一、消炎痛对人胃癌上皮细胞BGC-823的作用（论文文献综述）
李雅娟[1]（2021）在《南蛇藤提取物通过miR-144/451靶向mTOR抑制胃癌EMT的作用及机制》文中认为胃癌（Gastric Carcinoma,GC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一。课题组前期研究证实,与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-144/451的表达量明显降低。运用生物信息学手段预测,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin,mTOR）可能是miR-144/451的分子作用靶点。中草药南蛇藤茎乙酸乙酯提取物（Celαstrus orbiculatus Thunb,COE）为本课题组发明专利,可通过抑制胃癌细胞的上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程,发挥抑制胃癌细胞早期转移的作用,但具体机制尚未阐明。本研究主要研究南蛇藤提取物是否通过miR-144/451靶向mTOR,进而抑制胃癌上皮间质转化过程,对新型抗肿瘤中药的研究与开发有着非常重要的意义。研究内容主要分为三个部分:第一部分 miR-144/451和mTOR与上皮间质转化的关系目的:利用 miR-144/451 敲除（Knockout,KO）小鼠,研究 miR-144/451 和 mTOR 与上皮间质转化的关系。方法:取3只miR-144/451 KO小鼠的胃组织,以同品系野生C57BL/6小鼠的胃组织为对照。提取总蛋白,用Western blot和免疫组化的方法,检测mTOR信号转导通路和EMT相关蛋白的表达量。提取总RNA,利用qRT-PCR法定量检测mTOR的mRNA表达水平。结果:与野生C57BL/6小鼠相比,miR-144/451 KO小鼠胃组织蛋白中E-cadherin的表达量明显降低,Vimentin、N-cadherin、mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt蛋白的表达量均明显增高（P<0.05）;miR-144/451 KO小鼠胃组织总RNA中mTOR的表达显着升高（P<0.05）;免疫组化结果表明,miR-144/451 KO下调E-cadherin的表达,同时Vimentin、N-cadherin和mTOR相关蛋白的表达量上调（P<0.05）。结论:miR-144/451与mTOR和上皮间质转化相关蛋白的表达水平可能有密切关系。第二部分miR-144/451缺失对小鼠自发性胃癌的影响目的:利用miR-144/451 KO小鼠,构建胃炎后自发性胃癌模型,探讨miR-144/451与胃癌发生的关系及分子机制。方法:苯并芘（BaP）以玉米油配制成浓度为5 mg/mL,按10 μL/g体重剂量灌胃。小鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别设为野生型小鼠玉米油对照组、野生型小鼠苯并芘组、miR-144/451 KO小鼠玉米油对照组、miR-144/451 KO苯并芘组。每周2次灌胃,共6周。末次灌胃后,第2周、8周、16周、24周和30周,各组随机处死1只小鼠。取小鼠全胃,沿胃大弯切开,肉眼观察。显微镜下观察组织学变化,采用Western blot和免疫组化法检测胃癌组织中mTOR相关蛋白表达情况,qRT-PCR法检测mTOR的mRNA表达量。结果:野生型C57BL/6小鼠,玉米油对照组,镜下胃粘膜、粘膜下层、肌层、浆膜层境界清晰;经BaP灌胃组有明显的炎症细胞浸润,其它未见明显变化。miR-144/451 KO小鼠,玉米油对照组,胃组织与正常C57BL/6小鼠组接近,而经BaP灌胃的miR-144/451 KO组小鼠,显微镜下发现胃部均出现异常分化现象,达到原位癌级别。Western blot、qRT-PCR和免疫组化结果显示经BaP刺激后mTOR表达水平明显增高,且miR-144/451 KO小鼠体内mTOR表达水平最高（P<0.05）。结论:敲除miR-144/451表达,mTOR的表达水平明显升高,小鼠更易发生胃癌,促进EMT进程。第三部分南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞的影响目的:分别构建高表达miR-144和miR-451的4种人胃癌细胞模型（AGS/miR-144+、AGS/miR-451+、HGC-27/miR-144+、HGC-27/miR-451+）,研究南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞增殖、迁移能力的影响,并探究其分子机制。方法:MTT 法检测 COE（20、40、80、160、320 μg/mL）对人胃癌 AGS/miR-144+、AGS/miR-451+、HGC-27/miR-144+、HGC-27/miR-451+细胞增殖的影响。对数生长期细胞,200 μg/mL COE处理24h后,qRT-PCR法定量mTOR mRNA的表达水平;Western blot法分析COE对mTOR信号转导通路和EMT相关蛋白的影响;Transwell迁移实验考察COE对迁移能力的影响。结果:COE 明显抑制人胃癌 AGS/miR-144+、AGS/miR-451+、HGC-27/miR-144+、HGC-27/miR-451+细胞的增殖,呈时间和浓度依赖性。COE处理后,4种细胞的迁移能力明显受到抑制,E-cadherin的表达量明显升高,同时Vimentin、N-cadherin、mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、4EBP1 和 p-4EBP1蛋白的表达量均明显减低（P<0.05）。结论:COE协同miR-144/451靶向mTOR,通过P13K/Akt/mTOR信号转导通路发挥抑制胃癌细胞上皮间质转化的作用。
周唯[2]（2021）在《基于整合大数据的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌上市后评价研究》文中研究说明研究目的胃癌和食管癌是我国发病率较高的消化系统肿瘤。目前其治疗方法以放化疗为主。复方苦参注射液是常用的抗肿瘤类中药注射液,具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛之功效,临床上多用于胃癌和食管癌等消化道肿瘤的治疗。本研究在整合大数据理念指导下,综合运用网状Meta分析、网络药理学、生物信息学、分子生物学等研究方法开展复方苦参注射液治疗胃癌和食管癌的临床评价与机制研究,希冀为科学评价其临床疗效和揭示其分子机制提供高质量证据。研究方法1网状Meta分析首先全面检索国内外数据库中复方苦参注射液等抗肿瘤类中药注射剂治疗胃癌、食管癌的随机对照实验文献并依据纳入排除标准遴选文献,进而应用WinBugs1.4和Stata13.0软件对临床总有效率、生活质量改善和不良反应改善等结局指标进行分析,并生成网状关系图、曲线下面积图和三维数据立方体图,从而解析复方苦参注射液与其他同类注射剂相比的治疗优势与特点。2整合生物信息学分析本论文综合运用了网络药理学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、芯片Meta分析、分子对接、经典生物信息学的方法整合分析了复方苦参注射液治疗胃癌、食管癌的作用机制。在复方苦参注射液治疗胃癌的作用机制研究中,首先对GEO和TCGA数据库中的miRNA表达数据进行差异分析并且对其进行靶基因预测,之后应用WGCNA对TCGA中的RNA测序数据和临床信息进行关键模块筛选,根据复方苦参注射液成分靶点和以上胃癌关键信息进行复方苦参注射液干预胃癌的ceRNA网络构建。同时,本研究运用芯片Meta分析对比了关键基因在胃癌组织和正常组织之间的表达差异。利用GO和KEGG富集分析以明确关键基因所涉及的生物调控途径;通过生存分析和免疫浸润分析进一步检测了关键基因对胃癌预后的意义。最后,采用分子对接验证关键基因和复方苦参注射液中相关成分的结合能力。在复方苦参注射液治疗食管癌的机制研究中,首先从GEO数据库中下载食管癌高通量测序芯片数据并进行整合差异分析;其次根据TCGA中的食管癌RNA测序数据进行关键模块构建筛选;最后根据DisgeNET数据进行食管癌疾病靶点的数据搜集。根据以上信息进行网络药理学分析,从而分析复方苦参注射液治疗食管癌的作用机制。3分子生物学实验本研究首先采用MTT和CCK-8方法观察复方苦参注射液对胃癌细胞和食管癌细胞的增殖影响。之后分别应用RT-qPCR和Western blot法检测复方苦参注射液对胃癌细胞及食管癌细胞中mRNA和蛋白表达的影响。同时,本研究采用TMT方法系统研究了复方苦参注射液给药后胃癌细胞蛋白变化情况。研究结果1 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗胃癌临床评价研究本部分研究共纳入随机对照试验文献68篇,涉及8种抗肿瘤类中药注射剂,相关胃癌患者5525名。网状Meta分析结果显示,与对照组仅用FOLFOX相比,联合使用复方苦参注射液在提高临床总有效率、改善免疫功能指标和生活质量以及减缓不良反应中均具有统计学意义。此外,多指标三维聚类分析结果显示,复方苦参注射液与同类注射液相比在临床疗效和缓解不良反应综合评价中亦有较好排序。2 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗食管癌临床评价研究此部分研究共纳入随机对照试验文献52篇,涉及7种抗肿瘤类中药注射剂,相关食管癌患者3876名。网状Meta分析结果显示,与对照组仅用化疗相比,在提高临床总有效率、改善生活质量、减少恶心呕吐方面复方苦参注射液联合化疗使用成为最优干预措施的概率最大。相关结局指标聚类分析显示,复方苦参注射液在多结局指标评价中亦有明显优势。3 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胃癌作用机制研究采用网络药理学与生物信息学相结合的方法,预测得到复方苦参注射液可能参与调控的ceRNA网络以及复方苦参注射液直接干预胃癌的基因靶点。对胃癌基因表达谱芯片进行 Meta 分析后发现关键基因 AKR1B1,CTSK,MMP2,TLR4,ADRB2,PDE1C和PTGER3在胃癌组织中具有显着差异。生存分析亦显示AKR1B1,MMP2和PTGER3在影响胃癌患者生存率方面具有重要意义。功能富集分析表明复方苦参注射液可以通过激活诸如PI3K-Akt和Toll样受体信号通路等信号通路来抑制癌细胞增殖并调节免疫力,从而治疗胃癌。4 基于整合高通量数据分析的食管癌关键基因研究此部分旨在确定与食管癌的发病机制和预后相关的潜在关键基因。差异分析结果表明,与正常组织相比,癌症组织中共有134个上调和183个下调的差异表达基因并且据此构建蛋白互作网络。根据度值筛选出十个关键基因（AURKA,CDC20,BUB1,TOP2A,ASPM,DLGAP5,TPX2,CENPF,UBE2C和NEK2）。功能富集分析表明,多种细胞外相关条目和ECM-受体相互作用途径均与食管癌密切相关。5 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗食管癌作用机制研究首先应用WGCNA方法研究基因表达数据与食管癌患者临床特征之间的联系,进而结合芯片分析的差异基因、疾病数据库基因和复方苦参注射液成分对应的预测靶标进行网络药理分析。结果显示EGFR、ERBB2、CCND1和AURKA是与复方苦参注射液治疗食管癌相关的核心基因。此外,通过富集分析预测发现,复方苦参注射液还可以调控食管癌中的ERBB信号通路和PI3K-AKT信号通路等相关通路。6 基于蛋白组学分析复方苦参注射液治疗胃癌的分子作用机制本研究采取TMT定量蛋白质组学研究方法来进行复方苦参注射液干预胃癌细胞后的差异表达蛋白质分析。研究发现,共有差异蛋白794个,其中包括上调蛋白490个以及下调蛋白304个。此外,结果发现复方苦参注射液可以通过影响如PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等遏制胃癌进展。7 复方苦参注射液对胃癌细胞和食管癌细胞的作用影响实验结果表明,复方苦参注射液可以抑制胃癌细胞和食管癌细胞的增殖。通过RT-qPCR和Western blot实验证实复方苦参注射液可以抑制胃癌细胞中AKR1B1和MMP2的过表达,还可以上调胃癌细胞中的PTGER3;此外,复方苦参注射液也可以下调食管癌细胞中的EGFR和AURKA的异常高表达。研究结论本论文在整合大数据理念指导下,综合运用临床大数据与生物信息大数据研究方法开展复方苦参注射液临床评价与机制研究。结果显示,复方苦参注射液治疗胃癌、食管癌疗效确切且与同类注射液对比有优势或特色,其核心机制与调控胃癌、食管癌关键基因密切相关。同时,本研究还探索实践了以网状Meta分析、网络药理学、生物信息学、分子生物学实验为主链的中医药整合大数据研究模式,为中药上市后再评价特别是疗效与机制评价的有效联通提供了示范与路径。
