一、基因治疗中载体的研究进展（论文文献综述）
李光照,陈锐,贾洪林,任利玲[1]（2022）在《组织工程血管化基因治疗的研究进展》文中认为背景:在大块工程化移植物内部迅速形成功能性血管系统,是其在宿主体内成功存活的基本前提。利用基因工程技术实现工程组织血管化具有治疗效果好、费用低、安全性高等优点,开展工程组织血管化基因治疗的相关研究对实现长期有效的组织修复有着重大意义。目的:综述目前组织工程血管化基因治疗的种子细胞、目的基因和基因载体的研究现状及存在的主要问题,以期进一步探讨基因治疗在组织工程血管化中的应用前景。方法:在Pub Med、Web of Science、CNKI上进行了文献检索,并以"Tissue engineering;Vascularization;Gene therapy;Seed cells;Target genes;Vectors"作为英文检索词,以"组织工程;血管化;基因治疗;种子细胞;目的基因;载体"作为中文检索词,对最终纳入的61篇文献进行了归纳总结。结果与结论:间充质干细胞、血管内皮细胞及内皮祖细胞是组织工程血管化基因治疗中最具潜力的种子细胞,不仅具有良好的血管诱导性,而且有利于多种病毒和非病毒载体的导入及血管化目的基因的表达。血管内皮生长因子、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白2、缺氧诱导因子1α等血管化目的基因,主要通过双/多基因联合、成骨与成血管耦合及上游基因调控等方式在工程化移植物内部构建出高效、稳定的血管网络。由于不同的病毒和非病毒载体具有各自的优缺点,因此在应用时主要根据基因转染效率、生物安全性、成本等方面来选择合适的载体。目前,尽管基因治疗在组织工程血管化中的应用研究已取得很大进展,但是要真正应用于临床实践,还需要突破众多技术瓶颈,例如如何提高目的因子的释放靶向性和降低安全风险等,这也是未来组织工程血管化基因治疗的研究方向和热点。
武静桥[2]（2021）在《共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究》文中研究指明肝细胞癌（HCC）异质性、死亡率和转移程度高,以血管增生为主要特征。早期患者临床症状不明显,晚期难以治愈,临床治疗较为棘手。人和动物患病率都逐年升高,耐药现象不断增加,因此,具靶向性的基因治疗成为肝癌治疗的研究热点。HIV反式激活转录（TAT）蛋白,源自人类HIV病毒TAT蛋白,可穿透细胞膜,促进大分子物质进入细胞质;Apoptin诱导的细胞凋亡受到Bcl-2和Apaf-1凋亡小体的调控,通过激活凋亡小体和Bcl-2调节的死亡途径,同时激活自噬和线粒体凋亡途径特异性诱导肿瘤细胞凋亡;肿瘤归巢肽RGD能够识别存在于癌细胞表面的整联蛋白,特异性靶向肿瘤的血管区;MEL通过与细胞膜结合,形成跨膜环状孔而使细胞膜破坏,细胞中的物质泄漏,细胞膜通透性增加,最终导致细胞溶解。本课题选择凋亡素Apoptin与蜂毒肽MEL作为肝癌靶向治疗基因,借助腺病毒作为载体,高效传递至靶细胞。将穿膜肽TAT与Apoptin融合表达,促进裂解的肝癌细胞中Apoptin蛋白二次内化进癌细胞;以靶向肽RGD靶向肝癌血管中的整合素受体,使其与MEL融合表达,引导MEL特异性杀伤肿瘤细胞,减轻对正常组织的非特异性损伤。共表达Apoptin与MEL基因,利用Apoptin以线粒体凋亡和自噬特异性诱导杀伤肿瘤细胞,同时,结合MEL溶解癌细胞的细胞膜、破坏细胞的完整结构特性,实现双基因协调抑瘤的目的,为肝癌的基因靶向治疗奠定基础。试验中将pMD-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL基因片段利用高保真特异性扩增,无缝克隆连接至线性化的GV314,构建腺病毒穿梭载体GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL。将腺病毒穿梭载体与大骨架质粒共转染至HEK293A细胞,包装纯化获得的重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin滴度为1010.75 pfu/m L,Ad-RGD-MEL的滴度为1010.38 pfu/m L,TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的滴度为1010.25 pfu/m L,Ad-EGFP的滴度为1011 pfu/m L。将各重组腺病毒分别侵染SMMC-7721细胞,间接免疫荧光和Western Blotting检测到肝癌细胞中目的基因成功表达;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL增加了活性氧的表达含量,促使细胞核DNA碎片化;重组腺病毒对L-02无显着抑制作用,对SMMC-7721与Huh 7细胞抑制作用呈现时间和剂量依赖性;流式细胞术检测1000 MOI重组腺病毒侵染SMMC-7721细胞36 h后,与对照组相比,Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的早期和晚期凋亡率均存在极显着升高（P<0.01）;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL极显着抑制SMMC-7721细胞的迁移,极显着抑制FBS介导的SMMC-7721细胞的侵袭和趋化作用（P<0.01）。重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够延缓裸鼠体重下降趋势;Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL组靶向性强,对正常组织器官损伤小,同时诱导肿瘤与肝脏中Caspase3和P53蛋白表达,凋亡细胞数增多。本实验成功包装了重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL,体外试验结果证实重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够显着抑制SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭。经异位瘤模型验证,重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL治疗组肿瘤中P53、Casepase3蛋白表达量增加,延缓裸鼠体重下降趋势,对正常组织无明显杀伤作用。综上所述,本试验表明重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够靶向抑制肝癌细胞,为比较医学和肿瘤靶向治疗提供理论基础。
严丽丽[3]（2021）在《载基因壳聚糖纳米粒的构建及其在胃肠道中的定位和表达》文中研究指明背景与目的:随着基因组学的发展,许多疾病发病的基因机制逐渐阐明,基因药物越来越受到关注。然而基因载体系统的发展相对落后,严重制约了基因治疗的发展,基因药物的载体面临着稳定性差、缺乏靶向性、难以进入细胞和在细胞内难以释放等一系列难题。尤其是胃肠道系统给药还面临着诸多消化酶、胃酸的降解和破坏使其更加困难。所以,采用优良的载体将目的基因导入,这是解决胃肠道疾病基因治疗的关键问题。炎症性肠病（IBD）是结肠的一种慢性炎症性疾病,粘膜免疫异常在其发生发展中起重要作用。现有的免疫调节药物如抗TNF-α单抗类及抗IL-12/IL-23单抗等均为全身给药,有许多副作用,如能通过胃肠黏膜靶向给药将会提高治疗效果和安全性。壳聚糖（CS）是一种阳离子聚合物可通过与核酸之间静电吸附的相互作用形成纳米粒,作为非病毒载体装载基因的纳米载体,已广泛用于基因和药物的递送。本文制备了壳聚糖纳米粒（CS-NPs）和甘露糖化壳聚糖纳米粒（MCS-NPs）,并装载TLRs信号通路相关的负性调控因子（SIGIRR、Tyro3）基因,研究其在基因递送系统中纳米粒复合物的各项性能指标以及在体内外的毒性和转染效率,小鼠胃肠道的定位和表达,以期为IBD的基因治疗提供工具。方法:1.甘露糖化壳聚糖（MCS）的合成和表征分析:将壳聚糖溶解在1%的乙酸中,按照甘露糖10%的取代度进行物料投放,在DMF溶液中进行反应,透析、纯化后真空冷冻干燥得MCS。采用红外光谱以及核磁共振对MCS进行表征分析。2.MCS-NPs、CS-NPs的制备和性能分析:采用离子凝胶法制备空白纳米粒MCS-NPs、CS-NPs,通过粒度和电位测量仪检测纳米粒的粒径、PDI及稳定性分析。3.载基因纳米粒的制备及性能分析:（1）重组质粒的构建:将酶切后的载体与目的基因进行连接得到过表达的重组质粒GV492-SIGIRR和GV643-Tyro3;再经过聚合酶链式反应对目的基因和绿色荧光蛋白报告基因（p EGFP-N1）进行测序分析,序列验证无误后提取质粒,再进行浓度、纯度检测。（2）复凝聚法制备载基因纳米粒:根据不同的N/P采用复凝聚法制备各组纳米粒复合物（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs、MCS-Tyro3-NPs、CS-Tyro3-NPs）。