的治疗效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;将结合GST-ETA的固相载体与纯化得到含高效价抗ETA抗体IVIG共孵育,去除其中ETA特异性IgG,用上述方法评价其毒素中和活性,预防和治疗保护效果的变化,验证其保护效果的特异性。研究结果:1.本研究成功构建了表达ETA及其无毒突变体（mETA）的工程菌株,并纯化得到重组ETA毒素,其活性与天然毒素相当;建立了以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法。检测320名健康志愿者血清中抗ETA抗体水平,发现抗ETA抗体平均浓度为98.7 ng/ml,最高可达918.24 ng/ml。其中血清抗ETA抗体浓度在099 ng/ml约占54%。通过Protein A亲和层析法,成功纯化得到含有高浓度抗ETA抗体的人免疫球蛋白,其SDS-PAGE纯度大于90%。2.通过L929细胞模型发现该抗ETA抗体能有效抑制ETA的细胞毒性,且具有浓度依赖的趋势;通过ETA毒素攻毒小鼠模型发现该抗体可阻断ETA导致的肝脏损伤,从而发挥良好保护效果;在急性PA肺部感染模型上发现,高效价的抗ETA免疫球蛋白可显着降低细菌在肺部的定植和炎症反应,从而发挥预防性及治疗性效应。此外,本研究发现单独使用兔抗ETA抗体或非特异性人IgGs亦可产生有限的保护效果。研究结论:本研究成功从健康的献血者中纯化得到高效价的抗ETA抗体的免疫球蛋白,其具有良好的毒素中和活性。动物实验发现该免疫球蛋白针对ETA毒素和PA急性肺部感染具有良好预防及治疗效果。这些结果为非抗生素预防和治疗PA肺部感染奠定了基础,对PA的防控提供了新的策略和方案,也为其它耐药细菌的免疫干预提供了范例。
陈波[9]（2019）在《Kv1.3专一性抑制剂RTX-Ⅷ的结构与功能研究及应用探索》文中进行了进一步梳理钾通道是功能性表达在细胞膜上允许K+跨膜通过的离子通道,钾通道广泛存在于骨骼肌、心脏、神经、胃肠道和淋巴细胞中,是目前发现的功能最复杂、亚型最多的一类离子通道。Kv1.3是一种电压门控钾通道,在淋巴细胞中高表达,现有研究表明:Kv1.3参与了人体自身免疫性疾病的发生发展,在自身免疫性疾病患者中,Kv1.3在外周血TEM细胞中和患处的表达量高于正常人;在多发性硬化症、牛皮癣和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病动物模型中,Kv1.3抑制剂表现出对其动物模型很好的治疗效果,目前已有一种Kv1.3的多肽毒素抑制剂已经针对牛皮癣的治疗进入临床II期。自身免疫性疾病主要包括牛皮癣、类风湿性关节炎、多发性硬化症、1-型糖尿病和克罗恩等疾病,现有的针对自身免疫性疾病的治疗方式主要为广谱的免疫抑制剂和抗炎药物。虽然这些药物在一定程度生能够缓解自身免疫性疾病的病情,但是这些药物也存在一个明显的副作用,就是这些药物没有明确的作用靶点,在缓解病情的同时也会对身体其他组织器官造成伤害。所以,急需有明确靶点的药物进入自身免疫性疾病治疗领域。虽然有许多靶向于Kv1.3的药物已经发现并应用于临床,但在药物的筛选上,还需要发现更多的亲和性更强,选择性更好的靶向于Kv1.3的药物。不仅如此,在Kv1.3与更多的自身免疫性疾病的关系阐述上还有待更深入的研究。本研究利用本实验室以前从雷氏大疣蛛中发现的一种Kv1.3抑制剂RTX-Ⅷ展开了与自身免疫性疾病相关的研究。RTX-Ⅷ含有35个氨基酸残基,其IC50值为36.3 nM,含有6个半胱氨酸,形成3对二硫键。首先通过化学合成的方式合成了RTX-Ⅷ,但由于复性产率较低,只占线性多肽的15%左右,故后续又采用大肠杆菌原核表达的方式获取RTX-Ⅷ,采用PET43a（+）载体和Shuffle菌种,表达的RTX-Ⅷ具有和野生型RTX-Ⅷ同样的活性,表达量为15 mg/L。获取了足够的RTX-Ⅷ用于后续自身免疫性疾病动物模型实验。虽然RTX-Ⅷ具有对Kv1.3很好的选择性和亲和力,但RTX-Ⅷ是否对于自身免疫性疾病模型有很好的治疗效果还需进一步验证。于是,构建了科学家已经证明过的Kv1.3抑制剂具有很好药效的多发性硬化症大鼠模型（实验性脑脊髓炎,EAE）和K14-VEGF牛皮癣小鼠模型来评价RTX-Ⅷ的药效。实验结果表明:1 mg/kg的RTX-Ⅷ对EAE模型大鼠表现出很好的治疗效果,并且能够降低模型治疗组中炎性因子的分泌;紧接着,又利用K14-VEGF牛皮癣小鼠来评价RTX-Ⅷ对牛皮癣的治疗效果,结果表明:RTX-Ⅷ同样对牛皮癣小鼠具有很好的治疗效果。在RTX-Ⅷ的药物代谢动力学和毒性实验中,研究发现RTX-Ⅷ在大鼠体内30 min时达到峰值,而在1 h时就会被降解完全,且RTX-Ⅷ主要通过大鼠的肝脏进行代谢,少部分通过大鼠肾脏进行代谢,即使RTX-Ⅷ通过大鼠的肾脏和肝脏进行代谢,但是在有效剂量100倍的情况下,RTX-Ⅷ并不对小鼠的肝脏和肾脏产生明显的毒副作用,并且不影响老鼠的行为学。虽然Kv1.3与多发性硬化症、牛皮癣等自身免疫性疾病的关系已经清楚,但Kv1.3与克罗恩病的关系还需进一步深入研究。所以首次研究了Kv1.3与克罗恩疾病的关系。1、从临床水平:从临床确诊为克罗恩病人和正常人的外周血中分离TEM细胞,通过膜片钳记录TEM细胞上Kv1.3的电流,从而计算功能性表达在膜上的Kv1.3的数量,我们发现:在克罗恩病人中Kv1.3的表达量相比于正常人要高三倍,通过RT-qPCR检测K1.3的mRNA在克罗恩病人和正常人的表达量,同样发现在mRNA水平,在克罗恩病人中的表达量要比正常人高5倍左右,通过免疫组化检测克罗恩病人肠粘膜和正常人肠粘膜样本,发现在克罗恩病人肠粘膜中Kv1.3的表达量要高于正常人组;结果确认Kv1.3在克罗恩病人中高表达。2、从动物模型水平:建立大鼠克罗恩疾病模型,利用RTX-Ⅷ作为药物治疗模型组大鼠,结果发现:1 mg/kg和2 mg/kg的RTX-Ⅷ能够在一定程度上缓解大鼠克罗恩症状,并且能够在体内降低大鼠Kv1.3在mRNA和蛋白质水平的表达。