李一桐[3]（2021）在《健脾清化化瘀汤对HP相关PLGC大鼠胃黏膜miR-21及其靶基因PTEN表达的影响》文中研究指明背景与目的胃癌是常见的恶性肿瘤之一,我国作为胃癌发病率及死亡率较高的国家,胃癌严重威胁人们群众的生命健康。流行病学研究显示,慢性萎缩性胃炎伴异型增生与胃癌的发生密切相关,是目前公认最主要的胃癌前病变。重度异型增生患者发展为胃癌的机率可达60-80%,但慢性萎缩性胃炎伴异型增生发展为癌变的机制尚不明确。现代医学治疗胃癌前病变只能通过对症治疗,疗效欠佳,而中医药对本病的治疗有确切的疗效和宝贵的经验,其对异型增生的逆转作用,已得到普遍认可。因此,对中医药治疗慢性萎缩性胃炎异型增生的机制进行深入研究,有重要的意义。本团队前期已经研究了健脾清化汤对幽门螺旋杆菌感染相关胃炎的治疗作用,初步发现健脾清化汤可能通过对HSP70/NF-κB通路的调控,减轻幽门螺旋杆菌对胃黏膜细胞的炎性损伤。为后续的进一步研究奠定了理论基础。本实验运用MNNG配合HP感染、雷尼替丁、饥饱失常多因素综合造模法建立慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠模型,选用健脾清化化瘀汤（党参、丹参、莪术、白术、茯苓、甘草、黄连、大黄、蒲公英、白花蛇舌草、三七、土茯苓、陈皮、半夏曲）作为干预药物,观察其对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠一般情况及胃黏膜病理情况的影响,并采用免疫组化及RT-PCR检测miR-21、PTEN基因转录和蛋白表达情况,以探讨健脾清化化瘀汤治疗慢性萎缩性胃炎,逆转异型增生的分子作用机制。方法1.实验分组:将90只雄性SD大鼠按照随机数字表法随机分为6组,包括正常组、模型组、iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤低剂量组、健脾清化化瘀汤中剂量组、健脾清化化瘀汤高剂量组。进行造模前适应性饲养7d。2.造模方法:正常组给予SPF级大鼠标准饲料及饮用水,至实验结束;其余5组每只大鼠用HP菌液灌胃7次,平均2次/周,HP菌液浓度1x109CFU/mL,2ml/只。其后给予大鼠正常食水2周以便于HP定植,进行13C尿素呼气实验以确认HP感染。确认HP感染后,除正常组外,其余5组大鼠予150ug/ml MNNG溶液灌胃,3ml/只,频率5次/周,同时予100ug/ml MNNG溶液自由饮用,配合饥饱失常法（2d足量饲料喂养,1d禁食）,5组大鼠均予0.03%雷尼替丁饲料喂养,持续造模28周。3.干预方法（1）正常组、模型组给予普通饲料及饮用水,可以自由摄食摄水,运用生理盐水进行灌胃,1次/d,不给予其他任何干预。（2）健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组按照《药理实验方法学》中规定,分别以8.35g/（kg·d）、16.70 g/（kg·d）、33.39 g/（kg·d）剂量进行中药灌胃治疗,1 次/d,灌胃前禁食4h,其余时间可自由摄食摄水,均为普通饲料及饮用水。干预持续10周。（3）iNOS抑制剂组以氨基胍溶液50mg/（kg·d）剂量进行灌胃干预,1次/d,灌胃前禁食4h,其余时间可自由摄食摄水,均为普通饲料及饮用水。干预持续10周。4.检测及方法:治疗10周后处死大鼠,迅速取材胃组织,运用HE染色观察大鼠胃黏膜病理变化;运用免疫组化法检测胃组织PTEN蛋白表达,并计算AOD值;运用RT-PCR法检测胃组织 miR-21、PTEN mRNA 表达。结果1.一般情况:药物干预阶段,正常组大鼠形体肥胖,反应灵敏,精神良好,饮食、饮水量正常,毛色光亮,有光泽,爪甲、唇周颜色正常;模型组反应迟钝,精神萎靡,偶有易激惹,饮食、饮水量明显减少,毛色散暗,无光泽,爪甲唇周颜色淡白;健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组及iNOS抑制剂组大鼠状态较正常组精神欠佳,饮食水量略少,但状态均优于模型组,中药治疗组及iNOS抑制剂组干预阶段大鼠一般情况未见明显差异。正常组、iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤高剂量、中剂量组大鼠体质量整体呈上升趋势,模型组及健脾清化化瘀汤低剂量组大鼠体质量略有下降。2.胃黏膜病理变化:造模组大鼠胃黏膜可见粘膜层变薄,腺体数量减少,腺体排列紊乱,慢性炎性细胞浸润,可达黏膜肌层,可见杯状细胞,细胞形态不一,细胞核出现异常。干预治疗10周后,健脾清化化瘀汤高、中剂量组、iNOS组肉眼及及镜下较模型组有不同程度改善,可见腺体排列相对规则,腺体数目尚可,肠上皮化生及异型增生较少见。健脾清化化瘀汤低剂量组胃黏膜好转不明显。3.PTEN蛋白表达量比较:与正常组相比,模型组PTEN蛋白表达显着降低（P<0.01）;与模型组相比,健脾清化化瘀汤中、高剂量组、iNOS抑制剂组PTEN蛋白表达上调（P<0.05;P<0.05;P<0.01）,健脾清化化瘀汤低剂量组PTEN蛋白表达无差异（P>0.05）;4.miR-21表达量比较与正常组相比,模型组miR-21表达显着升高（P<0.001）;与模型组相比,健脾清化化瘀汤中、高剂量组、iNOS抑制剂组miR-21表达下调（P<0.001;P<0.001;P<0.001）,健脾清化化瘀汤低剂量组miR-21表达无差异（P>0.05）;5.PTEN mRNA表达量比较与正常组相比,模型组胃黏膜中PTEN mRNA表达显着下调（P<0.001）;与模型组相比,健脾清化化瘀汤中、高剂量组、iNOS抑制剂组大鼠胃黏膜PTEN mRNA表达上调（P<0.001;P<0.001;P<0.001）,健脾清化化瘀汤低剂量组PTEN mRNA表达无差异（P>0.05）。结论1、健脾清化化瘀汤可有效改善慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠一般情况,缓解胃黏膜病变,可能逆转异型增生,阻断胃癌前病变向胃癌进展。2、健脾清化化瘀汤可能通过下调胃黏膜miR-21表达,从而解除miR-21对抑癌基因PTEN表达的抑制,提高PTEN的表达,进一步调控PTEN下游信号通路,达到治疗CAG伴异型增生的作用。3、miR-21可能是胃癌前病变发病的关键因素,可能是治疗CAG异型增生的潜在重要靶点。
叶仲昊[4]（2021）在《预知子功效物质分离及其诱导胃癌细胞凋亡的机制研究》文中研究指明目的:本研究旨在探索消癌解毒方组成药物之一——预知子的功效物质成分及其诱导胃癌BGC-823细胞凋亡的作用机制。通过提取分析预知子的有效成分,筛选其抗肿瘤活性部位,观察其对人胃腺癌细胞BGC-823的增殖、凋亡的影响,并探讨预知子活性部位的抗肿瘤作用机制。研究结果将为预知子功效物质成分的发现及预知子的抗肿瘤作用机理提供实验依据,并为消癌解毒方防治胃癌的作用机制研究提供线索。方法:1.预知子提取和分离过程及活性部位筛选将预知子以无水乙醇浸泡,过滤后用旋转蒸发仪减压浓缩得到粗浸膏。将粗浸膏分散于5L纯水中,用不同极性的溶剂石油醚、乙酸乙酯分别萃取,再经减压浓缩,最终得到乙酸乙酯层。将预知子乙酸乙酯萃取物以反相硅胶（C18）干法拌样,进行低压柱层析（C18）分离,以TLC检测,合并相同的馏分。经体外细胞实验筛选确定活性部位,并对预知子活性部位进行液相检测及质谱分析。2.预知子活性部位对胃癌细胞增殖影响选择胃腺癌细胞株BGC-823,以MMT法确定预知子活性部位的IC50。并以MTT、EDU和流式细胞术等技术方法。观察预知子活性部位对BGC-823细胞的细胞形态、生存、增殖和凋亡的影响。3.预知子活性部位对胃癌细胞作用机制研究收集各组BGC-823细胞,流式细胞学检测其被预知子活性部位干预后,线粒体膜电位的变化。分离提取各组BGC-823细胞中的细胞总蛋白、细胞浆蛋白、及线粒体蛋白。以蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测 ERK、BAD、BCL-2、BAK、caspase-3、细胞色素 C 和AIF等蛋白的表达水平,以发现和阐明预知子活性部位诱导人胃癌细胞BGC-823的作用机制。结果:1.将预知子乙酸乙酯萃取物以反相硅胶（C18）干法拌样,进行低压柱层析（C18）分离,以TLC检测,合并相同的馏分,最后得到25个馏分,记为B1-B25。经体外细胞实验筛选,确定B14组分为活性部位。2.以α-常春藤皂苷为标准品对照,经液相检测分析发现,B14活性部位中主要包含两种化合物,其中α-常春藤皂苷约占37%左右,另一成分尚未明确。虽然我们以液质联用扫描了 B14的氢谱与碳谱,但因B14纯度问题,与化合物库对比,仍未能明确另一种成分。3.经过预知子活性部位B14刺激后,胃癌细胞BGC-823发生显着形态学改变,细胞的活力及增殖受到显着抑制,并且发生了细胞凋亡,且上述抑制作用与B14浓度呈正相关。前期转录组测序实验中我们发现B14可上调AIF的mRNA表达,经生物学重复得以验证,因此我们认为,B14的作用机制很可能是通过调控AIF及其相关信号通路介导线粒体凋亡途径,促使肿瘤细胞凋亡。4.预知子活性活性部位B14诱导了BGC-823细胞线粒体膜电位发生去极化。这种去极化的发生可能与促凋亡基因Bak、Bax、Bad的表达上调、抗凋亡基因Bcl-2的表达下调相关。其中Bad的上调,可能是由于Erk信号通路的抑制导致Bad被磷酸化并向线粒体转移所致。线粒体膜通透性的改变促使线粒体中促凋亡因子释放:其中细胞色素C表达发生上调,其上调又激活了 Caspase-3;独立于Caspase家族的凋亡诱导因子AIF的表达同时升高,在两者的共同作用下,诱导BGC-823细胞的凋亡。提示B14可通过调节Erk信号通路,促使Bcl-2家族中促凋亡基因表达上调,导致线粒体凋亡发生,从而抑制胃癌细胞增殖。我们的研究发现这将为预知子的功效物质成分的进一步研究提供线索,为消癌解毒方的抗肿瘤应用研究提供理论依据。结论:预知子活性部位B14主要包含α-常春藤皂苷及另一种未明确成分。其作用机制可能是通过抑制Erk通路,影响其下游的线粒体凋亡通路上的关键靶点,造成肿瘤细胞凋亡,从而实现抑制肿瘤的效果。