（3）载基因纳米粒性能检测:通过粒度和电位测量仪检测各组纳米粒复合物的粒径、PDI、电位和稳定性;超微量分光光度计检测其包裹率;琼脂糖凝胶电泳检测其DNA结合能力、核酸酶保护实验;以及利用透射电子显微镜观察纳米粒复合物的形态特征,从而优选制备条件。4.载基因纳米粒体外转染试验:纳米粒复合物（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）转染293T细胞,转染48h后采用倒置荧光显微镜观察各实验组基因在体外的转染效率。5.载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位及表达:（1）将C57BL/6J小鼠分组:1)空白对照组:自由饮食饮水,不做任何实验处理2)阴性对照组:p EGFP-N1裸质粒3)阴性对照组:SIGIRR裸质粒4)阴性对照组:Tyro3裸质粒5)实验组1:CS-p EGFP-N1-NPs6)实验组2:MCS-p EGFP-N1-NPs7)实验组3:CS-SIGIRR-NPs8)实验组4:MCS-SIGIRR-NPs9)实验组5:CS-Tyro3-NPs10)实验组6:MCS-Tyro3-NPs除空白对照组外,其他各实验组均分为灌肠、灌胃处理,每组3只,正常饮食饮水,连续给药10天后,用乙醚麻醉小鼠处死。（2）将处死的小鼠进行解剖,取大概5mm×5mm的块状胃组织和结肠组织进行冰冻切片,冰冻切片后利用正置荧光显微镜观察各组纳米粒复合物在小鼠体内胃肠道的定位及表达。6.载基因纳米粒体外细胞毒性试验:利用CCK-8试剂盒检测纳米粒复合物（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）对细胞毒性。7.载基因纳米粒体内毒性试验:（1）血清生化指标检测:将灌胃组、灌肠组利用CS-Tyro3-NPs、MCS-Tyro3-NPs作为载基因纳米粒的代表检测其在体内的毒性作用,通过灌胃、灌肠连续给药10天,用乙醚麻醉后处死小鼠。将收集的小鼠血液离心后取上清,利用相应的生化试剂盒进行肝肾功能各项生化指标的检测。（2）苏木精-伊红染色:将处死后的小鼠进行解剖,取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、结肠组织,组织经10%中性福尔马林固定液固定后,进行组织脱水、包埋、石蜡切片,再进行苏木精-伊红染色,观察各组小鼠各组织的病理学结构。结果:1.MCS的合成及表征分析核磁共振氢谱图显示,甘露糖、CS、MCS在3.28-3.87ppm均有多重信号峰,该处的信号峰为甘露糖和壳聚糖中的质子峰重叠;红外光谱图中显示有壳聚糖和糖类的特征吸收峰;甘露糖化壳聚糖合成后具有氨基甲酸酯结构,也显示有特征吸收峰。2.MCS-NPs、CS-NPs的制备和性能分析通过对溶液pH、材料浓度及质量比的优化,用离子凝胶法制备的MCS-NPs、CS-NPs经经粒度和电位测量仪结果显示,粒径在120nm左右,PDI均小于0.3,5天内的稳定性良好,粒径及PDI均无明显变化。3.载基因纳米粒的制备及性能分析（1）重组质粒的构建:重组质粒GV492-SIGIRR和GV643-Tyro3经菌落PCR鉴定为阳性的克隆子提取质粒后进行测序比对,结果显示无误。（2）载基因纳米粒粒径及稳定性检测结果:根据不同N/P用复凝聚法制备的各组纳米粒复合物经粒度和电位测量仪检测后结果显示,纳米粒复合物粒径分布在100nm-200nm之间,PDI均小于0.3,zeta电位均呈正电势;5天内肉眼未见纳米粒悬液的聚集和沉降。粒径、PDI及zeta电位均无明显变化。（3）载基因纳米粒DNA结合能力:琼脂糖凝胶电泳显示,被包裹在纳米粒中的质粒p EGFP-N1、SIGIRR均滞留在加样孔中并呈现出明亮条带。而阴性对照组的裸质粒p EGFP-N1、SIGIRR均跑出加样孔,在泳道上显示出相应的DNA片段。（4）载基因纳米粒抗核酸酶降解能力:在37℃条件下分别将载基因纳米粒、裸质粒与DNase I酶孵育,经琼脂糖凝胶电泳显示,纳米粒复合物组的质粒仍然滞留在加样孔,未跑出泳道,可见明亮的条带,再次证实了上述DNA结合实验;而阴性对照组的加样孔及泳道均无DNA条带,DNA已被DNase I酶降解,完全消失。（5）载基因纳米粒包裹率:数据显示,在不同N/P条件下制备的纳米粒复合物,计算得MCS、CS对质粒p EGFP-N1、SIGIRR的平均包裹率都达到了70%以上。（6）载基因纳米粒透射电子显微镜结果:用复凝聚法制备下的各组载基因纳米粒（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）,用透射电子显微镜观察到纳米粒形态大部分呈圆球形、椭圆形颗粒,表面平滑,且纳米粒粒径大小与粒度和电位测量仪检测下相符,均在100nm-200nm左右。4.载基因纳米粒在体外的细胞转染效果将各组载基因纳米粒（MCS-p EGFP-N1-NPs、CS-p EGFP-N1-NPs、MCS-SIGIRR-NPs、CS-SIGIRR-NPs）对293T细胞进行转染48h后,用倒置荧光显微镜观察转染效率,结果显示载基因纳米粒和Lip3000组均能在293T细胞中看到绿色荧光。5.载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位及表达取各组小鼠的胃和结肠组织,进行冰冻切片。结果显示,各组小鼠的胃、结肠组织经DAPI染色后在显微镜下均能看到显蓝色荧光的细胞核。各实验组的胃、结肠组织在显微镜下均能观察到绿色荧光,阴性对照组和空白对照组中几乎没有绿色荧光。将DAPI染色图片和绿色荧光图片进行重叠,结果显示蓝色荧光和绿色荧光能够融合。6.载基因纳米粒体外细胞毒性试验用CCK-8试剂盒检测纳米粒复合物对细胞的毒性作用,结果显示,不论是在时间还是剂量上,载基因纳米粒均无明显毒性作用。而Lip3000转染试剂对细胞增殖具有明显的抑制作用,有较大毒性。将载基因纳米粒组与Lip3000组比较均具有统计学意义（P<0.05）。7.载基因纳米粒体内毒性试验（1）肝肾功能相关生化指标:取空白对照组、灌胃组和灌肠组小鼠血清,测定肝肾功能相关生化指标,结果显示,丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（CREA）、尿素（Urea）、尿酸（UA）等各项指标在所有组间均正常。（2）苏木精-伊红染色:将各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、结肠组织脱水、包埋、石蜡切片后进行苏木精-伊红染色,结果显示,与空白对照组相比,载基因纳米粒灌胃组、灌肠组的组织病理学结构形态、质地、颜色均无明显变化。结论:1.成功构建了载基因的壳聚糖纳米粒和甘露糖化壳聚糖纳米粒,各组载基因纳米粒的各项性能指标均呈现良好,达到了基因载体的要求。2.构建的载基因纳米粒在体外可有效的进入细胞内并表达装载的基因。3.构建的载基因纳米粒通过灌肠、灌胃处理,能够在小鼠的胃肠道黏膜定位并表达装载的基因。4.构建的载基因纳米粒在体内外的毒性均很低。
徐阳[4]（2020）在《阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究》文中研究表明背景:近年来,采用微生物载体递送靶向炎症通路的基因在肿瘤治疗中取得了良好的效果。微生物载体主要包括病毒与细菌。病毒类载体可以分成两类:整合型和非整合型病毒载体,细菌主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。尽管已有大量的研究表明,应用减毒沙门菌体内递送基因能取得良好的治疗效果,但是,由于生物载体的安全性问题,限制了其临床转化过程。近期,人工合成载体递送基因抗肿瘤成为研究热点。人工合成载体包括脂质体和阳离子聚合物。聚醚酰亚胺（Polyetherimide,PEI）是经典的阳离子聚合物,并作为阳离子基因载体研究的金标准被广泛应用。但是PEI毒性较高,体内转染效率不高,这使得开发新型阳离子基因载体成为现阶段的研究热点。现阶段国内已开发出一系列合成基因载体用于治疗肿瘤,但是相关的体内研究仅局限于肿瘤本身,机体对合成载体递送基因抗肿瘤的综合反应仍未知。神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤,最常见的发生部位是肾上腺。约有50%以上的患儿生存率低于40%,探寻有效的治疗靶点是神经母细胞瘤研究的热点。在临床上,神经母细胞瘤组织血运丰富,常出现早期转移,且伴有大量出血、坏死和钙化。抑制炎症致癌信号通路在该肿瘤的治疗中发挥明显作用。维甲酸/干扰素联合应用诱导的细胞凋亡调控基因19（Genes associated with retinoid-interferon-induced mortality 19,GRIM-19）可以通过抑制转录因子信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3）通路抑制恶性肿瘤的生长。