RTX-Ⅷ能够降低大鼠体内IL-2、TNF-a、IFN-g和IL-17A等炎性因子的分泌,其药效和临床药物英夫利昔单抗的药效基本一致。结果表明:RTX-Ⅷ对克罗恩病的治疗效果和英夫利昔单抗的治疗效果基本一致。由于现有的Kv1.3的多肽毒素抑制剂已经发现很多,尤其是在蝎子和海葵毒液中发现了大量的Kv1.3抑制剂,而在蜘蛛毒素中发现的Kv1.3抑制剂很少,不仅如此,在蝎子和海葵中的Kv1.3多肽毒素抑制剂对Kv1.3的IC50极低,通常在皮摩尔水平,而我们发现的RTX-Ⅷ相比于现有的多肽毒素也具有很明显的优势:1、现在进入临床的来自于海葵中的多肽毒素ShK-186,是基于海葵多肽毒素ShK进行修饰的多肽,进行修饰后的ShK-186对Kv1.3的IC 50为71±4 pM,对Kv1.1的IC50为7±0.5 nM,其选择性约为97倍。而RTX-Ⅷ对Kv1.3的IC50为36 nM,对Kv1.1的IC50大于100mM,其选择性大于3000倍,且RTX-Ⅷ为未经任何修饰改构的天然多肽,其选择性明显要优于ShK-186。2、ShK-186的修饰是在ShK的C端偶联上酰胺化合物,在第23个氨基酸改为甲硫氨酸,在N端加上一个磷酸化的酪氨酸,所以其样品的获得一定得依赖化学合成获得,而又因为本身含有三对二硫键,又要对合成的样品进行二硫键的连接。而RTX-Ⅷ可以通过基因工程表达获得大量的样品。所以,在样品的获得上,RTX-Ⅷ具有比ShK-186更大的优势。综上所述,本研究通过原核表达成功表达了Kv1.3的多肽抑制剂RTX-Ⅷ,并证明RTX-Ⅷ在EAE和牛皮癣动物模型中表现出很好的治疗效果,首次阐述了Kv1.3与克罗恩疾病的关系,并证明了Kv1.3抑制剂在大鼠克罗恩疾病模型中表现出很好的治疗效果,丰富了人们对克罗恩与Kv1.3的关系的认识。
刘志礼[10]（2019）在《预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究》文中进行了进一步梳理复杂的生理屏障、耐药性以及肝癌组织抑制性的微环境导致肝细胞癌成为恶性程度高、临床治疗难度大的恶性肿瘤。绝大多数患者在确诊时已属于疾病的中晚期,能通过根治手术获益的病人仅有10%-20%。免疫治疗,特别是基于甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）的免疫疗法在肝细胞癌治疗过程中显示出较大潜力,然而其临床效果依然有限。因此,亟需寻找一种新的治疗策略以提高AFP特异性的抗肿瘤免疫应答。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是激发获得性免疫应答最重要的抗原提呈细胞,它可以刺激未致敏的初始T淋巴细胞引发初次免疫应答。而慢病毒在转染非分裂细胞（尤其是DC）方面优于逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。最近,高迁移率族核小体结合域蛋白1（High Mobility Group Nucleosome Binding Domain Protein 1,HMGN1）作为抗肿瘤免疫的增强分子,已被用作一种新型的免疫佐剂,其在胞外可活化DC,并诱导DC的趋化性募集。然而,HMGN1在增强肝细胞癌AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的潜力尚不清楚。因此,本课题在三种肝癌小鼠模型和人肝癌细胞系上对表达有融合蛋白HMGN1和AFP慢病毒疫苗的抑瘤效果进行了系统测试,深入评估了HMGN1在增强AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的应用潜力,并对慢病毒疫苗的体内分布及抗肿瘤机制进行了初步探索,以期为肝细胞癌的治疗提供一种新的思路和策略。为进一步提高AFP特异性抗肿瘤免疫应答,我们构建了一种编码HMGN1和AFP融合蛋白的慢病毒疫苗（Lenti-HA）。WB检测结果显示:慢病毒可以在宿主细胞中高丰度地表达其携带的靶抗原,并且可以在胰岛素信号肽的引导下将融合蛋白分泌到细胞外发挥作用。通过流式细胞术和细胞毒实验证明:Lenti-HA可以显着提高小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的成熟度,并增强T淋巴细胞的活化能力,以起到更强的杀伤效果。并且在三种小鼠肝细胞癌模型上,包括皮下、原位和原发肝癌模型,系统测试了Lenti-HA的抗肿瘤效果及对免疫和肿瘤微环境的调控作用进行了检测。为验证这一新型疫苗在肝癌患者上应用的可行性,我们在人肝癌细胞系上对Lenti-HA的杀伤能力进行了测试。结果显示:在皮下、原位及原发肝细胞癌小鼠模型以及人肝癌细胞系上,Lenti-HA能够有效抑制肿瘤生长、延长荷瘤小鼠的生存期并且对人肿瘤细胞进行有效杀伤,说明Lenti-HA能够激活DC进而诱发抗原特异性免疫杀伤。尤为重要的是,Lenti-HA对原发肝癌小鼠的治疗,可以显着改善荷瘤小鼠抑制性的免疫和肿瘤微环境及有效抑制肝脏肿瘤向肺部转移。Lenti-HA能够有效提高AFP表达慢病毒疫苗（Lenti-AFP）的免疫原性。与Lenti-AFP相比,Lenti-HA免疫原性的提高可以显着降低慢病毒的使用剂量达6倍,从而显着提高慢病毒体内治疗的安全性。通过对慢病毒体内分布的检测发现,慢病毒主要分布于腹股沟淋巴结,并且未显示出明显的细胞倾向性。对其作用机制的初步解析发现Lenti-HA可能通过在腹股沟淋巴结招募和活化具有迁移活性的DC细胞尤其是CD103+DC,从而诱发AFP抗原特异性的抗肿瘤免疫应答。此外,我们发现在Lenti-HA治疗过程中CD8+T淋巴细胞起主导作用,并且记忆性T淋巴细胞和自然杀伤细胞也在Lenti-HA所介导的抗肿瘤免疫应答过程中起重要作用。我们的研究表明:HMGN1是一种有效的抗肿瘤免疫佐剂,能够显着增强AFP介导的抗肿瘤免疫应答,在三种不同的肝细胞癌小鼠模型上,能够有效抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的生存期。尤为重要的是,可以显着提高Lenti-AFP的免疫原性达6倍。并且在原发肝癌小鼠模型上,可以显着的改善免疫和肿瘤微环境。对其机制初探发现:CD8+T淋巴细胞在Lenti-HA治疗过程中起主要作用,但记忆T细胞及NK细胞也起重要作用。在人肝癌细胞系上也表现为AFP特异性抗肿瘤免疫应答反应的增强。本研究为肝细胞癌的免疫治疗提供了一种新型候选药物和治疗策略,可加速慢病毒疫苗的临床转化。