薛松磊[5]（2021）在《脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响》文中研究表明脐带间充质干细胞,是来源于脐带组织间质华通氏胶的一种具有多能性的干细胞。由于其免疫原性低,易于获得组织用于培养,也无伦理争议,逐渐成为干细胞研究领域的研究热点。同时,近年来外泌体的研究也在逐渐展开,其特殊的膜结构,可靶向标记的特性,正在不断应用于各项临床研究中。已有研究表明,脐带间充质干细胞及其外泌体,可以用于多种临床研究中,包括创伤愈合、脊髓损伤、术后康复、神经系统疾病、自身免疫性疾病等。但是,脐带间充质干细胞及其外泌体在肿瘤治疗中的作用和功能,及其分子机制仍不甚明了。本研究以脐带间充质干细胞及其外泌体作为研究对象,通过与肿瘤细胞共培养和仅用外泌体处理方式,观察对10个肿瘤细胞系的体外表型和体内生长特性的影响,并利用高通量测序技术分析基因表达的变化,进而阐明脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞的生物学功能和作用,为该技术临床治疗方面的应用提供实验基础。1.脐带间充质干细胞的分离培养和特性探究本章节中,成功分离培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测分析,显示高表达PE标记的CD73、CD90和CD105,几乎不表达FITC标记的CD11b、CD34、CD45和HLA-DR,符合干细胞表面抗原表达特性。可以定向诱导分化为:成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞,同时,使用两种β-巯基乙醇法都可以获得神经元样分化的细胞,表明其具备多向分化能力。在组织工程学应用探索中,脐带间充质干细胞不但可以与聚乳酸膜共培养,并且可以正常贴附和生长,表明它可以用于组织工程学。随后在增殖潜能探索中,使用表观遗传学的试剂处理,结果显示处理后有效地提高了细胞传代数和获取量,其中地西他滨5-Aza-2’-Deoxycytidine（DAC）最佳处理方案是1.25μM处理3h,曲古抑菌素TrichostatinA（TSA）最佳的处理方案是50ng/mL处理12h。综上,本研究分离获取的脐带间充质干细胞,符合间充质干细胞的生物学特性和标准,可以用于进一步的生物学和医学研究。2.脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定本章节通过无血清培养基培养本实验室自主分离的人脐带间充质干细胞,获取外泌体,并进行了鉴定。通过差速离心法和试剂盒提取法从上清提取间充质干细胞外泌体。使用透射电镜扫描,结果样本中都观察到典型杯帽状形态的外泌体。NTA粒径分析显示两种方法都获得的外泌体,都符合外泌体30～150nm粒径阈值特征。WB检测外泌体特征性表达蛋白,结果显示外泌体特异表达Tsg101、CD9和CD63蛋白,符合外泌体的特性。综上所述,本研究成功获得脐带间充质干细胞外泌体,可以用于进一步的实验研究。3.脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响在本章节中,采用了 Transwell插件共培养和直接添加外泌体两种方式处理肿瘤细胞,研究脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响。在体外细胞学实验中,本研究评价10种肿瘤细胞处理后的增殖、迁移、侵袭的能力,以及细胞周期的改变。结果显示,对于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7,都有促进增殖、迁移和侵袭,改变细胞周期的趋势,其中对MCF7迁移影响不显着;对于胃癌细胞系AGS和BGC-823,都有促进增殖、迁移和侵袭的趋势,其中对BGC-823细胞周期改变不显着;对人肠癌细胞系HCT116和SW480,都有促进增殖和侵袭,改变细胞周期的趋势,其中对HCT116迁移是抑制作用,SW480在共培养48h与对照组有显着差异;对于人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2,都有促进增殖、迁移和侵袭的趋势,其中对SMMC-7721细胞周期改变不显着;对于人食管癌细胞系KYSE-150有促进增殖、迁移和侵袭,改变细胞周期的趋势;对于人肺癌细胞系A549有促进增殖和迁移,改变细胞周期的趋势,对侵袭影响不显着。筛选处理后肿瘤细胞表型特征改变明显,且成瘤性好的肿瘤细胞,用于裸鼠成瘤实验。结果显示,两种处理都不同程度促进肿瘤生长,其中对于食管癌细胞系KYSE150,干细胞共培养作用高于外泌体;对于胃癌细胞系AGS,外泌体处理对于促进肿瘤生长作用越来越显着,共培养则相反;对于肠癌细胞系HCT116两种处理趋势一致。综上,本研究获得了脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞影响的表型结果,其中HCT116表现出了促进增殖和侵袭,抑制迁移,改变细胞周期的表型。4.转录组测序检测脐带间充质干细胞及其外泌体对HCT116基因表达的影响在本章节中,本研究通过RNA-seq转录组测序技术,对肠癌细胞系HCT116进行基因表达检测和分析。首先,提取3个处理组细胞的RNA,即正常对照组HCT116、脐带间充质干细胞处理组HCT116-MSC、外泌体直接处理组HCT116-EXO,随后构建文库进行RNA-seq,并进行基因表达谱分析。数据分析分为三个组:HCT116-EXO相对于 HCT116,HCT116-MSC 相对于 HCT116,HCT116-EXO 相对于 HCT116-MSC。结果显示,3组分别筛选到1531个、186个和450个差异表达基因。进一步GO分析显示这些差异基因主要涉及的RNA转录调节、凋亡抑制、血管形成、厌氧反馈、细胞增殖、细胞迁移等生物学过程。同时,对这些差异基因KEGG富集分析结果显示这些基因被富集到轴突导向、白细胞跨内皮迁移、昼夜节律、IL-17信号通路、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、MAPK、细胞因子、Hippo、TNF、Rap1调节干细胞多能性的信号通路、p53等信号通路。在3个组别中,筛选出44个共表达的差异基因,进行GO和KEGG分析,结果显示这些基因集中于细胞厌氧反馈、细胞增殖、DNA复制、衰老、伤口反馈等生物学过程,富集于的破骨细胞分化、IL-17、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、糖尿病、HIF、缺氧诱导信号通路、细胞因子、p53等关键信号通路。进一步的利用String和Cytoscape进行差异基因的互作分析,发现BMP4、SERPINE1、JUN等基因,可能在脐带间充质干细胞及其外泌体对HCT116影响中起到关键作用。上述研究表明在HCT116细胞中,这些基因参与对细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭等相关通路调节,导致表型的改变。综上所述,本研究成功分离了脐带间充质干细胞及其外泌体。其对10种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭主要趋势是促进作用,同时都改变细胞周期。对HCT116细胞是促进增殖和侵袭,抑制迁移,改变细胞周期的作用。RNA-seq分析结果表明,脐带间充质干细胞及其外泌体处理HCT116后,筛选的差异基因涉及细胞厌氧反馈、细胞增殖、DNA复制、衰老、伤口反馈等生物学过程,影响了破骨细胞分化、IL-17、有碳代谢、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、糖尿病、HIF通路、缺氧诱导信号通路、细胞因子受体互作、线粒体自噬、p53等通路。通过String和Cytoscape对差异基因的互作分析,发现BMP4、SERPINE1、JUN等差异表达基因。
李亚[6]（2020）在《新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究》文中研究说明我国是胃癌大国,中西医结合治疗是我国胃癌综合治疗的独特模式。临床实践证实采用新加良附方（高良姜、香附、穿山龙）联合化疗针对进展期胃癌较单纯化疗具有更高的临床缓解率和更优的生活质量。机制研究发现新加良附方抗胃癌作用与调控凋亡相关基因表达有关,但其上游调控机制尚未明确。基于前期基础,本研究拟从microRNA角度,深入探讨新加良附方及穿山龙主要成分薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路及miR-34a凋亡相关靶基因的调控作用和对凋亡信号通路的激活作用,明确新加良附方及薯蓣皂苷元的作用机制,为新加良附方治疗胃癌提供基础研究依据。目的通过体内外实验明确新加良附方及成分薯蓣皂苷元对人胃癌细胞功能的抑制作用,基于miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路,明确新加良附方及薯蓣皂苷元抗胃癌作用机制。方法1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究①新加良附方及薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:CCK-8实验检测新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞增殖的作用,流式细胞术检测新加良附方及薯蓣皂苷元对胃癌细胞周期及凋亡的调控作用,划痕实验检测新加良附方抑制胃癌细胞迁移作用;②新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:qPCR检测正常胃黏膜上皮细胞及胃癌细胞miR-34a表达,慢病毒感染构建过表达mi R-34a的胃癌HGC-27细胞,CCK-8方法检测过表达miR-34a胃癌HGC-27细胞增殖功能,划痕实验检测过表达mi R-34a胃癌细胞迁移能力,并通过qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a基因水平影响;③新加良附方、薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:qPCR方法检测过表达miR-34a后HGC-27细胞miR-34a/SIRTl/p53通路及miR-34a靶基因表达水平,qPCR方法检测新加良附方、薯蓣皂苷元对miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a靶基因及Caspase凋亡通路的作用,Western blot检测新加良附方、薯蓣皂苷元对Caspase凋亡通路作用。2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究BSP方法检测胃癌细胞miR-34a甲基化水平,并构建HGC-27胃癌细胞荷瘤小鼠模型,设正常对照组、模型组、新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、5-Aza-CdR组、中剂量联合组及高剂量联合组,药物干预18天,观察裸鼠一般状态;测量移植瘤长短径,计算瘤体积和抑瘤率,观察裸鼠生存期;qPCR方法检测miR-34a表达情况;Western blot方法检测miR-34a/SIRT1/p53相关蛋白表达及Caspase凋亡通路情况。结果1.