虽然近期的研究表明,STAT3信号通路在神经母细胞瘤转移和化疗耐药的患儿中至关重要,但是尚缺乏临床病理分期与GRIM-19的相关性报道。异种移植瘤的体内实验提示抑制STAT3信号通路可以抑制神经母细胞瘤的生长,但是不足以评估抑制该通路后肿瘤局部微环境的改变。我们推测在神经母细胞瘤同种移植瘤中,过表达GRIM-19可能通过抑制STAT3信号通路的机制,抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血,提高治疗效果。众所周知,多数肿瘤化疗的一线药物顺铂具有明显的内皮细胞毒性,治疗后可明显增加血浆血管性血友病因子（Von Willebrand factor,v WF）水平。针对致病机制的基因治疗具有高效低毒的特点,理论上对机体毒副作用较小。虽然已经开发出许多脂质体、阳离子载体用于神经母细胞瘤的治疗研究,可是如何在体内达到最大的治疗效果仍需仔细评估。方法:1、基因载体的合成与表征:通过酶促聚合反应合成双亲性嵌段共聚物PCL-b-P（GMA-EA）（PCG）,核磁检测PCG的化学结构,凝胶电泳检测PCG与GRIM-19质粒的结合能力,动态光散射评估PCG与GRIM-19质粒复合物的粒径和ζ电位。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,用细胞增殖活性检测（CCK-8）检测PCG与EGFP-N1质粒复合物的细胞毒性,用流式细胞仪或荧光显微镜检测PCG的转染效率。2、临床样本的分析:收集吉林大学白求恩第一医院住院确诊为神经母细胞瘤的28例患儿手术标本的石蜡切片,通过免疫组化分析GRIM-19的表达与神经母细胞瘤患儿年龄、性别、肿瘤大小、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移的相关性。3、PCG递送GRIM-19基因抑制神经母细胞瘤的体内外研究:用PEI作为阳性对照,采用Western blot检测PCG介导的GRIM-19在鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中的转染效率。体外实验分为6组,分别为对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组,应用细胞增殖实验（CCK-8）、克隆形成实验、Brd U检测、流式凋亡检测、免疫荧光、划痕及Transwell实验,探讨PCG介导的GRIM-19过表达对肿瘤增殖、凋亡及转移的影响。体内实验中,分为对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19共3组,应用免疫组化及Western blot检测GRIM-19的转染效率,通过免疫组化检测PCNA的表达,细胞凋亡检测（TUNEL）及Western blot检测分析裸鼠移植瘤治疗后增殖及凋亡的改变。进一步的体内实验分为对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组共3组,检测各组裸鼠生存期的差异,自动血液分析仪检测裸鼠血红蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中v WF,HE染色检测荷瘤鼠肺部改变,免疫组化检测肿瘤组织p-STAT3、MMP-9的表达,评价肿瘤组织学、瘤内出血、贫血及肺栓塞等肿瘤相关并发症改变。结果:1、N/P=1（阳离子聚合物中的N和DNA中的P的摩尔比）时,PCG完全阻止GRIM-19质粒DNA在凝胶电泳中的泳动。在w/w（质量比）为5-50的范围内,PCG能将p GRIM-19质粒压缩成200-400 nm大小,表面电势为25-30 m V的纳米粒子。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,PCG（w/w=20）在细胞中有效递送EGFP-N1质粒,同时对细胞的毒性较小。2、神经母细胞瘤组织中GRIM-19蛋白表达水平较癌旁正常组织下调或缺失。肿瘤组织中GRIM-19表达水平与年龄（P=0.0012）、INSS分期（P=0.0012）、INPC分期（P=0.0299）、淋巴结和/或脉管转移（P=0.0062）呈负相关,与性别及肿瘤原发部位无关。3、体外实验中,PCG载体可以将GRIM-19基因转染进Neuro2a细胞并提高GRIM-19基因的蛋白表达水平,其转染效率高于PEI。在对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组细胞凋亡增加,细胞增殖和细胞迁移抑制。PCG介导细胞内过表达GRIM-19蛋白抑制了STAT3信号通路,抑制了Cyclin D1、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达。体内实验中,在对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组移植瘤生长抑制最明显,该组GRIM-19蛋白表达增加,PCNA表达下调,TUNEL染色及Cleaved caspase-3上调。在对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组小鼠生存期延长最明显,该组大体观见瘤内出血减少,裸鼠血红蛋白升高,v WF下调,HE提示肺栓塞减少,肿瘤组织内p-STAT3下调,下游靶基因MMP-9表达下调。结论:1.人工合成的双亲性阳离子聚合物PCG能在体内外进行有效的基因转染。2.神经母细胞瘤肿瘤组织中GRIM-19的表达下调或缺失,其表达水平与年龄、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移呈负相关。3.在裸鼠同种移植瘤模型中,PCG递送p GRIM-19可以有效抑制STAT3信号通路,不仅直接抑制肿瘤细胞的生长,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血。顺铂化疗引起荷瘤裸鼠内皮损伤及肺血栓增加,基因递送组v WF下调,肺血栓减少,小鼠生存期延长。阳离子PCG载体递送p GRIM-19抑制神经母细胞瘤的治疗策略可能为肿瘤治疗提供有价值的参考。
邹昊玉[5]（2020）在《腺病毒介导白介素17A为靶点的抗体基因治疗抑制肝癌生长》文中提出在目前肝癌诊疗条件下,只有确诊为早期的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者（30%）可以接受治愈性疗法,而其余的中晚期以及复发的肝癌患者只能进行辅助治疗。现有肝癌辅助治疗手段有限,治疗效果不理想,接受辅助治疗病人的中位生存期（median overall survival,MS）少于6个月,所以,这类病人迫切需要更有效的治疗方法。基于病毒载体的基因治疗已被尝试用于肝脏疾病,并显示出了良好的应用前景。对病毒载体研究已较为透彻,尤其是5型腺病毒（Adenovirus type 5,Ad5）载体。在基因治疗临床试验中,该病毒载体是应用最多的载体类型,并且,5型腺病毒载体的嗜肝特性也使其在肝脏疾病治疗上具有独特的优势。基因治疗药物开发时,选择合适的靶点是决定治疗效果的关键因素之一。多项研究结果显示白介素17A（interleukin-17A,IL-17A）在肝癌进展中发挥了重要作用:肝癌患者肿瘤组织局部IL-17A的高表达与肿瘤进展、治疗效果差及预后不良关系密切;IL-17A能够通过增强肝癌细胞侵袭和迁移能力,增加肝肿瘤局部血管生成来促进肝癌生长。因此,在肝癌组织中阻止IL-17A的合成、促使其降解或封闭其活性将抑制肝癌的进展。基于上述假设以及5型腺病毒载体在基因治疗中的成熟应用,本课题旨在设计并开发以IL-17A为靶点,5型腺病毒为载体的肝癌基因治疗手段,并测试其应用于肝癌基因治疗的可行性及治疗效果。方法:将重组抗体片段的基因序列构建于5型腺病毒载体中,此重组抗体片段需要具备分泌功能、与IL-17A结合的能力并有较好的稳定性;病毒载体在局部给药后可以感染组织中的肿瘤细胞,然后促使重组抗体片段分泌到细胞外,中和肝癌组织局部过盛的IL-17A,达到治疗肝癌的效果。具体实施路径及方法如下:1)调取IL-17A中和抗体的重链可变区（variable regions of heavy chains,VH）和轻链可变区（variable regions of heavy chains,VL）用于重组抗体片段的构建。2)采用基因合成、同源重组、双质粒共转染法、Cs CI梯度超速离心法、壳蛋白免疫法进行载体质粒构建、病毒载体包装、浓缩纯化以及病毒滴度测定。3)采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）进行重组抗体片段的功能评价、稳定性评价及最优片段筛选。4)采用慢病毒感染肝癌细胞系后挑取单克隆的方法筛选得到高表达IL-17A的稳定肝癌细胞株;通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time-PCR,q RT-PCR）以及蛋白免疫印迹（Western blotting,WB）进行表达检测IL-17A表达。