二、一种新型融合毒素IL15-PEΔ293的构建与体外活性测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种新型融合毒素IL15-PEΔ293的构建与体外活性测定（论文提纲范文）
（1）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）猪IgG Fc嵌合PRRSV Nsp9纳米抗体抑制病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 |
| 1.1.1 PRRSV概述 |
| 1.1.2 PRRSV的感染特点及防控 |
| 1.1.3 抗PRRSV纳米抗体的研发 |
| 1.2 纳米抗体及应用情景 |
| 1.2.1 纳米抗体的结构特点 |
| 1.2.2 纳米抗体的优点 |
| 1.2.3 纳米抗体的应用 |
| 1.3 巨噬细胞FcγR及其介导的内吞作用 |
| 1.3.1 FcγRs的分类 |
| 1.3.2 巨噬细胞的内吞 |
| 1.3.3 FcγR在PRRSV感染上的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 猪Fcγ链接的嵌合抗体表达及活性验证 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞、质粒与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 毕赤酵母表达重组质粒p PICZαA-Nb6-pFc的构建 |
| 2.2.2 阳性Nb6-pFc、Nb53-pFc毕赤酵母X-33 表达菌株的筛选 |
| 2.2.3 Nb6-pFc在毕赤酵母X-33 中的诱导表达及初步鉴定 |
| 2.2.4 Nb6-pFc的纯化、浓缩及活性鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 pPICZαA-Nb6-pFc毕赤酵母表达重组质粒的构建 |
| 2.3.2 阳性Nb6-pFc、Nb53-pFc毕赤酵母X-33 表达菌株的筛选 |
| 2.3.3 Nb6-pFc、Nb53-pFc的诱导表达及鉴定 |
| 2.3.4 Nb6-pFc的纯化、浓缩及活性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Nb6-pFc通过FcγR介导的内吞作用进入细胞 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞和病毒 |
| 3.1.2 主要试剂耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 初步检测Nb6-pFc能够进入含有FcγR的细胞 |
| 3.2.2 不同浓度Nb6-pFc进入PAM检测 |
| 3.2.3 不同时间Nb6-pFc进入PAM检测 |
| 3.2.4 Nb6-pFc的细胞毒性检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 IFA检测Nb6-pFc进入PAM和 BMDC细胞 |
| 3.3.2 不同浓度Nb6-pFc进入PAM的检测 |
| 3.3.3 不同时间Nb6-pFc进入PAM的检测 |
| 3.3.4 Nb6-pFc的细胞毒性检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Nb6-pFc抗 PRRSV功能研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 Nb6-pFc对 rSD16/TRS2/clover在 PAM上复制的影响 |
| 4.2.2 Nb6-pFc对 PRRSV高致病性GD-HD在 PAM上复制的影响 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 Nb6-pFc抑制rSD16/TRS2/clover在 PAM细胞上的复制 |
| 4.3.2 Nb6-pFc抑制GD-HD在 PAM上的复制 |
| 4.3.3 Nb6-pFc引起PAM细胞因子的表达 |
| 4.3.4 Nb6-pFc能够抑制PRRSV不同毒株在PAM上的复制 |
| 4.3.5 Nb6-pFc分多次给药能够提高对rSD16/TRS2/clover在 PAM上的抑制率 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 稳定表达Nb6-pFc悬浮293细胞系的构建 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 细胞与质粒 |
| 5.1.2 主要试剂耗材 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 pLvx-sp-Nb6-pFc-IRES-Zs Green表达重组质粒的构建 |
| 5.2.2 慢病毒的包装 |
| 5.2.3 慢病毒的转导293s细胞 |
| 5.2.4 细胞培养上清表达产物的鉴定 |
| 5.2.5 荧光阳性细胞的分选及扩大培养 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 pLvx-sp-Nb6-pFc-IRES-Zs Green表达重组质粒的构建 |