新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验:新加良附方呈浓度及时间依赖性地抑制HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖;新加良附方提高G1期HGC-27细胞,降低G2期细胞;新加良附方可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;与对照组比较,新加良附方组除24h 4mg/mL浓度外,其余各组均可抑制胃癌HGC-27细胞迁移功能,作用呈时间及浓度依赖性;新加良附方可显着抑制MGC80-3细胞迁移功能,作用呈时间依赖性,差异有统计学意义;各浓度新加良附方24h及48h均可抑制AGS细胞迁移;薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验:薯蓣皂苷元呈时间及浓度依赖性地抑制胃癌HGC-27、MGC80-3及AGS细胞增殖作用,差异有统计学意义;薯蓣皂苷元干预后胃癌细胞周期无明显改变;薯蓣皂苷元可诱导HGC-27及MGC80-3细胞凋亡,其中诱导HGC-27细胞凋亡作用显着;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用:HGC-27、MGC80-3及AGS细胞中miR-34a相对表达量显着低于正常细胞GES-1,p<0.05;与阴性对照组相比较,过表达miR-34a后,HGC-27细胞增殖能力受到显着抑制,并可显着抑制其迁移能力;新加良附方及薯蓣皂苷元干预后,HGC-27及AGS细胞miR-34a表达水平升高,p<0.01;新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究:过表达miR-34a显着上调p53并下调SIRT1表达水平,可提高Bax及Caspase-3 mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平;新加良附方及薯蓣皂苷元干预可提高p53表达,降低SIRT1表达水平,并可上调Bax及Caspase-3的mRNA表达水平,降低Bcl-2及Survivin的mRNA表达水平,p<0.01,差异有统计学意义;Z-VAD-FMK可降低新加良附方及薯蓣皂苷元诱导的HGC-27细胞凋亡;新加良附方作用后可降低Caspase-9、Caspase-3前体水平,升高活化Caspase-3的表达水平;2.新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究胃癌细胞HGC-27在miR-34a各位点甲基化水平均较高,选取HGC-27细胞构建胃癌荷瘤小鼠模型,药物干预后观察到新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及中剂量联合组、高剂量联合组裸鼠状态较好,反应灵敏,活动及饮食、饮水量正常,5-Aza-CdR组裸鼠一般状态较差。5-Aza-CdR组裸鼠体重于实验给药第8天后逐渐下降,第11天其体重低于新加良附方高剂量组,差异有统计学意义,第15天,其体重低于模型组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组及高剂量联合组,p<0.05,第18天,其体重低于其余各组,p<0.05,差异有统计学意义。5-Aza-CdR组抑瘤率为32.08%,与模型组比较,p>0.05,差异无统计学意义,中剂量联合组抑瘤率为35.00%,高剂量联合组抑瘤率为37.18%,与模型组相比较,p<0.05,差异有统计学意义。模型组平均生存时间为46.33±10.50天,新加良附方中剂量组、新加良附方高剂量组、薯蓣皂苷元组、中剂量联合组及高剂量联合组裸鼠均未出现死亡现象,平均生存时间为57.00±0.00天,具有延长荷瘤裸鼠生存时间的趋势,5-Aza-CdR组裸鼠平均生存时间为40.33±7.37天,生存时间较模型组短。除新加良附方中剂量组外,其余各治疗组均可提高胃癌miR-34a表达,以联合组作用最为显着;新加良附方中剂量、高剂量、薯蓣皂苷元及高剂量联合组均可显着增加p53蛋白的表达,且药物干预各组均可显着抑制SIRT1 蛋白的表达,可降低 Bcl-2、Survivin 表达,并提高 Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 及 Caspase-3 底物 Cleaved PARP 蛋白的表达。结论1.miR-34a表达水平异常与胃癌发生密切相关;2.新加良附方可抑制胃癌细胞增殖及迁移、调节细胞周期、诱导凋亡,其成分薯蓣皂苷元可抑制胃癌细胞增殖,并诱导胃癌细胞凋亡,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶基因及激活Caspase凋亡通路相关;3.新加良附方联合5-Aza-CdR可抑制胃癌裸鼠移植瘤生长,并可改善裸鼠一般状态,有维持体重、延长其生存时间的趋势,机制可能与调控miR-34a/SIRT1/p53通路、miR-34a凋亡相关靶蛋白及Caspase凋亡信号通路相关。
王骄[7]（2020）在《宁夏密点麻蜥身体不同部位含药大鼠血清对MGC-803人胃癌细胞的干预作用及机制研究》文中提出目的:本课题从分子生物水平入手,探究宁夏密点麻蜥身体不同部位含药血清干预人胃癌细胞MGC-803的作用及其机制,为临床治疗胃癌提供科学用药依据。方法:实验分为8组:生理盐水组、华蟾素片组、5-Fu组、宁夏密点麻蜥头部组、宁夏密点麻蜥四肢组,宁夏密点麻蜥躯干组、宁夏密点麻蜥全身组、宁夏密点麻蜥尾巴组,每组20只（SPF级雄性SD大鼠）。各组分别给予相应药物,连续灌胃或尾静脉注射1周后,在无菌环境下腹主动脉取血离心制备含药血清,将其与细胞培养液以比例混合后干预人胃癌MGC-803细胞。采用MTT法测定经宁夏密点麻蜥身体不同部位含药大鼠血清干预后体外培养的胃癌MGC-803细胞的OD值计算细胞增殖率;AnnexinV-FITC/PI双染法和流式细胞仪检测各组含药血清对MGC-803细胞凋亡和周期的影响;Western-Blot法检测各组含药血清干预胃癌MGC-803细胞SIRT1、P53后蛋白表达水平。采用SPSS22.0For Windows软件进行统计分析,Graph Pad Prism6.0软件处理图像。结果:1.MTT法检测细胞增殖:与生理盐水组（A组）比较,各药物干预组细胞活力均降低,（P<0.05）;与5-Fu组（B）、华蟾素片组（C组）比较,宁夏密点麻蜥各组细胞活力降低,细胞增殖能力明显受到抑制（P<0.05）;宁夏密点麻蜥头部组（D组）、宁夏密点麻蜥四肢组（E组）、宁夏密点麻蜥躯干组（F组）、宁夏密点麻蜥全身组（G组）、宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）混合比较,各组细胞活力依次降低,以宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）细胞活力最低,细胞增殖能力最低（P<0.05）。2.AnnexinV-FITC/PI双染法对细胞凋亡的影响:与生理盐水组（A组）比较,各药物血清干预组细胞总凋亡率明显增加（P<0.05）;宁夏密点麻蜥头部组（D组）、宁夏密点麻蜥四肢组（E组）、宁夏密点麻蜥躯干组（F组）、宁夏密点麻蜥全身组（G组）、宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）各组细胞总凋亡率大于5-Fu组（B）、华蟾素片组（C组）（P<0.05）;宁夏密点麻蜥头部组（D组）、宁夏密点麻蜥四肢组（E组）、宁夏密点麻蜥躯干组（F组）、宁夏密点麻蜥全身组（G组）、宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）混合比较,凋亡率依次增大,以宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）凋亡率最明显（P<0.05）。3.流式细胞仪检测细胞周期:与生理盐水组（A组）比较,各药物血清组均能将细胞阻滞于S期（P<0.05）;宁夏密点麻蜥各部分组S期细胞比例大于5-Fu组（B）和华蟾素片组（C组）（P<0.05）;宁夏密点麻蜥头部组（D组）、宁夏密点麻蜥四肢组（E组）、宁夏密点麻蜥躯干组（F组）、宁夏密点麻蜥全身组（G组）、宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）混合比较,各组S期细胞比例依次增大,以H组S期细胞比例最大（P<0.05）。4.Western-Blot检测人MGC-803胃癌细胞SIRT1、P53表达水平:各药物干预组与生理盐水组（A组）比较,SIRT1、P53的灰度值均有不同程度降低（P<0.05）;宁夏密点麻蜥身体各部位组与5-Fu组（B）、华蟾素片组（C组）相比较灰度值均有所降低（P<0.05）;宁夏密点麻蜥头部组（D组）、宁夏密点麻蜥四肢组（E组）、宁夏密点麻蜥躯干组（F组）、宁夏密点麻蜥全身组（G组）、宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）混合比较,各组灰度值依次降低,以宁夏密点麻蜥尾巴组（H组）SIRT1、P53的灰度值最低（P<0.05）。结论1.宁夏密点麻蜥身体不同部位含药大鼠血清能够抑制人MGC-803胃癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,促进细胞周期停滞在S期。2.宁夏密点麻蜥身体不同部位含药大鼠血清能够降低人胃癌MGC-803细胞SIRT1、P53蛋白表达,通过影响SIRT1对P53蛋白的去乙酰化作用,而影响癌变进展,发挥抑制肿瘤增长作用。3.宁夏密点麻蜥身体各部位含药大鼠血清对人胃癌MGC-803细胞的干预作用明显,以宁夏密点麻蜥尾巴组效果最明显。
王华[8]（2020）在《基于miRNA介导的信号通路探索化痰散结方抗胃癌的作用及分子机制》文中研究说明目的1.研究化痰散结方对人胃癌细胞MKN45和BCG823裸鼠胃原位移植瘤抑瘤效应的影响。2.探讨化痰散结方相关机制可能是通过miR-506-3p靶向于ERK-2/ETS-1/MMP9相关信号通路及对EMT影响而发挥作用,产生抗胃癌肿瘤作用。方法1.利用实时荧光定量PCR检测胃癌细胞系（BCG823、SGC7901、MKN45及MGC803）has-miR-506-3p表达水平,筛选出表达量相对较高的两种胃癌细胞进行后续实验。2.人胃癌细胞株BCG823和MKN45皮下成瘤,接种在裸鼠幽门部近胃窦处,建立荷瘤裸鼠。随机分组:每种细胞各3组,分别为中药组（化痰散结方）,西药组5-氟尿嘧啶（5-FU）,生理盐水组。3.治疗期间定期监测一般情况,体重变化。6周后,处死荷瘤鼠剥离瘤体,称瘤重,计算抑瘤率,同时观察有无转移情况。荧光定量PCR和Western-Blot检测BCG823和MKN45细胞各组肿瘤组织中miRNA-506-3p、ETS-1、ERK-2、MMP9和E-cad mRNA、蛋白表达情况。结果1.与西药和盐水组比较,中药组能够很好的改善荷瘤鼠精神状态、饮食、活动度等情况。2.各组荷瘤鼠体质量治疗后变化,按动物体质量由高到低是:中药组>盐水组>西药组。3.与盐水组相比较,中药组和西药组瘤体重量差异均有统计学意义（P<0.01）。与西药组比较,中药组瘤重量没有统计学意义。MKN45组织西药组和中药组的抑瘤率分别为54.6%和41.1%,BCG823组织西药组和中药组的抑瘤率分别为57.1%和46.7%。4.qPCR:MKN45组织（1）miR-506-3p:与盐水组比较,中药组和西药组表达上调（P<0.001）;与西药组比较,中药组没有统计学意义。（2）ERK-2:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P≤0.001）;与西药组比较,中药组没有统计学意义。（3）ETS-1:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.05）;与西药组比较,中药组表达降低（P<0.05）。