5)采用流式检测法、transwell法、划痕法等进行基于稳定株的病毒载体体外评价。6)采用免疫缺陷小鼠皮下成瘤、免疫组化、小动物活体成像等方法进行病毒载体及重组抗体片段的体内表达、血管生成状况及肿瘤抑制效果评估。实验结果:（1）重组抗体片段设计、腺病毒载体构建及包装。1)本课题设计并合成了4种重组抗体片段,结构分别为sc Fv、sc Fv-sc Fv、sc Fv-CH3和sc Fv-Fc。2)重组抗体片段的基因序列分别插入腺病毒骨架质粒,得到载体质粒pse2784、pse2887、pse2888、pse2889。对插入的基因片段进行酶切鉴定,长度分别为1716 bp、1413bp、1818 bp、1020 bp与理论长度一致;基因测序的结果显示与设计100%一致,以上说明带有重组抗体片段的载体质粒构建成功。3)4种载体质粒分别与包装质粒共转染HEK293细胞进行病毒包装,质粒转染后7-21天内4种病毒载体相继出毒,滴度均在1010 Ifu/ml级别(Ad IL17-s滴度3.16×1010 Ifu/ml,Ad IL17-s C滴度3.93×1010 Ifu/ml,Ad IL17-ss滴度4.11×1010 Ifu/ml,Ad IL17-s F滴度9.48×1010Ifu/ml),满足实验需求。（2）重组抗体片段功能及稳定性检测。1)4种腺病毒载体感染细胞后收集上清,进行以IL-17A为抗原的ELISA检测,结果显示,4种重组抗体片段均具备分泌到细胞外的能力且具备与IL-17A结合的功能,其中Ad IL17-s F抗体效价高于1:1000。2)抗体稳定性检测结果显示,4种重组抗体在反复冻融8次后,Ad IL17-s F、Ad IL17-ss、Ad IL17-s F三组抗体片段与IL-17A依然具备较高结合力(Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s,****P>0.0001;Ad IL17-s C vs.Ad IL17-s,####P>0.0001;Ad IL17-ss vs.Ad IL17-s,????P>0.0001);在与血清37℃共孵育8天后,Ad IL17-s F组抗体片段稳定性高于其他三组(Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s,****P>0.0001;Ad IL17-s F vs.Ad IL17-s C,####P>0.0001;Ad IL17-s F vs.Ad IL17-ss,?P>0.05)。最终得到结论:Ad IL17-s F组抗体片段sc Fv-Fc具有较好稳定性。（3）腺病毒载体Ad IL17-s F在体外对肝癌细胞功能的影响。1)本课题构建了高表达IL-17A稳定株Hep3B-IL17+和Huh-7-IL17+,在嘌呤霉素筛选及单克隆挑取后,与对照组相比,单克隆稳定株在m RNA水平及蛋白水均有IL-17A稳定表达,表明稳定株构建成功。2)稳定株Hep3B-IL17+和Huh-7-IL17+与对照组相比,细胞侵袭能力增强(Hep3B:IL17+vs.Control,****P<0.0001;Huh-7:IL17+vs.Control,***P<0.001);稳定株的迁移能力也要显着高于对照组细胞(Hep3B:IL17+vs.Control,***P<0.0001;Huh-7:IL17+vs.Control,***P<0.001)。在体外将腺病毒载体Ad IL17-s F作用于稳定株后,稳定株的细胞侵袭能力减弱(Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,**P<0.01;Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,**P<0.01),并且稳定株的迁移也得到抑制(Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,***P<0.001;Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,***P<0.001)。以上结果表明:腺病毒载体Ad IL17-s F能够在体外发挥作用,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。（4）腺病毒载体Ad IL17-s F体内表达、抑制血管生成及抗肿瘤情况评估。1)活体成像结果显示5型腺病毒载体在瘤内注射后可持续表达32天以上(Ad-LUC vs.Control,****P<0.0001)。2)病毒载体在肿瘤原位注射后,重组抗体片段能够在肿瘤组织中表达(Ad IL17-s F vs.Control,****P<0.0001)。3)与对照组相比,给予Ad IL17-s F治疗后,肿瘤组织内的血管生成被抑制（Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）。4)与对照组相比,Ad IL17-s F治疗组的肿瘤生长受到抑制（Huh-7-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05;Hep3B-IL17+:Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）,肿瘤组织内的细胞凋亡增加（Ad IL17-s F vs.Control,*P<0.05）。综上所述,本课题首次以IL-17A为靶点,构建了一种5型腺病毒载体Ad IL17-s F,用于肝癌治疗。此腺病毒载体在体外感染细胞后能够表达出重组抗体片段sc Fv-Fc,抗体片段具备IL-17A结合能力,在反复冻融及37℃血清共孵育8天后依然具备良好的稳定性;体外实验中,此病毒载体显示出对肝癌细胞侵袭和迁移的抑制;在体内给予腺病毒载体Ad IL17-s F治疗后,腺病毒载体能够感染肿瘤细胞,表达出抗体片段,抑制肿瘤组织局部的血管生成,并抑制肿瘤生长。本课题证明以IL-17A为靶点治疗肝癌能在一定程度上抑制肝癌生长;由此提供了一种以IL-17A为靶点的基因治疗策略,并证明了其有效性及可行性;这为以细胞因子为靶点的基因治疗方案设计提供了借鉴与新的思路。
曹韪凡[6]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中研究指明近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
刘晓亭[7]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中研究说明目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
史浩[8]（2020）在《基于盐藻外泌体靶向药物递送系统的构建及对食管癌的作用研究》文中认为食管癌是常见的恶性肿瘤之一,其致死率在恶性肿瘤中排名第六位。我国是食管癌的高发区,占世界发病总数的一半。近年来针对食管癌患者采用手术、放疗和（或）化疗等综合治疗,但食管癌患者平均生存期仍然低下。食管癌的这种不良预后与恶性肿瘤细胞的侵袭性以及这些非特异性疗法的毒副作用等密切相关,患者几乎术后都因残余肿瘤细胞复发或转移而死亡。因此,亟需寻找新的、有效的治疗方法来提高食管癌患者治疗效果,延长患者生存期。MiRNA的出现为解决这个难题提供了新的突破口。MiRNA通过调节细胞分化、细胞增殖和细胞凋亡等扮演着原癌基因或抑癌基因的角色。近年来,人们通过上调或者下调肿瘤中异常表达的mi RNA,取得了良好的治疗效果。研究表明:mi R-375在食管癌中显着下调,通过恢复mi R-375的表达能显着抑制食管癌细胞的增殖、侵袭、转移等。这表明mi R-375有望成为mi RNA基因治疗的候选分子,但是mi RNA本身易降解且带负电,在体内复杂的环境中很难到达肿瘤部位被肿瘤细胞吸收。因此,迫切需要开发一种安全、高效靶向递送系统将有治疗功能的基因/药物递送到靶细胞。作为天然的纳米载体,外泌体在药物递送方面日益显示出巨大的应用潜力。然而,如何获得大量、均一、稳定、多组分可控的外泌体是限制其进一步应用的瓶颈。本课题创新性的利用天然单细胞藻类-杜氏盐藻进行外泌体的规模化制备,借助外泌体在药物递送方面的天然优势,利用食管癌细胞对RGD多肽高亲和力的特性,构建高表达靶向食管癌细胞的外泌体,然后装载治疗性mi R-375和DOX,以实现靶向食管癌的药物共递送和联合治疗。通过进一步研究盐藻外泌体的偶联、RGD多肽的修饰及mi R-375/DOX的装载/释放,揭示其与食管癌细胞识别、相互作用及胞内输运的一般规律,解决其体外靶向性的问题;进一步在小鼠食管癌模型上考察盐藻外泌体靶向共递送能力和抑瘤机理。结果如下:透射电镜及纳米粒度仪表征显示,经超速离心提取的盐藻外泌体粒径主要分布在122±5 nm范围,形貌为外泌体典型“圆碟”形态;Zeta电位显示其表面电荷为-1.51±0.23 m V,进一步利用荧光共定位技术证实了RGD多肽与盐藻外泌体的成功偶联。