| 5.3.2 慢病毒包装 |
| 5.3.3 293s细胞培养上清中表达的Nb6-pFc具有良好的生物学活性 |
| 5.3.4 分选后Nb6-pFc的293s荧光观察 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点及下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 基本缓冲液配制 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）uPAR促进卵巢癌发生转移及靶向uPAR-CAR-T细胞治疗卵巢癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 综述一 uPAR在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.1.1 uPAR的基本结构与主要功能 |
| 1.1.2 uPAR在恶性肿瘤中的关键作用 |
| 1.1.3 uPAR靶向治疗的现有方法 |
| 1.1.4 结论 |
| 1.2 综述二 CAR-T细胞治疗恶性实体肿瘤的现状与未来 |
| 1.2.1 CAR-T细胞的基本结构和作用原理 |
| 1.2.2 CAR-T细胞在以卵巢癌为代表的实体瘤中的应用 |
| 1.2.3 CAR-T细胞治疗实体瘤的困境与改进 |
| 1.2.4 结论 |
| 第2章 uPAR增强卵巢癌的转移能力的体外实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 仪器及设备 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 流式细胞术检测卵巢癌细胞uPAR的表达 |
| 2.3.3 过表达uPAR质粒载体的构建及转染 |
| 2.3.4 短发夹RNA慢病毒载体的构建及转导 |
| 2.3.5 定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR) |
| 2.3.6 蛋白质免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 2.3.7 卵巢癌细胞划痕实验 |
| 2.3.8 卵巢癌细胞迁移实验 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 细胞培养基中支原体检测 |
| 2.4.2 uPAR在五种卵巢癌细胞系中的表达 |
| 2.4.3 稳定uPAR过表达、uPAR敲除细胞系的鉴定 |
| 2.4.4 uPAR过表达或敲除对uPA和 PAI-1 表达的影响 |
| 2.4.5 uPAR过表达或敲除对卵巢癌细胞转移能力的影响 |
| 2.4.6 uPAR过表达或敲除对上皮间质转化的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 uPAR促进卵巢癌腹腔种植转移和腹水形成的体内实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 仪器及设备 |
| 3.1.2 主要试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.1.4 实验动物 |
| 3.2 实验流程 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 卵巢癌细胞悬液的准备 |
| 3.3.2 裸鼠腹腔移植瘤模型的建立 |
| 3.3.3 裸鼠体重及腹围的测量 |
| 3.3.4 苏木精和伊红染色技术(Hematoxylin and eosin dyeing techniques,HE) |
| 3.3.5 免疫组织化学染色技术 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 卵巢癌细胞u PAR基因敲除对裸鼠体重的影响 |
| 3.4.2 卵巢癌细胞u PAR基因敲除对裸鼠腹围的影响 |
| 3.4.3 裸鼠腹腔种植瘤模型的建立 |
| 3.4.4 裸鼠组织HE染色结果 |
| 3.4.5 裸鼠组织免疫组化染色结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 靶向uPAR-CAR-T细胞的构建与制备 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 仪器及设备 |
| 4.1.2 实验试剂及耗材 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验流程 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 慢病毒ATF-CAR的构建 |
| 4.3.2 外周血来源的T淋巴细胞的获取 |
| 4.3.3 T淋巴细胞的慢病毒转导 |
| 4.3.4 流式细胞术对T细胞的检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 靶向uPAR-CAR慢病毒的基本结构 |
| 4.4.2 T淋巴细胞体外分离、培养及扩增前后表型变化 |
| 4.4.3 T淋巴细胞的慢病毒转导效率 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 靶向uPAR-CAR-T细胞对卵巢癌细胞的杀伤 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 仪器及设备 |
| 5.1.2 实验试剂及耗材 |
| 5.2 实验流程 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1效靶杀伤实验 |