（4）MMP9:与盐水组比较,中药组和西药组没有统计学意义;与西药组比较,中药组没有统计学意义。（5）E-cad:与盐水组比较,中药组和西药组表达升高（P<0.05）;与西药组比较,中药组表达升高（P<0.001）。在BCG823组织内（1）miR-506-3p:与盐水组比较,中药组和西药组表达上调（P<0.001）;与西药组比较,中药组表达上调（P<0.001）。（2）ERK-2:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.001）;与西药组比较,中药组表达降低（P<0.05）。（3）ETS-1:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.001）;与西药组比较,中药组表达降低（P<0.05）。（4）MMP9:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.001）;与西药组比较,中药组表达降低（P≤0.001）。（5）E-cad:与盐水组比较,中药组和西药组表达升高（P<0.001）;与西药组比较,中药组表达升高（P<0.001）。5.Western Blot:MKN45组织内（1）ERK-2:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.05）;与西药组比较,中药组表达降低（P<0.05）。（2）ETS-1:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.05）;与西药组比较,中药组表达降低（P<0.05）。（3）MMP9:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.05）;与西药组比较,中药组表达降低（P<0.05）。（4）E-cad:与盐水组比较,中药组和西药组表达升高（P<0.05）;与西药组比较,中药组表达升高（P<0.05）。在BCG823组织内,MMP9:与盐水组比较,中药组和西药组表达降低（P<0.001）;与西药组比较,中药组表达降低（P<0.05）。E-cad、ERK-2、ETS-1表达结果趋势同MKN45组织相同。结论1.化痰散结方有抑制人胃癌细胞MKN45和BCG823裸鼠胃原位移植瘤的生长,能够改善荷瘤鼠的生活质量。2.化痰散结方能够上调miR-506-3p,以下调ERK-2、ETS-1、MMP9,同时上调E-cad,达到抑制裸鼠胃原位移植瘤生长。
万伯顺[9]（2019）在《柠檬苦素类似物Odoratol对胃癌的作用及潜在机制研究》文中提出恶性肿瘤是全世界死亡的主要原因之一。胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和致死率位居前列。柠檬苦素类化合物是一类具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等广泛药理活性的化合物,主要存在于芸香科和楝科植物的瓜、果核、皮中。Odoratol是一种柠檬苦素类似物,来源于南美香椿、吴茱萸等植物。前期研究证实,柠檬苦素类似物Odoratol对乳腺腺癌（MCF-7）、非小细胞肺癌（NCI-H460）和黑色素瘤（A375-C5）的肿瘤细胞均有细胞毒性作用,作用机制主要通过抑制细胞增殖而不是凋亡。基于此,我们在药物的筛选和预实验后,开展了柠檬苦素类似物Odoratol对胃癌的作用及潜在机制研究。体外研究中,将人胃癌MKN45细胞分组:①溶媒对照组,无任何处理;②低浓度给药组（8 μM）;③中浓度给药组（16 μM）;④高浓度给药组（32μM）:⑤高浓度给药组加抑制剂一组（32 μM+NAC）;⑥高浓度给药加抑制剂二组（32μM+U0126）;柠檬苦素类似物Odoratol溶解于DMSO中,给药组中按照浓度低高依次加入Odoratol并使终浓度达到8 μM、16 μM和32 μM,第五组中同时加入32 的柠檬苦素类似物Odoratol和10 mmol/L的抗氧化剂（ROS清除剂）NAC,第六组中加入32μM的柠檬苦素类似物Odoratol和0.07 μM的抑制剂U0126。MTT实验证实,柠檬苦素类似物Odoratol可以抑制MKN45细胞增殖。然而,Annexin-V PI双染证实Odoratol不能引起MKN45细胞凋亡,因此这引发了我们对其诱导其它死亡方式或者其它药效的研究。进一步的实验证实,Odoratol诱导MKN45细胞明显过量的活性氧（ROS）积累。Transwell和划痕实验证明,odoratol抑制MKN45细胞的侵袭和迁移能力。此外,自噬相关蛋白Beclin-1,Atg5,Atg7表达上调。在odoratol暴露下,轻链3（LC3）-Ⅰ蛋白质转化为LC3-Ⅱ。透射电镜检测证实,Odoratol给药导致自噬体的形成。免疫荧光试验表明,Odoratol给药引起荧光蛋白LC3的点形成。机制实验中,Western blot结果显示,ROS/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路在odoratol活性的内在机制中起着重要的作用。N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）或U0126使用后,能引起自噬、侵袭、转移的相关药效改变,N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）或U0126的使用验证了ROS/MEK/ERK信号传导途径的调节作用。体内研究中,本研究采用了MKN45裸鼠移植瘤模型来检测柠檬苦素类似物Odoratol在体内的抗胃癌增殖作用。将MKN45注射至裸鼠体内,建立MKN45移植瘤模型,待裸鼠体内MKN45移植瘤长到100 mm3时,将30只裸鼠随机分为6组:（1）对照组;（2）低剂量药物组;（3）中剂量给药组;（4）高剂量给药组;（5）阳性药组（5-FU）;柠檬苦素类似物Odoratol尾静脉注射给药,每日一次:低剂量组:12 mg/kg;中剂量组:24 mg/kg;高剂量组:48 mg/kg;对照组给予相同剂量的5%DMSO的无菌生理盐水。阳性药组给予抗肿瘤药物5-FU皮下注射,10 mg/kg,两日一次。实验证实,MKN45移植瘤建立成功,裸鼠未有异常现象。柠檬苦素类似物Odoratol给药后,裸鼠未有呕吐、颤抖、死亡等中毒反应,各组裸鼠体重在实验期间没有差异,而MKN45移植瘤瘤体减小,特别是中、高剂量组抑瘤明显。Ki67免疫组化染色证实,柠檬苦素类似物Odoratol可以降低瘤体细胞增殖。综上所述,本实验证实,柠檬苦素类似物Odoratol可以抑制MKN45细胞体内外增殖,同时,抑制MKN45细胞体外侵袭、转移,可以诱导MKN45细胞自噬水平的升高。自噬在柠檬苦素类似物Odoratol对抗MKN45细胞增殖中起了重要的作用,ROS的生成是柠檬苦素类似物Odoratol产生药理作用的重要基础。而MAPK信号通路之一MEK-ERK信号通路,则介导了柠檬苦素类似物Odoratol调控MKN45胃癌细胞自噬、侵袭、转移的相关药理作用。因此,本研究提出柠檬苦素类似物Odoratol可能进一步发展成用于胃癌临床治疗的抗肿瘤剂。
姜晓燕[10]（2017）在《二烯丙基三硫醚的体内外生物转化、抗肿瘤活性及逆转顺铂诱发肾毒性的初步研究》文中提出研究背景大蒜是百合科葱属类植物,在我国有悠久的药用和食用历史。流行病学研究显示,大蒜的日常食用能减少许多癌症的发生率。近半个多世纪以来,大蒜中各类成分在抗肿瘤方面的研究在一直处于热点状态,目前已有部分文献记载了众多含硫化合物在抗癌方面的突出活性,尤其以前列腺癌的研究最为集中,其次是乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌等。据不完全统计,大蒜中的主要成分二烯丙基硫醚（DAS）,二烯丙基二硫醚（DADS）,二烯丙基三硫醚（DATS）,S-烯丙基巯基半胱氨酸（SAMC）等化合物均报道过抗肿瘤方面的研究。而纵观当前已上市的大蒜类产品,如大蒜精油、老蒜提取物、蒜粉胶囊和片剂,这些产品多作为保健品应用,其中,大蒜精油,老蒜提取物因其混合物成分复杂,且含有的有效成分含量较低,严重限制了其疗效的发挥。而市场上少量的大蒜类药品也多作为抗细菌和抗真菌类药物应用,其市场销售量小,未见其在如抗肿瘤等更为广泛的临床应用,究其原因是缺乏更为深入且规范的研究。综合分析现有文献的研究,可总结出以下缺点:首先是对于目标化合物的选择过于随机。如现有文献中就有报道DAS、DADS、DATS、AMDS、SAC、SAMC,甚至有黑蒜提取物、蒜粉等混合物成分的抗癌作用,少有在结构上探讨过构效和量效关系的描述,亦少有兼顾其溶解度、稳定性以及代谢转化等方面的综合考量;其次,部分研究仅仅在细胞模型评价了各类化合物的抗肿瘤效果,进而探讨各类信号通路机制。由于细胞模型过于理想化,且忽略了药物进入体内的吸收、分布、代谢、排泄过程,特别是无法评价其体内免疫调节的作用;再者,偶有文献虽兼顾了体内动物模型的验证,但肿瘤模型的建立过于随意,如移植肿瘤未生长到指定大小或者刚接种即开始治疗流程,甚至在给药过程中,违背体内研究的本意,直接将药物注射在皮下瘤中;最后,绝大部分研究多为单一成分的体内外抗肿瘤研究,少有联合用药的方案研究,且均未考虑有机硫化合物进入体内后的吸收、代谢、分布情况。总之前期研究的不系统和欠规范,使得多数研究结果的应用价值较低。本课题大蒜有机硫目标化合物以及疾病治疗模型的选择是综合考量了化合物的活性、稳定性、毒性以及其流行性病学的统计结果。前期抗肿瘤药物构效关系研究表明,大蒜有机硫化合物中烯丙基和硫元素是药效官能团,其抗癌活性随着硫元素数目的增多而增强,但其稳定性降低、毒性也随之增大,经综合考量后本课题选择了二烯丙基三硫醚（DATS）单一成分作为化合物研究对象。抗肿瘤应用模型的选择是依据流行性病学统计结果,大数据统计数据表明日常大蒜食用在降低胃癌和肺癌发病率上均有着积极的作用。本课题的实验设计旨在综合体内和体外两个方面,对大蒜中含量较高其活性较强的DATS进行了较为深入的药物代谢和抗肿瘤活性评价,其主要研究内容由以下三部分组成:（1）体内外药物代谢研究,（2）抗胃癌和肺癌的药效学临床前评价,（3）与顺铂联合应用以降低顺铂毒副作用的初步研究。本课题弥补了前期研究的缺陷,为后期蒜类有机硫化合物药物的开发利用提供一些有用的实验依据。研究设计及结果（1）大蒜有机硫化合物DATS的体内外代谢及转化途径研究:在药物代谢研究方面,通过单剂量和多剂量给药大鼠DATS,GC-MS分析显示只在血浆中检测到了甲基烯丙基亚砜（AMSO）和甲基烯丙基砜（AMS02）两个代谢产物,并未检测到DATS的底物峰,说明DATS在血液中代谢较快。DATS体外代谢研究采用了大鼠红细胞模型,以HPLC技术对DATS在大鼠体外的代谢产物进行了定性研究,确证了烯丙基硫醇（AM）和DADS两个主要代谢产物;为了解释体内外代谢结果的不一致性,我们对DATS代谢转化途经进行了更为深入的研究。综合文献查阅,推测化合物甲基烯丙基硫醚（AMS）可能为其中间产物。根据甲基化反应原理,验证AM先在血细胞中甲基化生成AMS,后经由肝微粒体氧化反应生成AMSO和AMS02。而DADS已被报道可转化生成 AM。至此,我们得到 DATS → DADS → AM → AMS → AMSO → AMS02 的转化路径。在动力学方面,DATS在体内有一个迅速的代谢过程,致使体内研究上我们检测不到原型药物;但是其代谢产物AMSO,AMS02,在大鼠血浆中有较长的滞留时间。