接着使用电穿孔的方法将mi R-375质粒和化疗药物DOX加载到盐藻外泌体上;在电压300 V,电容为250μF时,质粒和DOX的加载率均为最佳:其中mi R-375质粒加载率为2.11±0.17%,DOX加载率为2.24±0.08%。并再次使用电镜与纳米粒度仪对加载后的工程化盐藻外泌体进行表征,结果表明多肽与质粒的成功加载略微增加了盐藻外泌体的尺寸,但是并没有破坏盐藻外泌体的形态。在细胞层面,用激光共聚焦显微镜观察到DIO荧光染料标记的修饰了RGD多肽的盐藻外泌体在食管癌细胞中富集,说明了成功修饰多肽的盐藻外泌体更容易被食管癌KYSE-150细胞摄取;MTT结果表明:工程化盐藻外泌体（RDExo/mi R-375/DOX）对食管癌KYSE-150细胞增殖率有着明显的抑制作用;细胞划痕实验及Transwell实验结果表明工程化外泌体递送系统显着抑制了细胞的迁移和侵袭;进一步的流式细胞检测结果表明:在R-DExo/mi R-375/DOX作用后,KYSE-150的细胞周期阻滞在G1期,导致G2期减少进而抑制细胞周期正常进行,细胞凋亡实验结果也说明工程化盐藻外泌体促进食管癌细胞的凋亡;最后,使用Western Blot对细胞周期蛋白E2（CCNE2）的表达水平进行分析,发现R-DExo/mi R-375/DOX实验组的CCNE2蛋白表达水平明显降低。接下来,我们建立了异位食管癌肿瘤动物模型来进一步研究工程化外泌体在体内的肿瘤靶向性和抑瘤效果,结果表明:RGD修饰的外泌体能有效地在肿瘤部位富集,说明工程化盐藻外泌体在体内具有良好的靶向性;肿瘤生长曲线、肿瘤重量及小鼠的生存曲线监测结果也进一步证实了R-DExo/mi R-375/DOX对肿瘤也有明显的抑制作用。同时,对小鼠多种器官的病理学分析表明该递送系统具有良好的生物相容性。综上所述,本研究成功通过化学偶联技术构建了基于盐藻外泌体的靶向药物递送系统,并在细胞和动物层面证明了该递送系统具有肿瘤特异靶向性和良好的生物相容性;初步的机理研究表明:mi R-375通过抑制细胞周期相关蛋白而实现与DOX协同增效的抑瘤效果。外泌体作为一种有效的药物递送工具,和其他已知的药物递送系统相比,它具有生物相容性好、无免疫排斥等优点。但是如何制备均一、稳定、组份可控且低生产成本的外泌体是制约其进一步应用的瓶颈。该研究为mi RNA药物递送提供了新的思路,并且通过工程化改造外泌体,可使其进行更有效更特异的靶向治疗。
姚洲[9]（2020）在《以AKR1C3为靶点的核酸纳米粒子的构建及其靶向抑制去势抵抗性前列腺癌的实验研究》文中研究说明前列腺癌在全球男性中是一种常见重大的临床问题,在西方发达国家,癌症发病率第一,死亡率第二。在我国,随着人口老龄化和饮食结构的改变,前列腺癌的发病率逐年递增,已经是严重危害我国中老年男性健康的常见恶性肿瘤。经雄激素剥夺治疗（ADT）后前列腺癌不可避免会进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）,其主要机制是雄激素信号通路直接或间接被再次激活。醛-酮还原酶3（AKR1C3）位于雄激素合成通路的终末端,是肿瘤细胞内合成睾酮和双氢睾酮最后两个步骤的关键酶。因此,AKR1C3是ADT后肿瘤细胞自身获得雄激素合成能力的关键酶,是再次激活雄激素信号通路促进前列腺癌进展为CRPC关键因素。将AKR1C3作为防治CRPC的靶标,通过下调AKR1C3的表达,减少前列腺癌细胞内自身雄激素的合成,是预防和治疗CRPC的新策略。近年研究出多种AKR1C3抑制剂,已经取得一定进展,但因组织选择性低、抑制作用特异性差和毒性大等缺点,而使其临床应用前景不容乐观。因此,研发肿瘤组织特异性的AKR1C3抑制剂成为亟需解决的问题。RNA干涉技术和靶向纳米输送系统的发展为上述问题的解答提供了可能。目的:制备靶向纳米输送系统与RNA干涉技术相结合的核酸纳米粒子,具有前列腺癌细胞靶向性,并抑制AKR1C3蛋白而下调细胞增殖。对核酸纳米粒子的特性进行表征,并在细胞水平评价该核酸纳米粒子的稳定性、靶向性与有效性,以及核酸纳米粒子有效性的作用机制做初步探索。方法与结果:⑴实验以PAMAM和PEG构成正电子性聚合物纳米材料载体,表面连接PSMA-aptamer使其具有前列腺癌细胞靶向性,成功合成靶向性核酸纳米载体,通过结合有效下调蛋白量的AKR1C3-si RNA,成功构建前列腺癌细胞靶向性抑制AKR1C3蛋白的核酸纳米粒子（PAMMA-PEG-PSMA-aptamer/AKR1C3-si RNA）,并对其进行表征。通过体外细胞毒性实验（SRB）筛选纳米材料载体组分的适宜比例,通过琼脂糖凝胶电泳实验,探索核酸纳米粒子载体与si RNA静电结合比例,以PAMAM-PEG-PSMA-aptamer=1:1.5:0.5,N/P=40合成靶向核酸纳米粒子。通过核磁共振氢谱鉴定核酸纳米粒子成分,合成后,材料PAMAM和PEG特征峰存在,且有MAL基团峰,可与PSMA-aptamer结合。透射电镜观察核酸纳米粒子形貌基本为圆形。测定粒径和电位检测核酸纳米粒子特性,电位随着合成的增加而变小,趋近于0m V;粒径在PAMAM结合PEG后增加,但在合成PSMAaptamer和载si RNA后出现紧缩状态,粒径逐渐减小至453.9nm左右。⑵基于成功合成的前列腺癌靶向性核酸纳米粒子（PAMMA-PEG-PSMAaptamer/AKR1C3-si RNA）,于细胞水平检测其靶向性和有效性,结果表明,核酸纳米粒子靶向PSMA阳性前列腺癌细胞,且具有时间和浓度依赖性,当浓度不变时,胞吞4h比1h入细胞的药物更多,在相同胞吞时间内,随着浓度增加,胞吞入细胞的药物量逐渐增加。模拟去势抵抗性前列腺癌环境,构建去势环境下的高表达AKR1C3的LNCa P细胞。SRB法检测细胞增殖,转染AKR1C3质粒后,提高LNCa P细胞增殖率为26.58±13.41%,在核酸纳米粒子作用下,抑制细胞增殖,LNCa P细胞增殖抑制率为22.31±7.64%,22RV1细胞增殖抑制率为4.47±2.3%。Ed U流式实验检测细胞增殖,转染AKR1C3质粒后,提高LNCa P细胞增殖率为83.52±11.38%,在核酸纳米粒子作用下,抑制细胞增殖,LNCa P细胞增殖抑制率为36.49±1.07%,22RV1细胞增殖抑制率为52.07±13.84%。核酸纳米粒子在抑制细胞增殖时,显着下调AKR1C3蛋白和cyclin D1蛋白,LNCa P细胞内分别下降71.44%和54.56%,22RV1细胞内分别下降22.24%和31.84%,所以,可见核酸纳米粒子通过下调AKR1C3蛋白有效抑制前列腺癌细胞的增殖。结论:采用纳米医学和RNA干涉技术相结合,成功构建以AKR1C3为治疗靶标,前列腺癌靶向特异性si RNA干涉体系（PAMMA-PEG-PSMA-aptamer/AKR1C3-si RNA）,并于细胞水平验证其安全性,其有效抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖。本研究将为AKR1C3-si RNA的创新应用及CRPC的治疗提供理论基础和实验依据。
胡金金[10]（2020）在《静脉注射Ngb转染ADSCs联合瑞格列奈靶向治疗大鼠脊髓损伤的实验研究》文中认为目的:研究静脉注射脑红蛋白（Neuroglobin,Ngb）转染脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）联合瑞格列奈对大鼠脊髓损伤的疗效,为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。方法:1.取3月龄的健康SD大鼠一只,从腹股沟区脂肪组织中提取ADSCs,细胞传代培养至第三代,流式细胞仪检测传代细胞表面抗原,鉴定为ADSCs后浓缩冻存。将Ngb通过聚合酶链反应（PCR）扩增,与慢病毒载体pLenti6.3-IRES—EGFP成功连接,再转染293T细胞,最后将病毒液转染ADSCs。荧光显微镜检测GFP的表达,蛋白印迹法（Western blot,WB）检测ADSCs中Ngb表达;用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs）标记Ngb成功转染的AD SCs,检测ADSCs的移植效率及存活率。2.采用改良Allen?s法建立大鼠脊髓损伤模型48只,随机分为空白对照组、瑞格列奈组、转染干细胞组、转染干细胞+瑞格列奈（即联合组）。转染干细胞组、联合组均分别静脉注射0.3ml SPIONs标记Ngb转染的ADSCs（1×107/ml）,1次/日,共6d。联合组、瑞格列奈组分别予以瑞格列奈（0.4mg/kg）灌胃,1次/日,共6d。空白对照组注射等量的DMEM培养基。3.各组实验大鼠分别在第1d、3d、5d、1w、2w和4w采用损伤行为学（Basso-Beattie-Bresnaha n,BBB）法对大鼠脊髓损伤程度进行评分,在1w和4w分别行HE染色、透射电镜观察大鼠脊髓病理变化,WB检测脊髓组织Ngb的表达情况。结果:1.ADSCs的提取及鉴定:从SD大鼠腹股沟脂肪组织成功分离出ADSCs,传代培养后经流式细胞学技术检测细胞表面抗原CD49d、CD44的表达分别为47.21%、50.05%,CD14、CD45的表达分别为0.72%、2.57%。