| 5.3.2 细胞因子检测 |
| 5.3.3 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 ATF-CAR-T细胞对卵巢癌细胞的体外细胞毒性 |
| 5.4.2 杀伤作用相关细胞因子的分泌 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胃癌CAR-T及c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CAR-T在胃癌中的研究现状 |
| 1.2.1 胃癌CAR-T的基础研究 |
| 1.2.2 胃癌CAR-T的临床实验注册 |
| 1.3 c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.3.1 c-Met CAR-T的基础研究现状 |
| 1.3.2 c-Met CAR-T临床实验注册 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 MET基因在胃癌中表达及功能的生物信息学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 数据获取及分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 c-Met在胃癌组织及细胞系中表达的检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 胃癌组织c-Met免疫组化表达分析 |
| 3.1.2 胃癌细胞培养 |
| 3.1.3 提取细胞RNA |
| 3.1.4 PCR反应 |
| 3.1.5 提取细胞总蛋白 |
| 3.1.6 聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳 |
| 3.1.7 流式细胞计数检测胃癌细胞系c-Met、PD-L1 表达 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 c-Met在胃癌中的表达水平高于癌旁组织 |
| 3.2.2 qRT-PCR分析不同胃癌细胞系中MET、PD-L1 基因转录水平 |
| 3.2.3 WB分析不同胃癌细胞系中c-Met表达水平 |
| 3.2.4 FCM分析不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1 的细胞膜表面表达水平 |
| 3.2.5 CCLE数据库中MET、PD-L1 表达验证 |
| 3.3 结论 |
| 第四章 MET过表达慢病毒及CAR慢病毒的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒构建 |
| 4.1.2 载体酶切 |
| 4.1.3 目的基因片段扩增 |
| 4.1.4 酶连重组 |
| 4.1.5 转化 |
| 4.1.6 质粒抽提 |
| 4.1.7 重组质粒基因测序 |
| 4.1.8 质粒转染与慢病毒收获 |
| 4.1.9 慢病毒感染293T |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CAR序列结构 |
| 4.2.2 载体酶切、目的片段扩增、酶连重组验证 |
| 4.2.3 慢病毒的验证 |
| 4.3 结论 |
| 第五章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体外验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 MET-OE慢病毒感染HGC-27 细胞 |
| 5.1.2 CAR-T细胞制备 |
| 5.1.3 慢病毒CAR-T感染效率的检测 |
| 5.1.4 CAR-T细胞增殖检测 |
| 5.1.5 CAR-T细胞亚群及表型检测 |
| 5.1.6 靶细胞刺激对CAR-T激活的影响 |
| 5.1.7 靶细胞刺激对CAR-T中 PD-1 表达的影响 |
| 5.1.8 细胞因子分泌检测 |
| 5.1.9 LDH释放实验 |
| 5.1.10 7-AAD杀伤实验 |
| 5.1.11 CD107a脱颗粒反应 |
| 5.1.12 高内涵成像分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 MET-OE慢病毒感染可使HGC-27 细胞过表达c-Met |
| 5.2.2 c-Met CAR和 c Met-PD1/CD28 CAR慢病毒感染以成功构建对应的CAR-T |
| 5.2.3 CAR-T细胞中CD8~+T细胞、中央记忆T细胞的比例升高 |
| 5.2.4 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中激活表型增多 |
| 5.2.5 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中 PD-1 表达升高 |
| 5.2.6 PD1/CD28 融合受体能刺激CAR-T中 IFN-γ、TNF-α分泌,抑制IL-6分泌 |
| 5.2.7 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T对靶细胞的杀伤 |
| 5.2.8 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T的脱颗粒水平 |
| 5.2.9 高内涵成像显示CAR-T识别并杀伤肿瘤 |
| 5.3 结论 |
| 第六章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体内验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 实验细胞 |