（2）DATS抗胃癌和肺癌的活性研究:利用体外细胞技术评价了 DATS的抗肿瘤活性,选择SGC-7901和BGC-823作为胃癌模型,NCI-H460为肺癌模型,结果显示DATS对这几种肿瘤细胞均有明显的抑制作用,其作用机制通过调节cyclin家族蛋白阻滞细胞周期、激活caspase级联反应、调节bcl-2家族蛋白和MAPK通路诱导细胞凋亡实现的;在体内抗肿瘤评价中,通过构建人源的肿瘤移植瘤模型,严格按照标准操作,即待肿瘤生长到100-200 mm3,进行分组实验,通过评价包括肿瘤体积、相对肿瘤体积以及相对肿瘤生长率在内的主要指标。结果显示,与对照组相比,DATS对肺癌和胃癌移植瘤均有明显的抑制作用,并且裸鼠体重无明显的降低现象。然而,经计算DATS在各肿瘤上的相对肿瘤增长率T/C（%）值,其均未达到低于40%的规范要求,说明DATS虽然具有一定的抗胃癌和肺癌效果,有可能需要与其它抗肿瘤药物联合使用。通过观察阳性对照顺铂（DDP）组后,发现DDP给药5mg/kg,虽然能达到肿瘤的抑制标准,但是其体重有显着性降低,从侧面说明DDP对机体的损伤严重。鉴于蒜类化合物独有的机体防护作用的特点,本课题设计了DDP和DATS联合治疗方案,结果显示,DATS不仅具有增强DDP疗效的作用,而且DATS联用明显抑制了 DDP单用时引起的体重降低的现象。（3）DATS及其活性代谢产物逆转顺铂诱发的肾毒性研究:顺铂在临床上存在多种副作用,其中肾毒性是临床中十分常见的不良反应。因此,本部分着重研究DATS联合DDP在改善肾毒方面的积极作用。通过构建DDP诱发的BALb/c小鼠肾损伤模型,研究DATS对其防治作用,结果显示,DATS预处理给药后,有效降低DDP引起的肾功能异常,如调节炎症因子的表达,修复肾组织中肾小管周围的损伤和炎症。在机制研究方面,选择人肾小管上皮细胞HK-2作为体外模型,经细胞活力检测显示DATS在体外研究中不具备保护肾细胞的作用。考虑DATS进入体内后形成的其他代谢产物。经过GC-MS检测全血样本和肾组织匀浆样本,确认血液、肾组织中均存在一定量的AMS02。由此本课题以AMS02作为研究目标,细胞活性实验表明其对HK-2细胞基本没有杀伤作用,且联用DDP后,能明显增加细胞活率。此外,AMS02可有效的调节caspase蛋白减少细胞凋亡的发生,显着抑制炎症介质COX-2的产生,以及调节MAPK（包括ERK,JNK,p38）和NFκB通路减少细胞内ROS的异常积累,这些均是AMS02缓解DDP对HK-2细胞毒性损伤的重要机制。此外,在验证MAPK特异性抑制剂的作用时,以JNK和ERK的抑制剂有明显的增加细胞活率和降低细胞凋亡发生的作用。由此说明,JNK和ERK可能是AMS02发挥作用的关键因子。结论本课题综合利用体内外多种代谢模型研究了 DATS的生物转化路径,并鉴定了主要代谢产物;DATS的体外和裸鼠体内抗肿瘤活性规范化研究结果表明其抗胃癌和肺癌的疗效没有达到相对肿瘤增长率T/C（%）值低于40%的规范要求;依据DATS抗肿瘤作用特点,本课题创造性地提出了联合顺铂给药的治疗方案,并验证了 DATS在提高顺铂疗效方面的积极作用;最后,探究了 DATS在缓解顺铂诱发肾毒性方面的积极作用;同时发现了 DATS活性代谢产物AMS02降低肾毒性方面的作用。本研究为大蒜类有机硫化合物的进一步药用开放提供了药物代谢和药效学方面的理论和实验参考数据。
二、消炎痛对人胃癌上皮细胞BGC-823的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、消炎痛对人胃癌上皮细胞BGC-823的作用（论文提纲范文）
（1）南蛇藤提取物通过miR-144/451靶向mTOR抑制胃癌EMT的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-144/451和mTOR与上皮间质转化的关系 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 主要仪器及耗材 |
| 1.4 引物及序列 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Western blot实验 |
| 2.2 qRT PCR实验 |
| 2.3 免疫组织化学方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 miR-144/451 KO小鼠胃组织EMT相关蛋白的表达量 |
| 3.2 miR-144/451 KO小鼠胃组织mTOR信号转导通路相关蛋白的表达 |
| 3.3 miR-144/451 KO小鼠胃组织mTOR mRNA的表达 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分miR-144/451缺失对小鼠自发性胃癌的影响 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验药品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 引物及序列 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 药品准备 |
| 2.2 构建miR-144/451敲除的C57BL/6小鼠胃炎模型 |
| 2.3 小鼠培养 |
| 2.4 Western blot实验 |
| 2.5 qRT-PCR实验 |
| 2.6 免疫组织化学方法 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 小鼠胃组织的外观变化 |
| 3.2 miR-144/451 KO对小鼠发生自发性胃癌的影响 |
| 3.3 EMT相关蛋白的表达变化 |
| 3.4 胃组织mTOR相关蛋白的表达变化 |
| 3.5 mTOR mRNA的表达情况 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 南蛇藤提取物对高表达的miR-144/451的人胃癌细胞的影响 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 主要仪器耗材 |
| 1.5 主要试剂的配制 |
| 1.6 引物及序列 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细胞总RNA提取 |
| 2.3 miRNA反转录 |
| 2.4 PCR实验 |
| 2.5 MTT实验 |
| 2.6 Western blot实验 |
| 2.7 Transwell小室迁移实验 |
| 2.8 数据处理 |
| 3. 结果 |
| 3.1 成功构建高表达miR-144/451的人胃癌AGS和HGC-27细胞 |
| 3.2 高表达miR-144/451的人胃癌细胞中mTOR mRNA的表达水平 |
| 3.3 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.4 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞中mTOR的mRNA的影响 |
| 3.5 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞中mTOR相关蛋白的影响 |
| 3.6 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞中EMT相关蛋白的影响 |
| 3.7 南蛇藤提取物对高表达miR-144/451的人胃癌细胞迁移能力的影响 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 miRNA在胃癌相关mTOR信号通路中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）基于整合大数据的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌上市后评价研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 复方苦参注射液治疗胃癌的研究进展 |
| 综述二 复方苦参注射液治疗食管癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌临床评价研究 |
| 第一节 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗胃癌临床评价研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 基于网状Meta分析的复方苦参注射液治疗食管癌临床评价研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌作用机制研究 |
| 第一节 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗胃癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 基于整合高通量数据分析的食管癌关键基因研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 基于网络药理学的复方苦参注射液治疗食管癌作用机制研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌相关作用机制实验研究 |
| 第一节 复方苦参注射液干预胃癌细胞实验研究 |
| 1 仪器与器材 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 基于蛋白组学的复方苦参注射液治疗胃癌作用机制研究 |
| 1 仪器与器材 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 复方苦参注射液干预食管癌细胞实验研究 |
| 1 仪器与器材 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（3）健脾清化化瘀汤对HP相关PLGC大鼠胃黏膜miR-21及其靶基因PTEN表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 字符缩略表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 MicroRNA在胃癌中的研究进展 |
| 1 microRNA简介 |
| 2 microRNA与胃癌 |
| 3 microRNA与幽门螺旋杆菌 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌前病变的西医研究进展及mir-21和PTEN的作用机制 |
| 1 胃癌前状态与胃癌前病变 |
| 2 现代医学对胃癌前病变病因的认识 |
| 3 胃癌前病变的诊断 |
| 4 胃癌前病变的治疗 |
| 5 胃癌前病变动物模型的研究 |
| 6 miR-21、PTEN及PI3K/AKT信号通路 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 中医对胃癌前病变的研究进展 |
| 1 中医对胃癌前病变概念的认识 |
| 2 中医对胃癌前病变病因病机的认识 |
| 3 现代中医治疗胃癌前病变的研究进展 |
| 4 中医药治疗胃癌前病变的机制研究 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 前言 |
| 第一部分 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 第二部分 结果 |
| 1 大鼠一般情况 |
| 2 大鼠胃黏膜情况 |