2.Ngb的示踪:Ngb转染的ADSCs培养至第3天时发现有明显GFP表达,采用培养后5天的Ngb转染的ADSCs进行动物实验,在第1W,第2W及第4W转染干细胞组大鼠脊髓组织内均检测到GFP的表达,提示Ngb在脊髓损伤部位有表达,且随时间的延长表达逐渐增多。3.SPIONs标记的ADSCs存活率检测结果:SPIONs标记的ADSCs组第1d、第3d、第5d存活率分别为96.12±0.75%、95.35±1.24%、95.61±1.35%,未被SPIONs标记的ADSCs组第1d、第3d、第5d存活率分别为95.43±1.12%、96.45±1.70%、96.10±0.12%,两组无统计学差异（P>0.05）。4.BBB评分:造模后3d各组大鼠BBB评分均在0-2分,四组两两比较,差异无统计学意义（P>0.05）,提示造模成功;造模后5d、7d、14d、28d四组大鼠BBB评分趋势始终为:空白对照组低于瑞格列奈组,瑞格列奈组低于转染干细胞组,联合组最高,四组间两两比较,差异有统计学意义（P<0.05）。5.HE染色结果:第1w时各组大鼠脊髓组织中均出现不同程度的炎症细胞及成纤维细胞浸润、组织紊乱、神经细胞空泡样变及残留组织间隔增大等改变,其中空白对照组最为明显,瑞格列奈组炎症细胞浸润相对较少,神经元空泡样变数量较少,转染干细胞组及联合组的病理改变最少;第4w时各组大鼠脊髓组织出现不同程度组织排列紊乱、胶质瘢痕形成、神经元空泡样变,空白对照组比瑞格列奈组明显,瑞格列奈组比转染干细胞组明显,联合组改变最少。6.电镜结果:第1w时各组大鼠脊髓组织中神经髓鞘结构水肿粘连、突触间隙增大及神经突触减少等改变。第4w时神经组织脱髓鞘病变加重、部分髓鞘消失、出现神经元细胞溶解及胶质细胞数量增多等改变,以上两个时间点的观察结果显示空白对照组改变比瑞格列奈组明显,瑞格列奈组改变比转染干细胞明显,联合组改变最少。7.WB检测Ngb结果:空白对照组、瑞格列奈组、转染干细胞组及联合组第1w时Ngb表达量分别为0.08±0.04、0.09±0.03、0.41±0.10、0.45±0.09,第4w时Ngb表达量分别为0.12±0.04、0.15±0.02、0.61±0.08、0.72±0.12,两个时间点空白对照组和瑞格列奈组与联合组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,联合组Ngb表达量最多,神经功能恢复最好。结论:静脉注射Ngb转染的ADSCs能靶向迁移到脊髓损伤部位,并且对大鼠脊髓损伤具有一定疗效,联合瑞格列奈治疗效果更加明显。
二、基因治疗中载体的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因治疗中载体的研究进展（论文提纲范文）
（1）组织工程血管化基因治疗的研究进展（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 筛选标准 |
| 1.3 文献的提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 基因治疗中的成血管种子细胞 |
| 2.2 基因治疗中的促血管化目的基因 |
| 2.3 基因治疗中的载体 |
| 3 总结与展望Summary and prospects |
（2）共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 重组腺病毒在肝癌治疗中的研究进展 |
| 1.1.1 肝癌的研究背景 |
| 1.1.2 腺病毒载体的研究现状和问题 |
| 1.1.2.1 腺病毒载体的研究现状 |
| 1.1.2.2 腺病毒载体在肿瘤治疗中的进展 |
| 1.2 肿瘤靶向肽与细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤靶向肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.2 细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.3 蜂毒肽的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.3.1 蜂毒肽的抑瘤机制 |
| 1.3.2 蜂毒肽的研究进展 |
| 1.4 凋亡素的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.4.1 凋亡素的抑瘤机制 |
| 1.4.2 凋亡素的研究进展 |
| 1.5 研究方案 |
| 1.5.1 技术路线 |
| 1.5.2 研究内容及意义 |
| 第二章 共表达GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.1.2 试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 溶液和培养基 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计 |
| 2.1.2.2 重组质粒pMD-TAT-Apoptin和 pMD-UBI-RGD-MEL提取 |
| 2.1.2.3 高保真扩增目的基因TAT-Apoptin和 UBI-RGD-MEL |
| 2.1.2.4 PCR产物胶回收 |
| 2.1.2.5 重组腺病毒载体构建 |
| 2.1.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因特异性扩增 |
| 2.2.2 GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.2.3 GV-TAT-Apoptin重组质粒鉴定 |
| 2.2.4 GV-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 共表达Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.1.4 溶液和培养基 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 细胞培养 |
| 3.1.2.2 重组腺病毒穿梭质粒与大骨架质粒提取 |
| 3.1.2.3 共转染HEK293A细胞 |
| 3.1.2.4 重组腺病毒扩增与纯化 |
| 3.1.2.5 重组腺病毒滴度测定 |
| 3.1.2.6 RT-PCR检测目的基因的表达 |
| 3.1.2.7 间接免疫荧光检测目的基因表达 |
| 3.1.2.8 Western blotting检测目的蛋白表达 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 各重组腺病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.2 RT-PCR检测目的基因转录情况 |
| 3.2.3 各重组腺病毒感染SMMC-7721 肝癌细胞情况 |
| 3.2.4 Western blotting检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达情况 |
| 3.2.5 间接免疫荧光检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组腺病毒体外抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 重组腺病毒和细胞系 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 CCK-8 法检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞、Huh7 细胞、L-02 细胞的杀伤作用 |
| 4.1.2.2 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达 |
| 4.1.2.3 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.4 细胞划痕试验检测SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.5 细胞趋化试验检测FBS介导的SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.6 细胞侵袭试验检测SMMC-7721 细胞侵袭能力 |
| 4.1.2.7 ROS检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞活性氧含量影响 |
| 4.1.2.8 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.9 扫描电镜观察 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 各重组腺病毒抑制L-02 细胞增殖 |