| 6.1.5 皮下成瘤及活体小动物成像 |
| 6.1.6 HE染色 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 c-Met CAR-T及 c Met-PD1/CD28 CAR-T对 c-Met~+胃癌模型具有明显的抑制作用 |
| 6.2.2 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对正常器官没有明显的脱靶毒性 |
| 6.3 结论 |
| 第七章 讨论、结论与展望 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 嵌合抗原受体T细胞的新型设计方案 |
| 参考文献 |
| HGF/c-Met信号通路及其在胃和胃食管交界癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 附图 技术路线图 |
| 附表 |
| 附缩略词简表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）雌激素受体对玉米赤霉烯酮诱导的肠道炎症反应的影响及其调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 霉菌毒素玉米赤霉烯酮的研究进展 |
| 1.1 霉菌毒素的污染现状及毒性作用 |
| 1.2 玉米赤霉烯酮的研究进展 |
| 2. 玉米赤霉烯酮与肠道炎症反应 |
| 2.1 肠道炎症反应的研究进展 |
| 2.2 ZEA对肠道炎症反应影响的研究进展 |
| 3. 雌激素受体与肠道炎症反应 |
| 3.1 雌激素受体的结构、作用机制与分布 |
| 3.2 雌激素受体与肠道炎症的关系 |
| 3.3 雌激素受体影响肠道炎症的机制 |
| 4. NLRP3炎性小体与肠道炎症反应 |
| 4.1 炎性小体激活与疾病 |
| 4.2 NLRP3炎性小体的激活与表达 |
| 4.3 NLRP3炎性小体与肠炎的关系 |
| 4.4 炎性小体的转录调节因子 |
| 参考文献 |
| 第二章 ZEA诱导猪小肠上皮细胞炎症反应 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ZEA对IPEC-J2细胞活性的影响 |
| 2.2 ZEA对IPEC-J2氧化应激的影响 |
| 2.3 ZEA对IPEC-J2线粒体损伤的影响 |
| 2.4 ZEA对IPEC-J2细胞内炎性小体激活的影响 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ZEA诱导小鼠肠道炎症反应 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ZEA对小鼠肠道损伤的影响 |
| 2.2 ZEA对小鼠结肠组织NLRP3炎性小体及细胞因子的影响 |
| 2.3 ZEA对小鼠腹腔巨噬细胞氧化应激及线粒体损伤的影响 |
| 2.4 ZEA通过ROS影响小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎性小体激活 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 ZEA对DSS诱导的肠道炎症反应的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ZEA对DSS诱导的IPEC-J2细胞炎症反应的影响 |
| 2.2 ZEA对DSS诱导的小鼠结肠炎的影响 |
| 2.3 ZEA对DSS诱导的小鼠结肠炎中NLRP3炎性小体表达的影响 |
| 2.4 不同处理中雌激素受体的表达变化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 ER对NLRP3炎性小体信号通路调控研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 ER与NLRP3转录结合位点的预测 |
| 2.2 ER调控NLRP3基因的转录 |
| 2.3 ERα调控NLRP3炎性小体的表达与共定位 |
| 2.4 ERα拮抗剂促进DSS诱导的小鼠结肠炎恢复 |
| 2.5 ERα拮抗剂抑制结肠组织中NLRP3炎性小体表达与共定位 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）CD7-CAR-NK-92MI细胞靶向治疗T细胞肿瘤及双特异CAR-T细胞靶向治疗B细胞肿瘤（论文提纲范文）
| 中文摘要1 |
| Abstract1 |
| 中文摘要2 |
| Abstract2 |
| 第一部分: 一种新型CD7嵌合抗原受体修饰的NK-92MI细胞靶向治疗T细胞急性淋巴细胞白血病 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞,质粒及宿主菌 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 相关试剂及常用缓冲液配置 |
| 二、方法 |
| 2.1 CD7-CAR载体构建 |
| 2.2 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞的构建 |
| 2.3 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞的流式分析 |
| 2.4 蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)分析 |
| 2.5 细胞表面CD7分子的表达检测 |
| 2.6 细胞毒性实验 |
| 2.7 CAR-NK-92MI/dCD7-CAR-MK-92MI单克隆细胞的筛选 |