| 3 免疫组化法检测胃组织PTEN蛋白表达 |
| 4 RT-PCR检测胃组织miR-21及PTEN mRNA的表达 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 健脾清化化瘀汤方药探讨 |
| 2 阳性对照药的选择依据 |
| 3 健脾清化化瘀汤对CAG伴异型增生大鼠一般行为学及体质量的影响 |
| 4 健脾清化化瘀汤对CAG伴异型增生大鼠胃黏膜的影响 |
| 5 健脾清化化瘀汤对CAG伴异型增生大鼠miR-21及其靶基因PTEN的影响 |
| 6 对胃癌前病变大鼠模型制备的思考 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（4）预知子功效物质分离及其诱导胃癌细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 中医对胃癌的认识 |
| 1.1 中医病名探讨 |
| 1.2 病因病机、辨证分型及治则治法 |
| 2. 现代医学对胃癌的认识 |
| 2.1 胃癌的病因、发病机制与治疗 |
| 2.2 线粒体凋亡与肿瘤 |
| 2.3 ERK信号通路与Bcl-2家族与线粒体凋亡 |
| 2.4 AIF蛋白与线粒体凋亡 |
| 3. 癌毒病机理论 |
| 4. 预知子的研究现状 |
| 第二部分 预知子活性部位的提取,筛选及作用研究 |
| 1. 预知子活性部位的提取、筛选 |
| 1.1 实验方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 2. 预知子有效部位B14对BGC-823细胞干预作用研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 预知子有效部位B14对BGC-823细胞干预作用机制的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验器材 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞的复苏、培养、传代和冻存 |
| 2.2 流式细胞术检测线粒体膜电位 |
| 2.3 细胞总蛋白的提取 |
| 2.4 细胞线粒体蛋白的提取 |
| 2.5 BCA测定总蛋白浓度 |
| 2.6 免疫印迹法分析蛋白表达差异 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 流式细胞术检测B14对BGC-823细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.2 B14对BGC-823细胞ERK1/2蛋白表达的影响 |
| 3.3 B14对BGC-823细胞Bcl-2家族蛋白表达的影响 |
| 3.4 B14对BGC-823细胞中细胞色素C、Caspase3蛋白表达的影响 |
| 3.5 B14对BGC-823细胞中AIF蛋白表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词(Abbreviation) |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 干细胞研究进展 |
| 1.1.1 干细胞的分类 |
| 1.1.2 干细胞的特性 |
| 1.1.3 干细胞的应用 |
| 1.2 间充质干细胞的研究进展 |
| 1.2.1 间充质干细胞的定义 |
| 1.2.2 间充质干细胞的特性 |
| 1.2.3 间充质干细胞的应用 |
| 1.3 脐带间充质干细胞及其外泌体的特性 |
| 1.3.1 脐带间充质干细胞的分离和鉴定 |
| 1.3.2 脐带间充质干细胞的生物学特性 |
| 1.3.3 脐带间充质干细胞外泌体的特性 |
| 1.4 间充质干细胞及外泌体的应用 |
| 1.4.1 在衰老和损伤性疾病治疗中的应用 |
| 1.4.2 在免疫缺陷和代谢性疾病中的应用 |
| 1.4.3 在癌症和肿瘤治疗中的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义和主要内容 |
| 1.5.1 本研究的目的意义 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 |
| 第2章 脐带间充质干细胞的分离和鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 脐带间充质干细胞的分离 |
| 2.3.2 脐带间充质干细胞的培养 |
| 2.3.3 诱导脐带间充质干细胞成骨分化 |
| 2.3.4 诱导脐带间充质干细胞成脂分化 |
| 2.3.5 诱导脐带间充质干细胞成软骨分化 |
| 2.3.6 诱导脐带间充质干细胞成神经元分化 |
| 2.3.7 BD流式细胞仪鉴定表面标记 |
| 2.3.8 脐带间充质干细胞在聚乳酸膜上生长 |
| 2.3.9 DAC和TSA处理脐带间充质干细胞 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 分离培养脐带间充质干细胞 |
| 2.4.2 脐带间充质干细胞表面抗原的鉴定 |
| 2.4.3 脐带间充质干细胞多向分化潜能分析 |
| 2.4.4 脐带间充质干细胞诱导为神经元细胞 |
| 2.4.5 脐带间充质干细胞在聚乳酸膜上生长 |
| 2.4.6 DAC和TSA处理对脐带间充质干细胞生长的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂及耗材 |
| 3.2.2 实验器材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 外泌体的分离 |
| 3.3.2 外泌体浓度测定 |
| 3.3.3 外泌体表面抗原鉴定 |
| 3.3.4 外泌体透射电镜检测 |
| 3.3.5 外泌体的粒径分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 外泌体电镜检测结果 |
| 3.4.2 外泌体粒径分析结果 |
| 3.4.3 外泌体蛋白鉴定结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 脐带间充质干细胞及外泌体对肿瘤细胞表型的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞目录 |
| 4.2.2 试剂及耗材 |
| 4.2.3 实验器材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 共培养处理方法 |
| 4.3.2 外泌体添加方法 |
| 4.3.3 细胞增殖检测 |
| 4.3.4 划痕愈合实验 |
| 4.3.5 细胞周期检测 |
| 4.3.6 细胞侵袭实验 |
| 4.3.7 裸鼠成瘤实验 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞增殖影响 |
| 4.4.2 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞迁移的影响 |
| 4.4.3 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞周期的影响 |
| 4.4.4 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞侵袭的影响 |
| 4.4.5 脐带间充质干细胞及其外泌体对小鼠成瘤的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞基因表达谱的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 肿瘤细胞的转录组测序 |
| 5.3.2 肿瘤细胞测序数据分析 |
| 5.3.3 转录组测序结果的验证 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 测序的RNA样品质量控制结果 |
| 5.4.2 测序数据与人基因组比对结果 |
| 5.4.3 RNA-Seq重复样本相关性分析 |
| 5.4.4 基因表达分析 |
| 5.4.5 差异表达基因筛选 |
| 5.4.6 差异表达基因聚类分析 |
| 5.4.7 细胞差异表达基因GO富集分析 |
| 5.4.8 细胞差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 5.4.9 共有差异表达基因分析 |
| 5.4.10 RNA-Seq结果验证 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药抗胃癌基础研究现状与进展 |
| 1 中药有效成分基础研究 |
| 2 单味中药基础研究 |
| 3 复方基础研究 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌相关miRNA研究现状与展望 |
| 1 miRNA在胃癌发生发展中的作用研究 |
| 2 miRNA在胃癌诊断治疗中的作用研究 |
| 3 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 新加良附方及薯蓣皂苷元抑制胃癌细胞功能作用及机制研究 |
| (一) 新加良附方抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (二) 薯蓣皂苷元抑制人胃癌细胞功能实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (三) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| (四) 新加良附方及薯蓣皂苷元调控miR-34a抗胃癌作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 新加良附方及薯蓣皂苷元对裸鼠胃癌移植瘤抑制作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
（7）宁夏密点麻蜥身体不同部位含药大鼠血清对MGC-803人胃癌细胞的干预作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物 |
| (二)实验药物 |
| (三)细胞株 |
| (四)主要试剂 |
| 二、实验方法 |
| (一)主要试剂的配制 |
| (二)含药血清的制备 |
| (三)细胞培养 |
| (四)MTT法检测细胞增殖 |
| (五)Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| (六)流式细胞术检测细胞周期 |
| (七)Western-blot实验测定SIRT1、P53 蛋白表达 |
| 三、统计分析 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 一、课题组研究胃癌的理论基础 |
| 二、宁夏密点麻蜥对SIRT1、P53 通路作用机理的探讨 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（8）基于miRNA介导的信号通路探索化痰散结方抗胃癌的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 个人简历 |