| 4.2.2 各重组腺病毒抑制SMMC-7721 细胞增殖 |
| 4.2.3 各重组腺病毒抑制Huh7 细胞增殖 |
| 4.2.4 各重组腺病毒SMMC-7721 细胞凋亡蛋白表达 |
| 4.2.5 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡结果 |
| 4.2.6 细胞划痕试验结果 |
| 4.2.7 细胞趋化试验结果 |
| 4.2.8 细胞侵袭试验结果 |
| 4.2.9 ROS含量检测结果 |
| 4.2.10 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡 |
| 4.2.11 扫描电镜观察各重组腺病毒诱导SMMC-7721 细胞形态变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒体内抑瘤作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 细胞系和试验动物 |
| 5.1.1.2 主要试剂 |
| 5.1.1.3 主要仪器 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 SMMC-7721 实体瘤模型的建立与荷瘤裸鼠治疗 |
| 5.1.2.2 病理切片制备及HE染色 |
| 5.1.2.3 免疫组织化学染色 |
| 5.1.2.4 TUNEL染色 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 荷瘤裸鼠体重变化曲线 |
| 5.2.2 各重组腺病毒对荷瘤裸鼠内脏器官及肿瘤重量影响 |
| 5.2.3 裸鼠各组织HE染色结果 |
| 5.2.4 肿瘤组织免疫组织化学结果 |
| 5.2.5 TUNEL染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读硕士学位论文期间发表的论文及着作 |
（3）载基因壳聚糖纳米粒的构建及其在胃肠道中的定位和表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 实验小鼠 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 MCS的合成及表征分析 |
| 2.2.2 空白纳米粒的制备及性能分析 |
| 2.2.3 载基因纳米粒的制备及性能分析 |
| 2.2.4 载基因纳米粒体外转染试验 |
| 2.2.5 载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位及表达 |
| 2.2.6 载基因纳米粒体外细胞毒性试验 |
| 2.2.7 载基因纳米粒体内毒性试验 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 MCS的合成及表征分析 |
| 3.2 MCS-NPs、CS-NPs的粒径、PDI及稳定性结果 |
| 3.2.1 MCS-NPs、CS-NPs的粒径、PDI |
| 3.2.2 MCS-NPs、CS-NPs稳定性 |
| 3.3 载基因纳米粒的制备及性能分析 |
| 3.3.1 质粒p EGFP-N1 转化和序列比对 |
| 3.3.2 重组质粒GV492-SIGIRR和 GV643-Tyro3 的构建 |
| 3.3.3 载基因纳米粒粒径和电位 |
| 3.3.4 载基因纳米粒的包裹率 |
| 3.3.5 载基因纳米粒的DNA结合能力 |
| 3.3.6 载基因纳米粒抗核酸酶降解能力 |
| 3.3.7 载基因纳米粒的稳定性 |
| 3.3.8 载基因纳米粒电镜检测 |
| 3.4 载基因纳米粒在体外的细胞转染结果 |
| 3.5 载基因纳米粒在小鼠胃肠道定位和表达 |
| 3.6 载基因纳米粒体外细胞毒性作用 |
| 3.7 载基因纳米粒体内毒性作用 |
| 3.7.1 载基因纳米粒对小鼠血清肝肾生化指标的影响 |
| 3.7.2 载基因纳米粒对小鼠各组织结构的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 载基因壳聚糖纳米粒制备条件及优化结果 |
| 4.2 载基因纳米粒特性研究 |
| 4.3 载基因纳米粒体内外转染及胃肠道定位和表达 |
| 4.4 载基因纳米粒体内外毒性 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间研究成果 |
| 综述 甘露糖化壳聚糖纳米粒靶向巨噬细胞的应用研究进展 |
| 参考文献: |
（4）阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 基因治疗载体的研究进展 |
| 1.1.1 病毒载体 |
| 1.1.2 细菌载体 |
| 1.1.3 人工合成载体 |
| 1.1.4 结语与展望 |
| 1.2 神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 神经母细胞瘤的发生及流行病学 |
| 1.2.2 神经母细胞瘤分子生物学特征及动物研究模型 |
| 1.2.3 神经母细胞瘤的临床表现及分期分层 |
| 1.2.4 神经母细胞瘤的治疗 |
| 1.2.5 结语与展望 |
| 1.3 GRIM-19的研究进展 |
| 1.3.1 GRIM-19的发现、结构及分布 |
| 1.3.2 GRIM-19的突变及下调与恶性肿瘤的关系 |
| 1.3.3 GRIM-19的功能 |
| 1.3.4 结语与展望 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 PCG阳离子聚合物的合成及转染肿瘤细胞的检测 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 GRIM-19蛋白在神经母细胞瘤组织中的表达 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 阳离子聚合物递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的作用及机制研究 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）腺病毒介导白介素17A为靶点的抗体基因治疗抑制肝癌生长（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 原发性肝癌流行病学 |
| 1.1.2 肝癌诊疗系统概述 |
| 1.1.3 肝癌的治疗药物 |
| 1.1.4 肝癌的基因治疗现状 |
| 1.1.5 抗体治疗与抗体基因治疗 |
| 1.1.6 肝脏环境与肝癌发病机制 |
| 1.1.7 IL-17A是肝癌治疗的潜在靶点 |
| 1.2 课题设计与研究内容 |
| 1.2.1 课题设计 |
| 1.2.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体质粒的构建 |
| 2.2.2 腺病毒包装及纯化 |
| 2.2.3 病毒滴度测定 |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 抗体物理稳定性评价 |
| 2.2.6 抗体体内模拟稳定性评价 |
| 2.2.7 慢病毒载体质粒构建 |
| 2.2.8 慢病毒载体包装及纯化 |
| 2.2.9 慢病毒滴度测定 |
| 2.2.10 高表达IL-17A的肝癌稳定株构建 |
| 2.2.11 免疫印记(Western Blot) |
| 2.2.12 细胞增殖的检测 |
| 2.2.13 细胞凋亡检测 |
| 2.2.14 细胞侵袭检测 |
| 2.2.15 细胞划痕实验 |
| 2.2.16 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.2.17 免疫组化 |
| 2.2.18 稳定株裸鼠肝癌皮下成瘤模型建立及腺病毒载体给药方案 |
| 2.2.19 小鼠活体成像 |
| 2.2.20 数据统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 抗体片段设计、腺病毒载体构建及包装 |
| 3.1.1 抗IL-17A重组抗体片段设计 |
| 3.1.2 携带分泌型抗IL-17A抗体片段序列的载体质粒构建及鉴定 |
| 3.1.3 抗IL-17A抗体片段在mRNA水平的表达 |
| 3.1.4 腺病毒载体包装 |
| 3.2 重组抗体片段功能及稳定性检测 |
| 3.2.1 抗体表达及结合能力验证 |
| 3.2.2 抗体物理稳定性 |
| 3.2.3 抗体体内稳定性 |
| 3.3 AdIL17-sF在体外对肝癌细胞功能的影响 |
| 3.3.1 常用肝癌细胞系IL-17A的表达情况 |