| 2.8 单价CD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞的体外功能比较 |
| 2.9 二价dCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞的体外功能比较 |
| 2.10 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL原代肿瘤细胞的细胞毒性 |
| 2.11 动物实验 |
| 2.12 统计分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 CD7-CAR和dCD7-CAR重组质粒的构建 |
| 3.2 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-CAR-NK-92MI细胞的构建 |
| 3.3 肿瘤细胞表面CD7抗原检测 |
| 3.4 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL肿瘤细胞系的细胞毒性 |
| 3.5 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI细胞对T-ALL原代肿瘤细胞的细胞毒性 |
| 3.6 CD7-CAR-NK-92MI和dCD7-CAR-NK-92MI单克隆细胞的体外功能比较 |
| 3.7 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞对原代T-ALL肿瘤细胞的细胞毒性 |
| 3.8 mdCD7-CAR-NK-92MI细胞对原代T-ALL肿瘤细胞的体内抗肿瘤作用 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分: 一种新型双特异嵌合抗原受体修饰的T细胞靶向治疗B细胞肿瘤 |
| 引言 |
| 一、材料 |
| 1.1 细胞,质粒及宿主菌 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 相关试剂及常用缓冲液配置 |
| 二、方法 |
| 2.1 CD19抗体重链和轻链可变区的人源化改造 |
| 2.2 CD20抗体重链和轻链可变区的人源化改造 |
| 2.3 载体构建 |
| 2.4 CAR慢病毒制备 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 流式检测 |
| 2.7 细胞毒性 |
| 2.8 细胞因子检测 |
| 2.9 细胞活化相关分子的检测 |
| 2.10 与CAR-T细胞孵育后肿瘤细胞表面抗原表达情况的检测 |
| 2.11 统计分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 CD19鼠源抗体的人源化改造 |
| 3.2 CD20鼠源抗体的人源化改造 |
| 3.3 CAR质粒构建 |
| 3.4 CAR-T细胞及CAR-Jurkat细胞的构建 |
| 3.5 肿瘤细胞抗原检测结果 |
| 3.6 hCD19-hCD20-CAR-Jurkat细胞与靶细胞孵育后CD69的表达 |
| 3.7 hCD19-hCD20-CAR-T对抗原过表达K562细胞的体外功能研究 |
| 3.8 hCD19-hCD20-CAR-T对B细胞肿瘤细胞系的体外功能研究 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 综述 NK细胞及NK-92细胞系在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 中英文主要缩略词表 |
| 致谢 |
（8）新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制 |
| 前言 |
| 第一节 纳米粒疫苗制备及质量评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 纳米粒疫苗保护效果评价及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（9）Kv1.3专一性抑制剂RTX-Ⅷ的结构与功能研究及应用探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 Kv1.3研究进展 |
| 1.1 电压门控钾通道概述 |
| 1.1.1 电压门控钾通道的结构和功能 |
| 1.1.2 电压门控钾通道的门控特征 |
| 1.1.3 电压门控钾通道的分类及特点 |
| 1.2 Kv1.3 的结构与功能简介 |
| 1.3 Kv1.3 的病理特性 |
| 1.3.1 Kv1.3 与肿瘤的关系 |
| 1.3.2 Kv1.3 与自身免疫性疾病的关系 |
| 1.3.3 Kv1.3 与阿尔茨海默病的关系 |
| 1.3.4 Kv1.3 与呼吸道疾病的关系 |
| 1.3.5 Kv1.3 与肥胖的关系 |
| 1.3.6 Kv1.3 与脑卒中的关系 |
| 1.4 Kv1.3 的抑制剂研究进展 |
| 1.5 Kv1.3 的研究展望 |
| 第二章 RTX-Ⅷ的制备及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 RTX-Ⅷ的合成 |
| 2.2.3 RTX-Ⅷ的复性 |
| 2.2.4 培养基的制备 |
| 2.2.5 感受态的制备 |
| 2.2.6 RTX-Ⅷ的原核表达 |
| 2.2.7 高效液相色谱分析 |
| 2.2.8 离子通道在HEK293 细胞上的表达 |
| 2.2.9 膜片钳检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 合成RTX-Ⅷ的纯化,复性和鉴定 |
| 2.3.2 RTX-Ⅷ的原核表达与鉴定 |
| 2.3.3 原核表达的RTX-Ⅷ的活性鉴定 |