| 附录 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（9）柠檬苦素类似物Odoratol对胃癌的作用及潜在机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 柠檬苦素类似物Odoratol对MKN45细胞体外影响 |
| 1. 材料、仪器与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二部分 体内实验 |
| 1. 材料、仪器与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述1 |
| 参考文献 |
| 文献综述2 |
| 参考文献 |
| 发表论文 |
| 附件 |
| 缩略语表 |
| 致谢 |
（10）二烯丙基三硫醚的体内外生物转化、抗肿瘤活性及逆转顺铂诱发肾毒性的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 大蒜中有机硫化合物的来源和生物活性(综述) |
| 第一章 大蒜中有机硫化物的活性及研究现状 |
| 1.大蒜中有机硫化合物的来源 |
| 2.有机硫化合物的生物活性 |
| 3.上市的蒜类产品现状 |
| 4.大蒜抗癌活性的研究现状 |
| 5.本课题的设计思路 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DATS的体内外生物转化及动力学研究 |
| 前言 |
| 第二章 DATS在大鼠体内的代谢研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 试剂与药品 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 大鼠体内代谢实验 |
| 2.2 血液样本采集 |
| 2.3 尿液样本采集 |
| 2.4 胆汁样本采集 |
| 2.5 组织样本采集 |
| 2.6 大鼠体内样本预处理 |
| 2.7 气相质谱条件 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 单剂量给药 |
| 3.2 多剂量给药后血浆中代谢物 |
| 3.3 多剂量给药后尿液中代谢产物 |
| 3.4 多剂量给药后胆汁中代谢产物检测 |
| 3.5 多剂量给药后大鼠各组织中代谢产物检测 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第三章 DATS在体外的生物转化途径研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 试剂与药品 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 DATS在大鼠血液体系主要代谢产物的确证 |
| 2.2 方法学验证 |
| 2.3 反应条件的选择 |
| 2.4 血细胞稀释比例的优化 |
| 2.5 DATS在大鼠全血、血浆和血细胞中代谢动力学 |
| 2.6 DATS在全血中酶促动力学 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS在大鼠血中各部位代谢产物的确证 |
| 3.2 方法学验证 |
| 3.2.1 检测波长的选择 |
| 3.2.2 专属性 |
| 3.2.3 标准曲线和定量下限 |
| 3.2.4 精密度和准确度 |
| 3.2.5 回收率 |
| 3.2.6 样品处理后室温稳定性 |
| 3.3 DATS的在反应体系中的稳定性研究 |
| 3.4 不同血细胞浓度选择 |
| 3.5 DATS在大鼠全血、血浆以及血细胞中代谢动力学 |
| 3.6 表观动力学 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小节 |
| 参考文献 |
| 第三部分 DATS在胃癌和肺癌中的抗肿瘤活性研究 |
| 第四章 蒜类有机硫化合物在胃癌和肺癌中研究进展 |
| 1.蒜类化合物在胃癌相关疾病中的研究进展 |
| 2.蒜类化合物在肺癌相关疾病中的研究进展 |
| 3.蒜类化合物在联合用药中的应用 |
| 第五章 DATS对胃癌的体内外抗肿瘤活性研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 细胞和动物 |
| 1.3 试剂和药品 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 肿瘤细胞活力测定 |
| 2.2 细胞周期检测实验 |
| 2.3 细胞核DAPI染色实验 |
| 2.4 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.5 裸鼠肿瘤移植实验 |
| 2.6 ELISA测定血清中细胞因子 |
| 2.7 RT-PCR测定脾脏中细胞因子的表达 |
| 2.8 肿瘤组织病理学检查 |
| 2.9 TUNEL法检测肿瘤组织凋亡 |
| 2.10 免疫组化检测肿瘤组织中相关蛋白 |
| 2.11 Western blot检测细胞和肿瘤组织中相关蛋白 |
| 2.12 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS抑制胃癌细胞BGC-823和SGC-7901体外增殖 |
| 3.2 DATS阻滞胃癌细胞周期进程,调节周期相关蛋白的表达 |
| 3.3 DATS诱导胃癌细胞形态学变化和促进凋亡 |
| 3.4 DATS调节胃癌细胞中bcl-2家族蛋白的表达 |
| 3.5 DATS激活caspase级联反应 |
| 3.6 DATS调节MAPK及Nrf2通路 |
| 3.7 DATS抑制胃癌肿瘤组织的生长 |
| 3.8 DATS增强DDP治疗胃癌的效果 |
| 3.9 DATS增强血清中免疫因子的表达 |
| 3.10 DATS增强脾脏中相关免疫因子的表达 |
| 3.11 DATS促进肿瘤组织的凋亡 |
| 3.12 肿瘤中MAPK通路的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第六章 DATS对肺癌的体内外抗肿瘤活性研究 |
| 1.仪器与动物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养和细胞生长抑制试验 |
| 2.2 流式分析细胞周期 |
| 2.3 DAPI染色 |
| 2.4 Annexin V/PI双染检测凋亡 |
| 2.5 肺癌移植瘤模型的建立 |
| 2.6 HE染色和免疫组化分析 |
| 2.7 TUNEL检测组织细胞原位凋亡 |
| 2.8 Western blot分析 |
| 2.9 数据统计 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS抑制NCI-H460细胞的生长且阻滞细胞周期进程 |
| 3.2 DATS诱导NCI-H460细胞凋亡 |
| 3.3 DATS诱导caspase激活,调节Bcl-2家族蛋白的表达 |
| 3.4 DATS具备体内抗肿瘤活性且增强顺铂的抗肿瘤疗效 |
| 3.5 DATS抑制肿瘤生长且诱导肿瘤组织凋亡 |
| 3.6 DATS调节肿瘤组织中粘附相关蛋白的表达 |
| 3.7 DATS减轻顺铂诱发的氧化损伤 |
| 3.8 DATS调节MAPK通路的激活 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 DATS逆转顺铂诱发的肾毒性研究 |
| 前言 |
| 第七章 DATS逆转顺铂诱发的小鼠急性肾损伤 |
| 1.仪器与动物 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 动物 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 小鼠肾损伤模型的建立 |
| 2.2 样本采集 |
| 2.3 肾功能评价指标 |
| 2.4 组织病理检测 |
| 2.5 NF-κB免疫组化染色 |
| 2.6 ELISA检测IFN-γ,TNF-α,IL-1β和IL-6 |
| 2.7 统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 DATS对小鼠体重以及肾比重影响 |
| 3.2 DATS改善顺铂引起的肾功损伤 |
| 3.3 DATS预防肾小管的炎症损伤 |
| 3.4 DATS降低机体炎症因子的表达 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 第八章 DATS代谢产物的确证及其肾保护机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 细胞 |
| 2.实验方法 |
| 2.1. 组织和血液样本预处理 |
| 2.2. GC-MS检测 |
| 2.3. 细胞培养 |
| 2.4. 筛选目标化合物 |
| 2.5. 细胞凋亡 |
| 2.6. ROS测定 |
| 2.7. Western分析Caspase, NFκB和MAPK相关蛋白 |
| 2.8. MAPK特异性抑制剂 |
| 2.9. 数据统计 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 鉴别血液和肾组织中的代谢物 |
| 3.2 AMSO2埔强DDP处理后HK-2细胞的活力 |
| 3.3 AMSO2减轻DDP诱导的HK-2细胞凋亡 |
| 3.4 AMSO2抑制DDP诱导的HK-2细胞caspase级联激活 |
| 3.5 AMSO2抑制DDP诱导的HK-2细胞ROS生成 |
| 3.6 AMSO2抑制DDP诱导的MAPK和NFκB通路激活 |
| 3.7 JNK和ERK在DDP损伤细胞中的作用 |
| 4.讨论 |
| 5.本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、消炎痛对人胃癌上皮细胞BGC-823的作用（论文参考文献）
- [1]南蛇藤提取物通过miR-144/451靶向mTOR抑制胃癌EMT的作用及机制[D]. 李雅娟. 扬州大学, 2021
- [2]基于整合大数据的复方苦参注射液治疗胃癌与食管癌上市后评价研究[D]. 周唯. 北京中医药大学, 2021(02)
- [3]健脾清化化瘀汤对HP相关PLGC大鼠胃黏膜miR-21及其靶基因PTEN表达的影响[D]. 李一桐. 北京中医药大学, 2021(08)
- [4]预知子功效物质分离及其诱导胃癌细胞凋亡的机制研究[D]. 叶仲昊. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响[D]. 薛松磊. 扬州大学, 2021(04)
- [6]新加良附方调控miR-34a/SIRT1/p53及Caspase凋亡通路抑制胃癌的机制研究[D]. 李亚. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]宁夏密点麻蜥身体不同部位含药大鼠血清对MGC-803人胃癌细胞的干预作用及机制研究[D]. 王骄. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [8]基于miRNA介导的信号通路探索化痰散结方抗胃癌的作用及分子机制[D]. 王华. 宁夏医科大学, 2020(08)
- [9]柠檬苦素类似物Odoratol对胃癌的作用及潜在机制研究[D]. 万伯顺. 苏州大学, 2019(04)
- [10]二烯丙基三硫醚的体内外生物转化、抗肿瘤活性及逆转顺铂诱发肾毒性的初步研究[D]. 姜晓燕. 山东大学, 2017(08)