| 3.3.2 高表达IL-17A的肝癌稳定株构建及检测 |
| 3.3.3 AdIL17-sF对细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 AdIL17-sF对细胞凋亡的影响 |
| 3.3.5 AdIL17-sF对细胞侵袭能力的影响 |
| 3.3.6 AdIL17-sF对细胞迁移能力的影响 |
| 3.4 AdIL17-sF体内表达、抑制血管生成及抗肿瘤情况评估 |
| 3.4.1 腺病毒载体在肿瘤组织内表达持续情况 |
| 3.4.2 抗IL-17A抗体片段在肿瘤组织表达情况 |
| 3.4.3 AdIL17-sF对Huh-7-IL17~+小鼠模型的肿瘤抑制作用 |
| 3.4.4 AdIL17-sF对Hep3B-IL17~+小鼠模型的肿瘤抑制作用 |
| 3.4.5 AdIL17-sF抑制皮下肿瘤血管生成 |
| 3.4.6 AdIL17-sF对肿瘤组织内细胞凋亡影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 第六章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1 文章涉及的基因序列 |
| 伦理审查说明 |
| 作者简历及科研成果 |
| 致谢 |
（6）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（7）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（8）基于盐藻外泌体靶向药物递送系统的构建及对食管癌的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 食管癌治疗概况 |
| 1.2 MicroRNA与食管癌 |
| 1.3 基因递送载体 |
| 1.3.1 脂质体 |
| 1.3.2 阳离子聚合物 |
| 1.3.3 无机纳米颗粒 |
| 1.4 天然纳米载体-外泌体 |
| 1.4.1 外泌体简介 |
| 1.4.2 外泌体的形成机制 |
| 1.4.3 外泌体的提取方法 |
| 1.4.4 外泌体药物载体 |
| 1.5 盐藻外泌体的优势 |
| 1.6 国内外研究现状 |
| 研究课题的提出和实验设计 |
| 研究课题的提出 |
| 基于盐藻外泌体的靶向递送系统的设计 |
| 第2章 工程化盐藻外泌体的制备与表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.2.3 仪器表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 加载前后盐藻外泌体的表征 |
| 2.3.2 荧光共定位评估偶联效果 |
| 2.3.3 不同电穿孔条件下药物的加载效率 |
| 2.3.4 工程化盐藻外泌体的生物相容性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 工程化盐藻外泌体对食管癌细胞影响机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 实验步骤 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 食管癌细胞对工程化盐藻外泌体的摄取 |
| 3.3.2 工程化盐藻外泌体对食管癌细胞的增殖、迁移与侵袭影响 |
| 3.3.3 工程化盐藻外泌体对细胞周期和凋亡及基因表达的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 工程化盐藻外泌体对食管癌动物模型影响机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 实验步骤 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 体内靶向性与抗肿瘤效果 |
| 4.3.2 体内生物相容性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（9）以AKR1C3为靶点的核酸纳米粒子的构建及其靶向抑制去势抵抗性前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 去势抵抗性前列腺癌的研究进展 |
| 1.1.1 概况 |
| 1.1.2 治疗现状 |
| 1.2 AKR1C3 在去势抵抗性前列腺癌发生、发展和耐药中的作用 |
| 1.2.1 AKR1C3 概述 |
| 1.2.2 AKR1C3在PCa进展,转移和耐药中的作用 |
| 1.2.3 AKR1C3在PCa进展、转移、耐药中的作用机制 |
| 1.2.4 AKR1C3 抑制剂的研究 |
| 1.3 CRPC核酸靶向治疗的进展 |
| 1.3.1 核酸类药物解决靶向的进展 |
| 1.3.2 Aptamer肿瘤靶向治疗中的应用 |
| 1.3.3 适配体在各方面的应用 |
| 1.3.4 适配体在临床试验中的最新成果 |
| 1.3.5 结语与展望 |
| 第2章 核酸纳米粒子的构建及表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要药品与试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 核酸纳米粒子的理论基础及实验步骤 |
| 2.3.2 靶向性核酸纳米粒子(PPA/siRNA)表征 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 核酸纳米粒子载体的细胞安全性评价 |
| 2.4.2 选择有效siRNA序列 |
| 2.4.3 核酸纳米粒载体有效结合siRNA |
| 2.4.4 核酸纳米粒子载体(PP)的核磁表征 |
| 2.4.5 核酸纳米粒子(PPA-siRNA)的形貌表征 |
| 2.4.6 核酸纳米粒子(PPA-siRNA)的粒径(size)和电位(zeta)表征 |
| 第3章 核酸纳米粒子的细胞靶向性和有效性评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要药品与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞活性检测 |
| 3.3.3 siRNA转染 |
| 3.3.4 质粒扩增和提取 |
| 3.3.5 质粒转染 |
| 3.3.6 EdU法检测细胞增殖 |
| 3.3.7 细胞蛋白的提取 |
| 3.3.8 蛋白免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 3.3.9 核酸纳米载体的体外靶向性评价实验方案 |
| 3.3.10 核酸纳米粒子的体外靶向性评价实验方案 |
| 3.3.11 核酸纳米粒子对前列腺癌细胞增殖有效性实验方案 |
| 3.4 实验结果 |
| 第4章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及取得科研成果 |
| 致谢 |
（10）静脉注射Ngb转染ADSCs联合瑞格列奈靶向治疗大鼠脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 综述:基因治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、基因治疗中载体的研究进展（论文参考文献）
- [1]组织工程血管化基因治疗的研究进展[J]. 李光照,陈锐,贾洪林,任利玲. 中国组织工程研究, 2022(28)
- [2]共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究[D]. 武静桥. 天津农学院, 2021(08)
- [3]载基因壳聚糖纳米粒的构建及其在胃肠道中的定位和表达[D]. 严丽丽. 南昌大学, 2021(01)
- [4]阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究[D]. 徐阳. 吉林大学, 2020(03)
- [5]腺病毒介导白介素17A为靶点的抗体基因治疗抑制肝癌生长[D]. 邹昊玉. 华东师范大学, 2020(05)
- [6]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [7]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [8]基于盐藻外泌体靶向药物递送系统的构建及对食管癌的作用研究[D]. 史浩. 河南科技大学, 2020(07)
- [9]以AKR1C3为靶点的核酸纳米粒子的构建及其靶向抑制去势抵抗性前列腺癌的实验研究[D]. 姚洲. 吉林大学, 2020(08)
- [10]静脉注射Ngb转染ADSCs联合瑞格列奈靶向治疗大鼠脊髓损伤的实验研究[D]. 胡金金. 遵义医科大学, 2020(12)