| 2.3.4 原核表达的RTX-Ⅷ的选择性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 RTX-Ⅷ对自身免疫性疾病治疗效果的探索 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RTX-Ⅷ对 Jurkat T细胞的影响 |
| 3.3.2 RTX-Ⅷ对 EAE模型大鼠治疗效果的评价 |
| 3.3.3 RTX-Ⅷ对 EAE模型大鼠生存率的影响 |
| 3.3.4 RTX-Ⅷ对 EAE模型大鼠的炎性因子分泌的影响 |
| 3.3.5 RTX-Ⅷ对 K14-VEGF牛皮癣模型小鼠表征的影响 |
| 3.3.6 RTX-Ⅷ对 K14-VEGF牛皮癣模型小鼠的治疗效果的影响 |
| 3.3.7 RTX-Ⅷ对 K14-VEGF牛皮癣模型小鼠的炎性因子分泌的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 RTX-Ⅷ的体内代谢和毒理研究的初步探索 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验系统 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 药代动力学实验方法 |
| 4.2.4 RTX-Ⅷ在大鼠体内的分布 |
| 4.2.5 RTX-Ⅷ对小鼠行为学的影响 |
| 4.3 .结果与分析 |
| 4.3.1 RTX-Ⅷ在血清中的代谢研究 |
| 4.3.2 RTX-Ⅷ在体内的分布研究 |
| 4.3.3 RTX-Ⅷ对小鼠行为学的影响 |
| 4.3.4 对一般活动状况的影响、动物中毒症状及死亡情况 |
| 4.3.5 对体重的影响 |
| 4.3.6 病理检查 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 克罗恩与Kv1.3 的关系研究及RTX-Ⅷ对大鼠克罗恩模型的药效探索 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 CD病人的选择 |
| 5.3.2 Kv1.3在CD病人中的表达 |
| 5.3.3 RTX-Ⅷ在体外对TEM细胞的影响 |
| 5.3.4 RTX-Ⅷ对大鼠CD模型治疗效果的评价 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 主要研究结论 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩写表 |
| 攻读博士学位期间论文发表目录 |
| 致谢 |
（10）预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、HA慢病毒(Lenti-HA)对肝细胞癌免疫治疗的作用研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验使用细胞系 |
| 1.1.2 实验模式动物 |
| 1.1.3 实验用的主要仪器设备 |
| 1.1.4 实验用的主要试剂及耗材 |
| 1.1.5 试剂配制 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.1.7 数据分析及图像绘制软件 |
| 1.1.8 统计学分析 |
| 1.1.9 所用的引物序列 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 Lenti-HA的构建及体内外抑瘤效果的测试 |
| 1.2.2 在肝癌皮下瘤模型上对Lenti-HA的治疗剂量进行优化 |
| 1.2.3 Lenti-HA在肝癌原位瘤模型上治疗效果的测试 |
| 1.2.4 Lenti-HA在原发肝癌模型上治疗效果的测试 |
| 1.2.5 Lenti-HA抗肿瘤机制的初步探索 |
| 1.2.6 Lenti-HA对人肝癌细胞系体外杀伤效果的测试 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 Exosome在肝细胞癌免疫治疗中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、一种新型融合毒素IL15-PEΔ293的构建与体外活性测定（论文参考文献）
- [1]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [2]猪IgG Fc嵌合PRRSV Nsp9纳米抗体抑制病毒复制的研究[D]. 张璐. 西北农林科技大学, 2020(03)
- [3]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [4]uPAR促进卵巢癌发生转移及靶向uPAR-CAR-T细胞治疗卵巢癌的研究[D]. 王亮. 吉林大学, 2020(08)
- [5]c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究[D]. 陈聪. 兰州大学, 2020(01)
- [6]雌激素受体对玉米赤霉烯酮诱导的肠道炎症反应的影响及其调控机制研究[D]. 范文韬. 南京农业大学, 2019(08)
- [7]CD7-CAR-NK-92MI细胞靶向治疗T细胞肿瘤及双特异CAR-T细胞靶向治疗B细胞肿瘤[D]. 游凤涛. 苏州大学, 2019(04)
- [8]新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究[D]. 张瑾. 重庆医科大学, 2019(01)
- [9]Kv1.3专一性抑制剂RTX-Ⅷ的结构与功能研究及应用探索[D]. 陈波. 湖南师范大学, 2019(01)
- [10]预警素表达的慢病毒疫苗对肝细胞癌免疫治疗的作用研究[D]. 刘志礼. 天津医科大学, 2019(02)